CC BY
35
УДК 616.831 /.832-089 : 611.018.82.018.013
Генеалогія, ідентифікація та клінічне використання
и ^ • •
неирональних стовбурових прогеніторів
Цимбалюк В.І., Медведєв В.В.
Інститут нейрохірургії ім. акад. А. П. Ромоданова АМН України, м.Київ, Україна
На основі аналізу даних літератури розглянуті такі проблемні питання біології та клінічного використання нейрональних стовбурових клітин (НСК), як: їх астроцитарна генеалогія, транс- та дедиференціаційні властивості, локалізація та регенераторна активність в зрілому організмі, участь в генеруванні енграм пам’яті, методичні підходи маркерної ідентифікації, вирощування культури та клінічного використання для лікування патологічних станів, що супроводжуються нейродегенеративними процесами.
Ключові слова: нейрональна стовбурова клітина, потентність прогеніторних клітин., гемопоетична стовбурова клітина (ГСК), диференціація, детермінація, рестрикція, астроцитарні та нейрональні маркери, астроцитарна глія, точкові мутації, еволюція.
Основні визначення та поняття біології стовбурових клітин (CK)
CK мають дві патогномонічні ознаки: здатність до самовідтворення в наступному поколінні та можливість трансмітотичної диференціації. Перша властивість вимагає наявності серед двох дочірніх клітин хоча б однієї з ідентичними материнській цитохімічними, молекулярними та іншими характеристиками й аналогічним рівнем проліфератив-ного потенціалу. Диференціювання нащадків CK відбувається в проміжках між наступними поділами дочірніх клітин за умови супутньої рестрикції їх проліферативного потенціалу та широти спектру диференціації. Потентність прогеніторних клітин виражають чотирма рівнями: тоти-потентність, плюрипотентність, мульти (полі-) потентність та монопотентність. До пулу мультипо-тентних CK (MCK) відносять частково детерміновані, мультипотентні кровотворні прогенітори (загальні попередники лімфо- та мієлопоезу), епідермальні (EnCK) та інтестинальні (ендодермальні EhCK) CK [16, 26, 49]. Важливими ознаками MCK є відносно низька частота поділу та повільний перебіг процесів клітинного циклу. Проте, MCK дають початок високоактивним проліфераторам
— ампліфаєрам прогеніторно-диференціаційного ряду [16].
Mенш інформативною класифікацією CK є виділення серед них так званих ембріональних CK (ECK) та зрілих CK (3CK). До ECK відносять відсепаровані тотипотентні клітини-бластомери на стадії морули або плюрипотентні клітини внутрішньої клітинної маси бластоцисти [16, 44]. Eкcпериментaльнo встановлено, що бластоцити здатні активно експресувати ген Kct4, і підтримують свій плюрипотентий статус за умови стійкої присутності в оточуючому середовищі фактору LIF (Leukemia inhibitory fartor) [16], а за його відсутності культуровані ECK утворюють агрегати, в межах яких диференціюються
до рівня дефінітивних клітинних видів [10, 12]. Деякі автори виділяють підтипи HCK за здатністю до прояву одного з двох типів росту в культурі: нейросферного (за такої ситуації HCK називають NS-IC — Neurosphere-initiating cells) або адгерентного [16, 17, 42]. За підтримання певного рестриктивного спрямування плюрипотентної CK відповідають наступні транскрипційні фактори : Sox2, GATA-2, Tcf4, Kct4, Mash1, LH2 та SCL/tal-1 [12, 16, 42, 44], при цьому потентність CK регулюється за допомогою епігеномних механізмів. Всі MCK містяться в своєрідних тканинних нішах, побудованих з специфічних для даної тканини елементів, і, таким чином, перебувають під дією синтезованих оточенням різноманітних чинників. Описують п’ять видів ніш MCK: епідермальна та фолікулярна — для EnCK, інте-стинальна — для EhCK, кілька нейрональних регенераторних осередків для HCK, кістковомоз-кові ретикулярні мікрооточення гемопоетичних CK (rCK) [16, 45, 50].
Трансдиференціація та дедиференціація CK
Існують факти, що свідчать про наявність трансдиференціаційних переходів між різними типами MCK. Так, два колективи авторів незалежно один від одного встановили наявність нейрогенного диференціювання rCK кісткового мозку in vivo [9, 31]. Іншою дослідною групою доведено, що HCK, введені трансгенним мишам з субле-тальною відсутністю rCK, відтворювали ріст повного спектру нащадків rCK [5, 7]. Встановлено, що HCK має регенераторний потенціал щодо по-перечно-посмугованих м’язів мишей та людини, оскільки мічені ядра нащадків введених HCK виявляли в щойно регенерованих волокнах посмугованих м’язів [18]. Шляхом імплантування частково очищених мічених мезенхімальних стовбурових прогеніторів, отриманих з дерми, в суб-вентрикулярну зону мозку новонароджених ми-
шей, було показано, що під час розвитку тварин вони давали початок астроцитарним елементам, які мігрували в різні ділянки кори та підкіркових структур півкуль головного мозку ^M) та мозочка [24]. Це дає змогу припустити наявність плю-рипотентних та трансдиференційних властивостей як у ICK, так і у HCK [16]. Шсцем наведених змін диференціації MCK, очевидно, є гістоспе-цифічні ніші, клітинний склад який має необхідний для забезпечення відповідної дедиференціації набор факторів росту і спрямовує детермінацію CK в новообраному напрямку. За наявності у зрілому організмі вільно курсуючих тотипотент’-них CK, з огляду на спорідненість між гермінативними CK ^MCK) та соматичними CK (CCK) [50], можна припустити, що CCK, включаючись в генеалогічну лінію TMCK, здатні трансферува-ти надбані епігенетичні та мутаційні зміни в наступні покоління, і в такий спосіб реалізовувати позадарвінівські механізми еволюції.
HCK, отримані з різних ділянок ЦЖ! зародків щурів, розвиваються в нейроцити, характерні для донорської ділянки, і під час культивування експресують специфічні регіонарні маркери. Отже, під час онтогенезу відбувається часткова топічна диференціація HCK [45], проте, повністю дистанційована від рестрикції потентного статусу CK. При цьому не визначено здатність HCK до міграції між окремими генеративними ділянками ЦHC в більш пізні періоди нейроонтогенезу.
Встановлено, що в регуляції часової диференціації HCK основну роль відіграють такі фактори, як FGF (Fibroblast-growth factor), BMP (Bone-morphogenic proteins) та ноггін (noggin). На початку нейроембріогенетичних процесів відбувається блокування ноггіном та його синергістами функціональної активності молекул BMP-сімей-ства, що зумовлює проліферацію нейроектодер-мальних клітин, підвищення чутливості HCK до FGF та диференціювання за нейрональним типом [37]. Із збільшенням концентрації FGF вимикається ноггіновий блок BMP, починається гліогене-тична стадія диференціації активно проліферую-чих HCK, під час якої під дією високої концентрації FGF та BMP в HCK активується експресія рецепторів до EGF (Epidermal-growth factor). Збільшення концентрації EGF в тканинах зумовлює відносне пригнічення чутливості HCK до FGF. На пізніх стадіях ембріонального розвитку всі три фактори — FGF, EGF та BMP підтримують стійку гліальну спрямованість диференціації HCK, що зберігається протягом усього життя [21, 30, 37]. Проте, це не означає, що нейрональний шлях диференціації HCK виключається взагалі.
Нейрогеператорпі системи зрілого організму
Найбільш вивченою нейрогенераторною ділянкою мозку ссавців є субвентрикулярна зона
латеральних шлуночків (SVZ). Cеред клітинних елементів проліферативних острівців SVZ виділяють центрально розташовані проліферуючі нейробласти (A-клітини), слабопроліферуючі великі клітини з астроцитарними маркерами (В-клітини), а також активні ампліфаєрні прогені-тори (C-клітини) [45]. В-клітини здатні випускати між сусідніх епендимоцитів тонкий виросток з набором філаментів, притаманним циліарним відросткам ембріональних нейроепітеліальних клітин, внаслідок чого В-клітини фактично стають елементом вистилки шлуночків. Деякі автори, на основі вивчення експресії епендимоцита-ми антигену KiI, висувають гіпотезу про можливе інтраепендимальне розташування HCK [21, 41]. Інші дослідники показали, що, як у відсепа-рованих епендимальних тканинах, так і в тканинах SVZ під час вирощування культури виявляли активно проліферуючі клітини, проте, лише прогенітори, екстраговані з культур SVZ-дери-ватів, були здатні самооновлювати популяцію, що наводить на думку про субвентрикулярне розташування HCK [17].
Під дією таких факторів росту, як FGF2, комбінацій факторів росту EGF та FGF2, поєднання FGF2 і PGKF культуровані ECK набувають і підримують свій нейрогенний потенціал, тоді як при дефакторизації культурального середовища вони диференціюються в оліго- та астроцити. При введенні в латеральні шлуночки рекомбі-нантного EGF підвищувалась проліферативна активність в SVZ, тоді як кількість клітинних елементів субгранулярної зони (SGZ) зубчастої звивини (GK) практично не змінювалась на фоні видимого зсуву наявних популяцій клітин в бік гліального типу. В той же час, після введення в порожнини шлуночків FGF2 збільшувалась кількість нейрональних елементів в обох регенераторних системах [17]. Встановлено, що BKNF (Brain-derived neurotrophic factor) сприяє збільшенню маси клітин ЦН^ проте, невідомо, за рахунок яких саме елементів [17].
До інших автономних регенераційних систем зрілої нервової системи ссавців відносять проге-ніторні елементи нюхового аналізатора та сітківки ока. HCK мігрують до Bulbus olfactorius (Bk) ростральною міграторною системою (RMS), розміщуючись в останньому шарі ВО, де відбувається їх подальша диференціація в мітральні і перигранулярні нейроцити та елементи спеціалізованої глії. З іншого боку, похідні нюхових плакод теж можна вважати повноцінними HCK, оскільки саме з них розвивається і постійно підтримується популяція нейрорецепторних клітин та гліоцитів, які беруть участь в утворенні fili olfactorial [38].
Встановлено, що ретинальні CK (PCK) ссавців розташовані серед пігментоцитів війкового тіла.
Під час вирощування культури та диференціації РСК утворюються специфічні для гістологічої структури сітківки типи клітин. Комітування ней-рональних прогеніторних клітин під час нейроем-бріогенезу на шлях РСК відбувається, очевидно, за участю гомеобоксного гену СЬх10 [47].
Вважають, що основні прогеніторні елементи регенераторної системи спинного мозку (СМ) локалізуються в епендимальному та (або) субе-пендимальному шарах. Проте, під час експериментального моделювання травматичного ураження СМ активувалися виключно гліогенні репара-тивні процеси [21].
Існує кілька важливих чинників щодо впливу деяких ендогенних речовин на проліфератив-ну активність і нейрогенеративні процеси в БОЕ ОК морського коника [25]. На великому експериментальному матеріалі продемонстровано, що проліферативні процеси в БОЕ ОК прямо пов’язані з запам’ятовуванням інформації специфічної гіпокампальної модальності [19, 20, 36, 43]. Серед генерованих при цьому клітин 25% є нейронального типу, причому більшість з них гинуть на 2 — 9-му тижні після утворення [20]. За ураження кількох структур морського коника можливі розлади чіткості функціонування регенераторної системи ОК. Такий стан може спричинити гіппокампальну форму скроневої епілепсії [17]. Встановлено, що пригнічення регенераторних процесів в ОК є однією з причин виникнення депресивних станів [28].
Астроцитарні маркери НСК та астроци-тарна генеалогія НСК
Багатьма дослідженнями з виключенням активно проліферуючих елементів БУЕ (А- та С-клітин) було показано, що подальша мітотична активність В-клітин зумовлювала відновлення всього клітинного спектру БУ£ З іншого боку, саме клітини, які продукують нейрони нюхового аналізатора та гліальні субвентрикулярні елементи, мають специфічний астроцитарний поверхневий маркер ИСАБ, який бере участь у регуляції експресії гену кислого гліального протеїну (ОЕАР) [11]. Тому вважають, що функцію НСК в цій ділянці ЦНС виконують власне В-клітини [3, 4, 45]. Тривале перебування мічених специфічним імунофлуоресцентним маркером клітин в БУЕ свідчить про їх здатність само-відтворюватися. В-клітини БУЕ мають такі специфічні для ранніх НСК властивості, як експресія нестину та наявність вентрикулярного війкового виростка [3]. Крім того, факти свідчать, що на стадії активної міграції та проліферації ней-робластів роль СК виконують саме радіарні гліо-цити, для яких встановлені фактори специфічності нейроепітеліоцитів, міжмітотична міграція ядер, притаманна раннім нейроепітеліаль-ним стовбуровим прогеніторам [3], доведена
здатність радіарних гліоцитів, отриманих з тканини TM в різні періоди нейрогенезу, відтворювати in vitro різні за структурою колонії нейро-бластів та гліоцитів [27]; візуалізовано безпосередній процес білябазального поділу радіарних гліоцитів з утворенням активно мігруючих вздовж відростка клітин з потенціал-залежною кондук-тивністю та високим вхідним опором, тобто ней-робластів [33]. Отже, можна зробити висновок, що для HCK характерна певна астроцитарна мімікрія [3, 4], проте, невідома глибина її поширення на внутрішньоклітинні молекулярні процеси в HCK. Така властивість HCK може відігравати важливу роль в еволюціонуванні генетичного матеріалу. На стадії передапоптозу в нейронах виникає здатність мутагенної зміни ло-кусів, що в даний момент максимально експре-суються. Отже, тиск негативного фактору збільшує кількість мутаційних варіантів та розширює ймовірнісну вибірку відбору. Оскільки астроцитарна глія виконує функцію презентації антигенів [1] та гомеостазування навколонейрон-ного простору, під час активного ремоделюван-ня тканин, очевидно, вони недосконало виконують власне астроцитарні функції, що зумовлює значне збільшення проапоптозності та концентрації потенційно мутагенних перекисних сполук в цитоплазмі HCK. Тому в умовах постійного безрезультатного генерування нових топологічних характеристик нейрональних сіток зростає ймовірність мутаційної дивергенції позиційних генів, тим більше, що в третини постонтогене-тичних нейронів кори великого мозку ссавців виявлені хромосомні аберації [40].
Методи вивчення та маніпулювання HCK
Першим етапом будь-яких маніпуляцій з HCK є виділення HCK з зрілого TM або зародкових тканин на стадіях бластуляції, гаструляції, нейруляції чи нейрогістогенезу, залежно від поставлених перед конкретним дослідженням задач. Наступним кроком є адекватна дезагрегація та дисоціювання гістологічного матеріалу з перенесенням суспензії клітин в підтримувачі про-ліферативних потенцій CK, які фактично перебувають в стані типового аноікозу. Зараз використовують розчини з різноманітним поєднанням високої концентрації одного або обох відомих факторів росту: FGF2 та EGF. Причому, не менш важливе значення для вирощування адге-зивних культур має підбір адекватного культурального адгеренту.
З метою ідентифікації HCK використовують нейроепітеліальний маркер нестину — білка проміжних філаментів нейрональних прогеніторів. Для визначення нейронального типу утворених диференційованих клітин визначають експресію нейроспецифічних антигенів MAP2a, MAP2b, MAP2c, гену бета-тубуліну третього типу (TuJ1),
наявність цитоплазматичного білка tau та ней-рофіламентів L, M і H; експресію PHK—зв’язуючого білка Hu, нуклеарного маркера більш зрілих нейронів NeuN, функціональних маркерів детермінованих субтипів нейроцитів (KARPP32
— нейрони смугастого тіла, кальбіндин — внутрішні гранулярні клітини CA3-пoля морського коника, CAK67 — GABA-ергічні нейрони, TH — дофамінергічні нейрони) [15, 17]. Для ідентифікації гліального ряду використовують іму-ногістохімічне визначення протеїнів GFAP (аст-роцитарний маркер) та GalC, к4, р75 (маркери олігодендроцитів). Cпецифiчнoю для епендималь-них клітин вважають експресію теплостійкого антигену HSA (Heat-stable antigen) та (або) антигену Kil [21, 41]. Maркерaми периферичних нейронів може бути білок периферии [32]. Водночас виникає потреба у використанні методів верифікації TCK — поверхневі антигени CK34, CK90.2, CK117, CK135; здатність зв’язувати PNA (Peanut agglutinin). Eндoтелiaльним вважають маркер CK31, для міогенних CK характерна рання експресія генів а-актиніну-2 та важкого ланцюга молекули міозину (MyHC — myosin heavy chain) [41]. Взагалі, поки що в методичному арсеналі ідентифікаційних методів переважають непрямі підходи. Наявність в культурі HCK визначають за допомогою диференціації антиген-однорідного складу клітин на певні субтипи, притаманного потентності CK, диферону. Для цього можливе імплантування суспензій клітин, мічених за допомогою ретровірусів з інкорпорованим бета-га-лактозидазним опероном, у відповідний регіон піддослідного організму того самого виду. З метою візуалізації активнопроліферуючих клітин використовують як трансфекційні ретровірусні методи, так і реплікативну інкорпорацію ядрами мітотично-активних клітин мічених попередників нуклеїнових основ — тимідину та бромо-дезоксиуридину (BrdU) [39].
Нейрохірургічні аспекти використання HCK
Беручи до уваги нові дані про функціонування системи HCK в зрілому організмі, активно вивчаються та розробляються методи впливу на HCK при неврологічних чи нейрохірургічних захворюваннях [48] та імплантації HCK в пошкоджені ділянки нервової системи [6, 44]. В організм людини HCK вводять як системно, так і локально, з огляду на можливості трансдиференціації між окремими представниками CK Для вирощування культури та отримання необхідних CK з певною по-тентністю можна використовувати не лише ембріональний (клонований) аутогенний матеріал, а й отримані пункційним методам власні CK, не обов’язково нейронального типу. Це створює можливість анонкогенної трансформації культивованих HCK і напівдиференційованих клітин, а також генерування допоміжних клітин-вказівників
спрямованого росту закінчень імплантованих нейроцитів. При цьому можливе використання нейтральних щодо зрілих нейроцитів синтетичних імплантаційних атракторів росту, здатних поступово утилізуватися гліальними елементами нервової тканини, а також моделювання навколо введених НСК анонкогенного тимчасового псевдоем-бріонального оточення.
Ще з початку 80-х років XX ст. ведуться активні дослідження трансплантаційних методів лікування хвороби Паркінсона. Останнім часом отримані дані про тривале функціонування імплантованих клітин, проте, це не забезпечує поліпшення стану всіх оперованих пацієнтів [6, 13, 34]. Це особливо активно стимулює впровадження в клінічну практику рекомбінованих аутохтонних НСК з персистуючим високим синтезом дофаміну та забезпечення постімплан-таційного розвитку внутрішньомозкових зв’язків між елементами екстрапірамідної системи, притаманних неураженому ГМ [6, 17,
35, 45].
Менш розроблені питання імплантації НСК при інших патологічних станах нервової системи, що супроводжуються дефіцитом нейрональних елементів: хворобі Альцгеймера [17, 45], хореї Гентингтона (ХГ) [22], розсіяному склерозі [45], скроневій епілепсії [14, 46], ішемічному інсульті [8, 23]). Так, при ХГ вважають за необхідне імплантацію СК в ділянки пошкоджених ядер стріопалідарної системи, чорної субстанції, зубчастого та субталамічного ядер, а також в певні шари премоторної кори [2, 6]. Активно вивчаються можливості застосування НСК при різних видах травматичного пошкодження ГМ та СМ. Так, імплантування ЕСК в зону травматичного ураження СМ піддослідних тварин сприяло поліпшенню процесів росту регенеруючих аксонів і створювало умови для функціонального відновлення втрачених нейро-моторних та провідникових функцій [29]. Часткове функціональне відновлення спостерігали і після трансплантації НСК в ділянки СМ щурів з вибірковим дифузним ураженням мотонейронного пулу [12]. Трансплантація нейрональних прогеніторів, отриманих з плюрипотентних клітин ембріональної карциноми, в мозок щурів, у яких змоделювали церебральну ішемічну атаку чи травматичне ураження ГМ, сприяла зменшенню моторного та когнітивного дефіциту у тварин [8]. При демієлі-нізуючих захворюваннях рекомендують використання гліальних потенцій НСК [10] з паралельною активацією власного гліогенезу шляхом локального чи системного введення гліогенних факторів росту [48].
Отже, необхідні подальше вивчення, експериментальна розробка та клінічне впровадження методів нейрохірургічного лікування різних захворювань НС з використанням НСК.
^исок літератури
1. Гуденко В.А., Maркoвa О. В. Иммунные свойства клеток головного мозга // Иммунная система головного мозга /Под. ред. Н.И.Лисяного. — K.: ВИПОЛ, 1999. — C.32-49.
2. Цимбалюк В. І., Mедведєв В. В. Moлекулярнi та
філогенетичні аспекти патогенезу захворювання Гентингтона // Укр. нейрохірург. журн. — 2002., №4.— C. 11-16.
3. Alvarez-Buylla A., Garcia-Verdugo J.M. Tramontin A. K. A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells // Nat. Rev. Neurosci. — 2001. — V.2, N4. — P.287-293.
4. Barres B. A. A new role for glia — generation of neurons
// Cell. — 1999. — V.97., N6. — P.667-670.
5. Bjornson C. R. R., Rietze R. L., Reynolds B. A. et al.
Turning brain into blood : a hematopoietic fate adapted by adult stem cells in vivo // Science. — 1999. — V.283, N5401. — P.534-566.
6. Bjorklund A., Lidvall к. Cell replacement therapies for central nervous system disorders // Nat.Neurosci. — 2000. — V.3. — P.537-544.
7. Bjorklund A., Svedsen C. Breaking the brain-blood barrier // Nature. — 1999. — V.397, N6720. — P.569-570.
8. Borlongan C. V., Tajima Y., Trojanowski J. Q. et al. Cerebral ischemia and CNS transplantation : differential effects of grafted fetal rat striatal cells and human neurons derived from a clonal cell line // NeuroReport. — 1998. — V.9. — P.3703-3709.
9. Brazelton T. R., Rossi F. M. V., Keshet G. I. From
marrow to brain : expression of neuron al phenotypes in adult mice // Science. — 2000. — V.290, N5497. — P.1775-1779.
10. Brustle к. et al. Embrionic stem cell-derived glial precursors : a source of myelinating transplants / / Science. — 1999. — V.285. — P.754-756.
11. Koetsch F., Caille I., Lim K. A. et al A subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain // Cell. — 1999. — V.97, N6. — P.1-20.
12. Konovan P. Gearhart J. The end of begining for pluri potent stem cells // Nature. — 2001. — V.414.
— P.92-97.
13. Kunnett S. B., Bjorklund A., Linvall к. Cell therapy in Parkinson’s disease — stop or go ? // Nat. Rev. Neurosci. — 2001. — V.2. — P.365-369.
14. Ferencz I. et al. Suppression of kindling epileptogenesis in rats by intrahi ppocampal holinergic grafts // Europ. J. Neurosci. — 1998. — V.10. — P.213-220.
15. Fricker R. A., Carpenter M. K., Winkler C. et al. Site-specific migration and neuronal differentiation of human neural progenitor cells after transplantation in the adult rat brain // J. Neurosci.
— 1999. — V.19. — P.5990-6005.
16. Fuchs E., Segre J. A. Stem cells: a new lease on life // Cell. — 2000. — V.100, N1. — P.143-155.
17. Gage F. H. Mammalian neural stem cells // Science.
— 2000. — V.287, N5451. — P.1433-1438.
18. Galli R., Bordello U., Gitti A. et al Skeletal myogenic potential of human and mouse neural stem cells // Nat. Neurosci. — 2002. — V.3, N10. — P.986-991.
19. Gould E., Beylin A., Tanapat P. et al Learning enhances adult neurogenesis in the hippocampal formation // Nat. Neurosci. — 1999. — V.2, N3. — P.260-265.
20. Gould E., Vail N., Wagers M. et al. Adult generated
hippocampal and neocortical neurons in macaques have a transient existence // PNAS USA. — 2001.
— V.98, N19. — P.10910-10917.
21. Johansson C. B., Momma S., Clake K. L. et al. Identification of neural stem cell in the adult mammalian central nervous system // Cell. — 1999.
— V.96, N1. — P.25-34.
22. Kendall A L Functional integration of striatal allografts in a primate model of Huntington’s disease // Nat. Med. — 1998. — V.4. — P.727-729.
23. Kondziolka K., Wechsler L., Goldstein S. et al. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke // Neurology. — 2000. — V.55, N4. — P.565-569.
24. Kopen G. C., Prockop K.I., Phinney K.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum and they differentiate into astrocytes after injection in neonatal mouse brains // PNAS USA. — 1999. — V.97, N20. — P.10711-10716.
25. Kuhn H. G., Kickinson-Anson H., Cage F. H. et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation // J. Neurosci. — 1996. — V.16., N6.
— P.2027-2033.
26. Lovell-Badge R. The future for stem cell research / / Nature. — 2001. — V.414, N6859. — P.88-91.
27. Malatesta P., Hartfuss E., Gotz M. Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage // Development. — 2000.
— V.127, N24. — P.5253-5263.
28. Malberg J. E., Eisch A. I., Nestler E. I. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus // J. Neurosci. — 2000. — V.20, N24. — P.9104-9110.
29. McDonald J. W., Liu X Z, Qu Y. et al Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord // Nat. Med. — 1999. — V.5, N12. — P.1410-1412.
30. Mehler M. F., Mabie P. C., Zhu G. et al. Kevelopmental changes in progenitor cell responsiveness to bone morphogenetic proteins differentially modulate progressive CNS linage fate // Kev. Neurosci. — 2000. — V.22. — P.74-85.
31. Mezey E., Chandross K. I., Harta G. et al. Turning blood into brain : cells bearning neuronal antigens generated in vivo from bone marrow // Science.
— 2000. — V.290, N5497. — P.1779-1782.
32. Morrison S. J., White P. M., Zock C. et al Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal cf multi potent mammalian neural crest stem cells // Cell. — 1999. — V.96. — P.737-749.
33. Noctor S. C., Flint A. C., Weissmann T. A. et al. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex // Nature. — 2001. — V.409, N6821. — P.714-720.
34. Piccini P., Brooks K. I., Bjorklund A. et al. Kopamine release from nigral transplants visualised in vivo in a Parkinson’s patient // Nat. Neurosci. — 1999. — V.2, N12. — P.1137-1140.
35. Potter E.K., Ling Z.K.,Carvey P.M. Cytokine-induced conversion of mesencephalic-derived progenitor cells into dopamine neurons // Cell. Tissue Res. — 1999. — V.296. — P.235-246.
36. Praag H., Kempermann G., Cage F.H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus // Nat. Neurosci. — 1999. — V.2, N3. — P.266-270.
37. Quian X, Shen Q., Goderie S. K. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and
glial cell production from isolated murine cortical stem cell // Neuron. — 2000. — V.28, N1. — P.69-80.
38. Raisman G. olfactory ensheathing cells — another miracle cure for spinal cord injury ? // Nat. Rev. Neurosci. — 2001. — V.2, N5. — P.369-374.
39. Rakic R. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence // Nature Rev. Neurosci. — 2002. — V.3, N1. — P.65-71.
40. Rehen S. C., McConnell M. I., Kaushal K. et al. Chromosomal variation in neurons of the developing and adult mammalian nervous system // PNAS USA. — 2001. — V.98, N23. — P.13361-13366.
41. Reitze R. L., Valcanis H., Brooker G. F. et al. Purification of pluri potent neuronal stem cell from the adult mouse brain // Nature. — 2001. — V.412.
— P.736-739.
42. Scheffler B., Horn M., Blumcke I. et al. Marrow-mindedness : a perspective on neuropoiesis // TINS. — 1999. — V.22, N8. — P.348-357.
43. Shors T. J., Miesegaes G., Beylin A. et al. Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories // Nature. — 2001.
— V.410, N6826. — P.372-375.
44. Svedsen C.N., Smith A.G. New prospects for human stem-cell therapy in the nervous system // TNIS.
— 1999. — V.22, N8. — P.357-364.
45. Temple S. The development of neural stem cells / / Nature. — 2001. — V.414, N6859. — P.112-117.
46. Thompson K., Anantharam V., Behrstock S. et al Conditionally immortalized cell lines, engineered to produce and release GABA, modulate the development of behavioral seizures // Exp. Neurol.
— 2000. — V.161. — P.481-489.
47. Tropepe V., Coles B. L. K., Chiasson B. J. et al. Retinal stem cells in the adult mammalian eye // Science.
— 2000. — V.287, N5460. — P.2032-2036.
48. Wagner J.P., Black I., KiCicco-Bloom E Stimulation of neonatal and adult brain neurogenesis by subcutaneous
injection of basic Fibroblast growth factor // J. Neurosci.
— 1999. — V.19, N14. — P.6006-6016.
49. Watt F.M., Hogan B. L.H. out of Eden: stem cells and their niches // Science. — 2000. — V.287, N5457.
— P.1427-1430.
50. Weissman I. L. Stem cells : units of regeneration, and units in evolution // Cell. — 2000. — V.100, N1. — P.157-168.
Генеалогия, идентификация и клиническое применение нейрональных стволовых прогениторов Цымбалюк B. И., Медведев B. B.
На основании анализа данных литературы рассмотрены такие проблемные вопросы биологии и клинического применения нейрональных стволовых клеток, как: астроци-тарная генеалогия, транс- и дедифференциационные свойства, локализация и регенераторная активность во взрослом организме, участие в генерировании енграмм памяти, методические подходы маркерной идентификации, выращивания культуры и клинического использования в лечении патологических состояний, сопровождающихся нейро-дегенеративными процессами.
Genealogy, identification and clinical application of neuronal stem progenitors Tsymbalyuk V. I., Medvedev V. V.
on the grounds of publication data, analysis there was carried out the of such problems of the biology and the clinical application of neuronal stem cells, as : astrocytic of its genealogy, trans- and dedifferentiative properties, localization and regenerative activity in adult organism, participation in generation of memory engramms, identification and cultivation, clinical using in the treatment of pathological states, accompanied by neurodegenerative processes.
Комментарий
к статье Цымбалюка В.И., Медведева В.В. “Генеалогия, идентификация и клиническое применение нейрональных стволовых прогениторов"
Статья является детальным и глубоким обзором значительного массива современных научных данных, посвященных изучению свойств нервных стволовых клеток (СК) и перспективам их использования в медицине. Дано определение СК, приведены их различные классификации, описаны свойства и специфические маркеры, характерные для нервных клеток и их предшественниц.
Информация о том, что нервные СК можно выделить из головного мозга взрослых млекопитающих и их способности дедифференцироваться и трансдифференцироваться в клетки других тканей организма (клетки крови, миоциты) является достаточно новой и актуальной.
Значительное внимание уделено факторам роста и индукторам нейродифференцировки нервных СК, способам их выделения и культивирования вне организма, происхождению и судьбе клеток в различных отделах ЦНС. Эта информация имеет большое значение для разработки оптимальных методов культивирования и дифференцировки СК.
В последнем разделе перечислены возможные источники нервных СК для лечения нейродегенеративных заболеваний, приведены данные некоторых доклинических испытаний, выполненных на крысах. Среди прочих авторы упоминают в качестве возможного источника и клетки костного мозга. Использование этих клеток в качестве нового источника СК может, кроме онкологических, решить также иммунологические и этические проблемы, которые возникают при использовании СК, трансформированных клеточных линий и фетальных клеток.
Статья является ценным источником новой современной информации о нервных СК для биологов.
Е.А.Щегельская канд. бuoл. наук, ст. науч. comp. Инcmumyma npo6neM кpuoбuoлoгuu u Kpuoweduu,uHbi HAH Укpauны
КОММЕНТАРИЙ
к статье Цымбалюка В.И., Медведева В.В. “Генеалогия, идентификация и клиническое использование нейрональных стволовых прогениторов"
Представленный к публикации обзор несомненно интересен не только нейрохирургам, но и неврологам и нейробиологам. В обзоре сделана достаточно удачная попытка осмыслить и систематизировать большой, можно сказать, лавинообразный поток научной и клинической информации о стволовых клетках (СК). Особенно широко и активно ведутся в мире исследования в области нервных СК, что обусловлено получением в последние 10 лет ряда фактов, которые позволили взглянуть на ЦНС, головной мозг с несколько иных позиций и наметить пока что теоретически пути принципиально новых технологий лечения многих нервных заболеваний. Так, к концу XX в. в биологии были разрушены два, казалось бы, незыблемых фундаментальных положения (догмы), которые просуществовали более 100 лет. Первое положение, связанное с представлением о том, что нейроны во взрослом организме не регенерируют, было оспорено тем фактом, что у грызунов и у людей в течение жизни в субвентрикулярной зоне рождаются новые нейроны (Eriksson и соавт., 1998; Goge, 2000; J.R.Lancher Ramos и соавт., 2002).
Вторая, подвергнутая пересмотру концепция, связана с представлением о филогенетическом ограничении диф-ференцировки клеток различных органов, а именно, что клетки определенных органов (печени, мышц, костного мозга) не могут изменить свое предназначение и превратиться в другой фенотип. В исследованиях последних 10 лет было показано, что тканеспецифические СК способны давать рост клеткам в норме, не характерным для данного органа или ткани. Например, из нервных СК можно получить линию гемопоетических клеток (C.R.Bjornson и соавт., 1999) и, наоборот, из стромы костного мозга могут образоваться клетки скелетной мускулатуры (Wakitani и соавт., 1995), миокарда (Mokino и соавт., 1999), овальные гематоциты (Referson и соавт., 1999), a также клетки нейронов и глии ( J.R.Sanchez-Ramos, 2002), то есть возможна трансдифференцировка, “перепрограммирование” одного гистологического типа клеток в другой. В связи с этим возникают теоретические и практические перспективы лечения многих болезней, возможность получать нервные СК не только из фетальных или эмбриональных тканей, но и из собственного костного мозга больного, что позволяет избежать не только многих этических проблем, но и возникновения иммунных реакций отторжения.
В представленном обзоре обсуждаются вопросы о СК головного мозга взрослого, показано, что сегодня существует, как минимум, 4 области мозга, где локализованы нервные СК: субвентрикулярная зона боковых желудочков, зубчатая извилина гипокампа, луковица обонятельного анализатора и субэпендимарный слой спинного мозга. Возможно, в дальнейшем будут определены и другие области мозга, где могут располагаться и дифференцироваться СК. В связи с установлением наличия СК в головном мозге взрослого организма возникает целый ряд новых вопросов. Наиболее важные из них, на мой взгляд, это как ими управлять, как их стимулировать или подавлять, как они изменяют активность и состав в организме при различных болезнях и в старости, как заставить их пролиферировать и мигрировать в очаг повреждения мозга для устранения неврологического дефицита или восстановления нейросекреторной активности и т.д.
Второе научное направление, связанное со взрослой нервной СК, условно можно назвать “болезни нервной СК”, а именно изучение их гипофункции или гиперактивации, что может иметь отношение к таким фундаментальным проблемам, как первичные опухоли мозга, например, глиобластома или медуллобластома, которые могут развиваться из этих СК вследствие нарушения их диффе-ренцировки. Кроме того, возможно, что при нарушении целостности СК возникает, как отмечено в обзоре, гиппокампальная височная эпилепсия.
Быстрое старение и атрофия мозга, его слабая пластично-компенсаторная активность, возможно, также связаны с изменением функции (гипофункция) СК и существующее представление, что ежечасно в мозгу гибнут миллионы нервных клеток и на их месте синтезируются новые клетки, как раз и оправдано и связано с активностью СК.
Следовательно, изучение «болезней СК» как самостоятельное научное направление представляет определенный интерес в плане дальнейших экспериментальных и клинических нейробиологических исследований. Важной проблемой, также поднятой в этом обзоре, является вопрос о дифференцировке СК в специализированные нервные клетки, особенно в нейроны с заданными свойствами и строением. Это наиболее трудная и пока что недостаточно изученная проблема. Принципиально уже установлены условия дифференцировки in vitro, что связано с необходимостью присутствия в питательной среде специальных факторов, а также специальных условий разделения клетки. Оказалось, что нервные СК плохо и медленно дифференцируются в сторону нейронов и легко и быстро — в направлении астроглии и что между этими двумя типами (предшественников глии и нейронов) существует антагонизм, и глиальные элементы опережают и подавляют дифференцировку в направлении нейронов. Поэтому актуальной задачей является подавление глиального пути для дифференцировки или разделения этих клеток на фракции после введения больным уже обогащенной субпопуляции клеток.
Вопрос дифференциации экзогенных трансплантированных СК in vivo изучен еще меньше, существуют два альтернативных взгляда. Так, считают, что трансплантируемые СК хорошо приживаются лишь там, где имеется соответствующее микроокружение, т.е. в зонах, где имеются собственные СК, а в других местах они лишь переживают. Другие же исследователи указывают, что СК способны приживаться в разных отделах мозга, независимо от места их естественной локализации.
В последнем разделе обзора обсуждается проблема клинического использования СК в нейрохирургии, приведены данные как клинических, так и экспериментальных исследований последних лет. Отмечено, что успех нейротрансплантации зависит от целого ряда факторов, начиная от вида и происхождения СК и заканчивая особенностями нейрохирургической патологии. По-видимому, для каждого вида патологии необходимо разрабатывать свои условия и сроки трансплантации. В этом плане интересны исследования группы авторов по трансплантации СК при повреждении спинного мозга, которые ввели в нейротрансплантологию термин «терапевтического окна» (Nakamura и соавт., 2002). Так, в первые 7 сут после травмы, при нали-
чии интенсивной воспалительной реакции в зоне ушиба, клетки отторгаются и не приживаются, также и позже чем через 14 дней, когда образуется глиальный рубец и происходит организация раны и образование кисты, трансплантированные клетки не приживаются. “Терапевтическое окно” — это всего лишь краткий промежуток времени между уменьшением выраженности воспалительной реакции и началом регенерации соединительной и глиальной ткани. По-видимому, эти данные могут быть одним из объяснений неудачных клинических и экспериментальных попыток применения как СК, так и в целом эмбриональных тканей в лечении острых и особенно длительных хронических заболеваний. По-видимому, исходя из существования узкого “терапевтического окна”, трансплантация СК более перспективна при острой нейрохирургической, сосудистой, травматической или опухолевой патологии или циклическом, ремиттирующем течении хронических заболеваний — энцефаломиелите, рассеянном склерозе и др., хотя это не более чем предположение, которое нуждается в проверке.
Касаясь клинического применения стволовых и эмбриональных клеток, хочется обратить внимание и на другие важные причины несоответствия между теоретическими представлениями, данными экспериментальных исследований и практическими результатами использования нейротрансплантации. Полагают, что эмбриональные клетки мозга, полученные от эмбрионов в возрасте 8—12 нед, на 70—80% состоят из стволовых и прогениторных клеток на ранних этапах дифференцировки (Г.М.Сухих и соавт., 1988). Их широкое клиническое применение при различных заболеваниях ЦНС (см., например, материалы последнего конгресса невропатологов, 2002) путем внутримышечного, внутривенного введения не дало ожидаемого результата. Несколько лучшие результаты отмечены при внутримозговом введении эмбриональных клеток (В.И.Цымбалюк и соавт., 1996,1999,2002), но полного длительного восстановления неврологических, особенно двигательных функций достичь трудно. Возникает вопрос, в чем же причина недостаточно высокой эффективности нейротрансплантации? Помимо описанных выше, их может быть еще несколько, среди них хочется выделить следующие.
1. Иммунные причины. Считают, что стволовые и эмбриональные клетки не имеют антигенов гистосовместимости, а в мозге медленно происходит реакция отторжения. Это вопросы спорные, поскольку в процессе дифференцировки на нервных клетках, особенно на астроцитах представлены антигены НЬД-! класса и по мере их дифференцировки начинают действовать иммунные реакции отторжения клеток, которые и определяют их судьбу.
Отторжение аллотрансплантатов в мозге убедительно было показано в эксперименте еще 60 лет назад, поэтому в ряде зарубежных исследований, например, при лечении болезни Паркинсона пересаживали эмбриональную ткань в условиях иммуносупрессивной терапии, однако это не позволило достичь длительного клинического эффекта. Помимо этого, нужно учитывать, что у боль-
ных имеется высокая нейросенсибилизация, иммунная система реагирует на антигены мозга и поэтому даже трансплантация НЬД-совместимых тканей, например из костного мозга, может быть неудачной из-за возникновения аутоиммунных реакций организма. Необходимо проведение глубоких нейроиммунных исследований, направленных на преодоление этих реакций.
2. Фактор микроокружения. СК локализованы не диффузно, а в определенных участках мозга, где имеется, по-видимому, соответствующее микроокружение, нейротро-фические факторы, поддерживающие их пролиферацию и начальную дифференцировку (не установлено, какие клеточные структуры мозга эти факторы секретируют). Можно предположить, что в ткани мозга и в других специализированных органах эти факторы отсутствуют в достаточном количестве или имеются специфические ингибиторы, подавляющие дифференцировку и пролиферацию СК подобно тому, как нервные клетки, а именно нейроны, способны индуцировать апоптоз в лимфоцитах за счет Рав-лиганда (Ю.А.Зозуля, Н.И.Лисяный, 2000). Вероятно, присутствуют оба механизма (отсутствие факторов и наличие ингибирующих клеточно-гуморальных факторов), которые тормозят регенераторные потенции СК. Эти факторы микроокружения действуют в основном на нервные СК и их предшественников, тогда как глиальные, в том числе микроглиальные, находятся под менее жестким контролем, поэтому они чаще пролиферируют, участвуют в образовании глиальных рубцов в зоне повреждения. В мозге возникают в основном опухоли глиального ряда (астроцитома, глиобластома), которые развиваются из глиальных предшественников, тогда как чисто нейрональные опухоли крайне редки. Возможно, эти механизмы «торможения роста СК» тормозят рост опухолей, происходящих из нейронов.
3. Механические факторы. Не исключено, что низкий эффект нейротрансплантации обусловлен тем, что функционированию СК препятствуют другие клетки, а именно клетки глии и соединительной ткани, которые образуют и покрывают нейроны и мешают интегрироваться с соответствующими нейронами и их нервными окончаниями. Кроме того, для полноценной дифференцировки и функционирования клеток необходимо прорастание в нейротрансплантат сосудов, нормальное капиллярное кровообращение, для этого нужны факторы роста сосудов, иначе тканевая гипоксия может погубить трансплантат.
Число факторов, влияющих на судьбы нейротрансплантата, по-видимому, значительно больше, чем можно предположить, и это неудивительно, поскольку внедрение принципиально новой технологии лечения требует постоянного решения новых задач.
В заключение необходимо отметить, что авторами проведена большая работа по составлению обзора, который значительно расширяет наши представления о природе и дифференцировке СК, их клиническом применении, необходимо дальнейшее изучение как природы, так и эффективности клинического применения СК.
Н.И.Лисяный доктор мед. наук, профессор, завотделом нейроиммунологии Института нейрохирургии им.акад.А.П.Ромоданова АМН Украины
