CC BY
265
Барановская И.Б., Онищук С.А.*
КМЛДО МУЗ городская больница №2, г. Краснодар *Кубанский государственный университет, г. Краснодар
ГЕМОГЛОБИН РЕТИКУЛОЦИТОВ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ АНЕМИЙ
В статье рассматривается значение содержания гемоглобина ретикулоцитов в дифференциальной диагностике железодефицитных анемий, анемий хронических заболеваний и их сочетаний. Строится математическая модель, дающая наглядное представление о связи сывороточного железа и латентной связывающей способности сыворотки крови с содержанием гемоглобина ретикулоцитов.
Диагностическая значимость отдельных показателей метаболизма железа при большинстве воспалительных состояний резко снижается и не позволяет выявить действительную причину нарушения обмена железа. Выявление дефицита железа особенно затруднено на фоне острой воспалительной реакции. Анемию хронических заболеваний (АХЗ) и сочетание АХЗ и железодефицитной анемии (ЖДА) трудно различить только по уровню сывороточных маркеров. Общепризнано, что изменение таких эритроцитар-ных индексов, как средний объем эритроцитов (М^), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) и ширина распределения эритроцитов по объему (RDW), сравнительно долгосрочно, так как длительность жизни эритроцитов в периферической крови около 120 дней.
При дефиците железа, обусловленном истощением запасов железа или его недоступностью при достаточном резерве железа, костный мозг образует гипохромные эритроциты. Предшественники эритроцитов - ре-тикулоциты тоже являются гипохромными. Превращаясь в эритроциты за 1-2,5 дня, ре-тикулоциты содержат то количество гемоглобина, которое синтезировалось в них за последние 60 часов. Таким образом, содержание гемоглобина в ретикулоцитах адекватно отражает состояние эритропоэза, практически в «режиме реального времени».
В зарубежной литературе много публикаций, посвященных значению ретикулоцитар-ных индексов в диагностике и мониторинге анемий разного генеза, доказывающих взаимосвязь отдельных ретикулоцитарных параметров с биохимическими маркерами обмена железа [1, 2, 3].В нашей стране подобные исследования носят единичный характер [4].
Цель работы: оценка диагностической значимости гемоглобина ретикулоцитов при дифференциальной диагностике анемий и выявление взаимосвязи данного ретикуло-цитарного параметра с показателями обмена железа с целью построения математической модели.
Материалы и методы: Исследование проводилось на базе Краснодарского многопрофильного лечебно-диагностического объединения МУЗ городской больницы №2. Проанализированы результаты лабораторных исследований 101 пациента с анемическим синдромом в возрасте 28-77 лет (46 мужчин - средний возраст 58,1 ± 18,1 год и 55 женщин - средний возраст 45,01 ± 15,6 лет). Контрольную группу составили 77 практически здоровых лиц, в основном работников медицинского объединения (34 мужчины и 42 женщины) возрастом 44,0 ± 16 лет без признаков анемии и нормальными значениями метаболизма железа (референтные значения используемых методов).
Материалом исследования являлись образцы венозной крови, которую брали из локтевой вены пациентов в утренние часы натощак.
Гемограммы анализировались на анализаторе Sysmex-2100 XE (Sysmex Corporation, Japan). Исследовались классические показатели гемограммы: RBC (эритроциты), HGB (гемоглобин), HCT (гематокрит), MCV (средний объем эритроцита), MCH (среднее содержание гемоглобина в эритроцитах), RDW (широта распределения эритроцитов по объему). На основании принципа проточной цитофлюорометрии в ретикулоцитарном канале гематологического анализатора дифференцировались флюоресцирующие ретикулоциты от нефлюо-
ресцирующих (негативных) эритроцитов. Прибор строил гистограммы распределения ретикулоцитарных клеток по размерам и определял их средние значения в виде RET-У(безразмерная величина). Мы использовали данные Tomas Ch. и Tomas L., согласно которым, используя регрессионную формулу (у = 5,569 • exp0 001x), можно трансформировать значения Ret-Y в его гемоглобино-вый эквивалент, выражаемый в пикограммах и обозначаемый как Ret-He [5]. Референтные значения параметра Ret-He, по данным отечественных авторов, составляют 28,2-36,4 пг [6].
Биохимические показатели обмена железа определялись с использованием биохимического анализатора Cobas Integra швейцарской фирмы Roche. Метаболизм железа оценивался по следующим параметрам: сывороточный ферритин (СФ), сывороточное железо (СЖ), латентная связывающая способность железа (ЛССЖ). По результатам исследования гемограмм, маркеров обмена железа и данных анамнеза больных разделили на 2 группы: пациенты с ЖДА и пациенты с АХЗ.
Для построения математической модели взаимосвязи гемоглобина ретикулоцитов с параметрами обмена железа мы использовали две функции, полученные экспериментальным путем с использованием метода наименьших квадратов.
Влияние концентрации ЛССЖ на содержание Ret-He выражается следующим уравнением: R = Ro(1 -e-ь°(Со-ЛССЖ)), где Rg - показатель Ret-He при нулевом уровне ЛССЖ, b0 -концентрационный параметр, ответственный за кривизну зависимости, а С0 - предположительный предел ЛССЖ, при котором Ret-He равен нулю. Были установлены численные значения параметров функции: Rg = 33 пг, b0 = 0, 04 л/мкмоль, С0 = 95 мкмоль/л.
Зависимость Ret-He от СЖ хорошо аппроксимируется функцией вида R = R0(1 - e-Ь°СЖ), где R0 - показатель Ret-He при СЖ, стремящемся к бесконечности, b0 - параметр, ответственный за кривизну экспоненты. Численные значения показателей: R0 = 33 пг, b0 = 0, 23 л/мкмоль.
Статистическая обработка данных включала определение общепринятых средних арифметических величин (M), среднего квадратичного отклонения (SD), коэффициента корреляции (r) значения критерия Стьюден-та (p) с помощью стандартных средств компьютерной программы Microsoft Excel. Различия между параметрами считали значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение:
В таблице (табл. 1) представлены сводные данные по 3 исследуемым группам: контрольная группа, пациенты с ЖДА и пациенты с АХЗ. Различия между анализируемыми параметрами оказались статистически значимыми для всех трех групп (р < 0,05), за исключением RBC между ЖДА и АХЗ (р > 0,05). Показатели гемограммы группы здоровых людей следующие: RBC 4,7 ± 0,47 -10 12 /л, HGB 139,0 ± 13,4 г/л, HCT 39,3 ± 3,7%, MCV 84,5 ± 3,9 фл, MCH 29,7 ± 1,3 пг, RDW 13,2 ±
0,7%. Параметры обмена железа в этой же группе составили: СЖ 15,6 ± 4,3 мкмоль/л, СФ 46,2 ± 20,5 нг/мл, ЛССЖ 42,4 ± 15,2 мкмоль/л. Таким образом, мы показали, что исследуемые показатели гемограммы и метаболизма железа у группы здоровых людей находятся в референтных пределах.
Клинический анализ крови пациентов с ЖДА: RBC 3,8 ± 0,61 -10 12 /л, HGB 77,4 ± 21 г/л, HCT 25,5 ± 5,5%, MCV 65,0± 9,3 фл, MCH 19,8 ± 4,1 пг, RDW 17,4 ± 3,2%.Отмечено снижение уровня СЖ до 3,7 ± 2,9 мкмоль/л и СФ до 6,4 ± 4,3 нг/мл, повышение ЛССЖ до 75,9 ±11,2 мкмоль/л. У данной группы пациентов можно отметить выраженную гипохромную анемию, коррелирующую с уменьшением запасов железа.
У пациентов с АХЗ анемия носила нор-мохромный, реже гипохромный характер и характеризовалась следующими показателями гемограммы: RBC 3,7 ± 0,84 -10 12 /л, HGB 100,4 ±16,7 г/л, HCT 30,0 ± 4,9%, MCV 83,3 ± 9,9 фл, MCH 28,0 ± 4,1 пг, RDW 16,5 ± 3,9%. Биохимические маркеры метаболизма железа имели следующие значения: СЖ 10,6 ± 3,2 мкмоль/л, СФ 286,2 ± 213,1 нг/мл, ЛССЖ
33,2 ±14,0 мкмоль/л. У данной совокупности пациентов анемия носит умеренный характер, по сравнению с больными ЖДА, и ха-
рактеризуется нормальным или пониженным уровнем сывороточного железа, латентной связывающей способностью железа в пределах нормы или сниженной, концентрацией сывороточного ферритина повышенной, реже нормальной.
Как известно, причины, приводящие к развитию дефицита железа, многочисленны. Клиницисту необходимо использовать все диагностические критерии, позволяющие установить истинную причину дефицита железа и выбрать обоснованную стратегию лечения. Важно при дифференциальной диагностике отличить железодефицитную анемию (первичную) от анемии хронического заболевания, так как неадекватное лечение может вызвать симптомы вторичного гема-хроматоза у больных с АХЗ. В то же время возможно сочетание анемии хронических заболеваний с железодефицитной анемией. В качестве независимых тестов СЖ, ЛССЖ, СФ имеют ограниченную ценность, определение гемоглобина - условно [8].
Определение содержания гемоглобина в ретикулоците ^е1-Не) является информатив-
ным показателем, отражающим обмен железа и его доступность для системы эритрон в настоящий момент времени. В клинической практике индекс Ret-He практически не используется. Это связано как с недостаточной технической оснащенностью лабораторий, так и со слабой информированностью врачей клиницистов, и даже гематологов, о диагностической ценности данного ретикуло-цитарного индекса.
Мы исследовали значение содержания гемоглобина в ретикулоцитах у пациентов с ЖДА, АХЗ и контрольной группы. Полученные данные представлены в таб. 2.
Различия по параметру оказались статистически значимыми (р < 0,05) для групп ЖДА и АХЗ, а также ЖДА и контрольной группы. Между группой АХЗ и группой здоровых лиц достоверных различий по содержанию гемоглобина в ретикулоцитах не обнаружено (р > 0,5).0днако в группе здорового контроля отмечено наибольшее значение показателя Ret-He (30,9 ±1,4 пг), что свидетельствует о максимальном насыщении гемоглобином ретикулоцитов. По-
Таблица 1.Показатели гемограммы и метаболизма железа у пациентов с ЖДА, АХЗ и контрольной группы (М ± SD)
Показатели нормы Контроль ЖДА АХЗ
RBC, 1012/л (3,8—5,5) 4,7± 0,47 3,8 ± 0,61* 3,7 ± 0,84*
HGB, г/л (120-160) 139,0 ± 13,4 77,4 ± 21 100,4 ± 16,7
НСТ, % (36-48) 39,3 ± 3,7 25,5 ± 5,5 30,0 ± 4,9
МСУ, фл (80-100) 84,5 ± 3,9 65,0 ± 9,3 83,3 ± 9,9
МСН, пг (27-31) 29,7 ± 1,3 19,8 ± 4,1 28,0 ± 4,1
RDW, % (11,5-14,5) 13,2 ± 0,7 17,4 ± 3,2 16,5 ± 3,9
СЖ, мкмоль/л (7-26) 15,6 ± 4,3 3,7 ± 2,9 12,6 ± 3,2
СФ, нг/мл (20-300) 46,2 ± 20,5 6,4 ± 4,3 286,2 ± 213,1
ЛССЖ, мкмоль/л (20-63) 42,4 ± 15,2 75,9 ±11,2 33,2 ± 14,0
Примечание: нормальные показатели периферической крови по [7]; нормальные показатели обмена железа - референтные значения используемых методов. *- различия статистически не значимы р > 0,05. Все остальные различия между параметрами статистически значимы р < 0,05.
Таблица 2. Значение Ret-He(пг) у контрольной группы здоровых людей и пациентов с ЖДА, АХЗ
Контроль ЖДА АХЗ
М ± SD 30,9 ± 1,4* 17,9 ± 4,9 28,9 ± 3,7*
mediana 30,8 16,7 29,2
тт 28,4 10,9 17,8
тах 34,9 27,4 36,4
Примечание:* р < 0,05
лученные нами референтные значения близки к данным ряда авторов: 28,2-35,7 пг [1], 30,2-36,7 [2], 28,2-35 пг [9], 28,6-36,3 [10] пг.
У пациентов с ЖДА параметр Ret-He составляет 17,9 ± 4,9 пг, в группе АХЗ -
28,2 ± 3,72 пг. Согласно зарубежным исследованиям содержание гемоглобина в рети-кулоците < 28 пг является «золотым стандартом» железодефицитного эритропоэза [6, 7, 9]. В нашем случае у всех пациентов с ЖДА параметр Ret-He меньше указанной точки отсчета, что подтверждает истинный (абсолютный) дефицит железа. В группе АХЗ у 7 человек (13,7%) содержание гемоглобина в ретикулоцитах меньше 28 пг, что позволяет предположить сочетание анемии хронического заболевания с железодефицитной анемией. У остальных 46 человек (86,3%) ретикулоцитарный параметр Ret-Н превышает «точку отсчета» 28 пг, что свидетельствует о нормальной гемоглоби-низации ретикулоцитов даже в условиях угнетения эритропоэза, а генез анемии обусловлен перераспределительным желе-зодефицитом.
Таким образом, скрининг содержания гемоглобина в ретикулоцитах у пациентов с микроцитарными гипохромными анемиями позволяет выявить скрытый железодефицит. В ряде случаев это актуально и для нормо-хромных анемий, так как MCV - расчетный показатель и может иметь нормальное значение при наличии у пациента одновременно выраженного макро- и микроцитоза. Кроме того, ложное завышение MCV может происходить в случае присутствия холодовых агглютининов, когда агглютинаты эритроцитов воспринимаются прибором как одна большая клетка, а также в случае диабетического кетоацидоза вследствие гиперосмо-лярности плазмы [6].
В опубликованных ранее работах указывалось на корреляцию содержания гемоглобина в ретикулоцитах с показателями обмена железа у больных с гипохромными и нор-мохромными анемиями, когда MCV<100 [7, 9, 11]. В частности, по данным [11], Ret—He коррелирует с концентрацией трансферино-вых рецепторов в 85% случаев. Однако заме-
тим, что в разных работах анализируются самые различные биохимические маркеры обмена железа, полученные с применением различных анализаторов; исследователи не указывают полученных коэффициентов корреляции.
Корреляционный анализ, выполненный нами, не выявил достоверной взаимосвязи между гемоглобином ретикулоцитов и параметрами обмена железа у контрольной группы здоровых людей. У пациентов с ЖДА получены следующие коэффициенты корреляции: r = 0,58 (СЖ и Ret-He), r = - 0,55 (ЛССЖ и Ret-He), r = 0,44 (СФ и Ret-He). Близкими по значению оказались коэффициенты корреляции у пациентов с АХЗ: r = 0,46 (СЖ и Ret-He), r = - 0,59 (ЛССЖ и Ret-He), r = 0,34 (СФ и Ret-He). Для увеличения численности выборки мы сочли возможным объединить группы ЖДА и АХЗ (101 человек). При проведении корреляционного анализа и выявлены следующие линейные связи: слабая зависимость между Ret-He и СФ (r = 0,4), достоверная положительная корреляция между Ret- He и СЖ (r = 0,68) и отрицательная между Ret He и ЛССЖ (r = - 0,7). Более высокие коэффициенты корреляции в смешанной группе мы объясняем объемом выборки.
Хотя взаимосвязь между концентрацией ферритина и содержанием гемоглобина в ре-тикулоците статистически достоверна (р<0,01), коэффициент корреляции недостаточно значителен (r = 0,4), что явилось существенным затруднением для построения математической модели. Слабую корреляцию с сывороточным ферритином объясняем тем, что у больных с острыми и хроническими заболеваниями на метаболизм железа оказывают влияние множество факторов, а повышенная концентрация ферритина, как правило, является острофазовой реакцией в ответ на воспаление. Связь Ret-He с ЛССЖ и СЖ оказалась гораздо сильнее, что и было положено в основу математической модели.
На рис. 1 показаны точками значения Ret-He в зависимости от ЛССЖ и СЖ пациента, причем каждая точка - отдельный пациент.
Попытка связать показатели регрессионной прямой дала высокую погрешность. Интерполяция получается более точной с помо-
RET-He,пг
Примечание: 1 - эмпирические данные (зависимость RET-He от СЖ), 2 - экспоненциальная зависимость^е^Не от СЖ),
3 - эмпирические данные (зависимость Ret-He от ЛССЖ),
4 - экспоненциальная зависимость^ЕТ-Не от ЛССЖ).
Рисунок 1. Зависимость ЯЕТ-Не от сывороточного железа и латентной связывающей способности железа.
щью кривых, которые проще всего представить экспонентами.
По нашему мнению, экспоненциальная связь Ке1-Не и СЖ обусловлена тем, что анализируется массив пациентов с анемиями разного генеза. На участке 0-7 мкмоль/л зависимость линейная. Этот отрезок соответствует преимущественно больным с абсолютным железодефицитом, когда встраивание железа в гемоглобин ретикулоцита прямо пропорционально его доступности, то есть концентрации в сыворотке крови. При увеличении значений сывороточного железа пропорционально возрастает параметр Ке1>Не. У пациентов с АХЗ (участок 7-15 мкмоль/л) анемия носит перераспределительный характер, железо накапливается в макрофагах и недоступно для эритропоэза, общее количество сывороточного железа в организме близко к норме или немного уменьшено. Достигнув насыщения при концентрации СЖ более 15 мкмоль/л, содержание гемоглобина в рети-кулоците если и увеличивается, то медленно, что обусловлено физиологически стабильностью гомеостаза в организме.
Экспоненциальную зависимость Ке1-Не от ЛССЖ объясняется аналогично. Степень изменения ЛССЖ почти всегда позволяет судить о состоянии баланса железа при физиологических и различных патологических состояниях. Повышение данного параметра является одним из первых прояв-
лений истощения запасов железа и гипоксии тканей.
Участок, на котором ЛССЖ изменяется от 60 до 100 мкмоль/л, соответствует ЖДА, когда степень «голодания» сыворотки крови максимальна, а насыщение железом транспортного белка - трансферри-на минимально. Содержание гемоглобина в ретикулоцитах резко уменьшается даже при небольшом росте ЛССЖ, так как транспортные белки связывают все доступное железо сыворотки крови. Зависимость, близкую к линейной на указанном выше участке, мы объясняем действием прямых причинно-следственных связей: показатели обмена железа дают достаточно точное представление о количестве микроэлемента в организме.
Участок 20-60 мкмоль/л соответствует анемии при АХЗ, когда есть тенденция к снижению ЛССЖ. Патогенез анемии при АХЗ имеет мультифакторный характер, что отражается в экспоненциальной зависимости Ке1-Не и ЛССЖ, когда следствие (угнетение эритропоэза) имеет множество причин. Это и снижение выработки эрит-ропоэтина, и резистентность к нему эрит-роидных клеток - предшественников, и дисбаланс между доставкой железа к эрит-робластам и стимуляцией синтеза ЭПО. На этом участке заметно уменьшается Ке1>Не при увеличении ЛССЖ.
Участок, на котором ЛССЖ изменяется от 0 до 15 мкмоль/л, почти горизонтален, так как содержание гемоглобина в ретикулоци-тах достигает своих максимальных физиологических значений и ни при каких обстоятельствах не может быть меньше, что означало бы гибель клетки.
Таким образом, мы наглядно показали, что содержание гемоглобина в ретику-лоцитах тесно связано с показателями обмена железа у больных с ЖДА и АХЗ. На основании этого факта можно предложить использование данного ретикулоцитарно-го индекса для отслеживания изменений обмена железа при мониторинге анемий вышеуказанного генеза. Замена дорогостоящих биохимических реагентов на ретику-лоцитарный анализ, входящий в состав гемограммы, экономически целесообразна и
значительно удешевит пребывание больного в стационаре, что крайне актуально в настоящее время.
Выводы:
1. Содержание гемоглобина в ретикуло-цитах позволяет дифференцировать железодефицитные анемии от анемий хронических заболеваний и их сочетаний.
2. Выявлена взаимосвязь между содержанием гемоглобина в ретикулоцитах и маркерами обмена железа (сывороточным фер-ритином, сывороточным железом и латентной связывающей способностью железа).
3. В ряде случаев определение содержания гемоглобина в ретикулоцитах позволяет заменить биохимические анализы метаболизма железа.
Список использованной литературы:
I..Brugnara C., Zelmanovic D., Sorette M et.al. An integrated parameter for evaluation of erythropoietic activity // Am J Clin Pathol.-1997.-Vol.1C8.-P.133-142
2Canals C.,Remacha A. F., Sarda M.P. et.al. Clinical utility of the new Sysmex XE 21CC parameter- reticulocyte hemoglobin equivalent - in the diagnosis of anemia // Haematologica.-2CC5. - Vol.90 - № 8.-P.1133-1134.
3. Thomas L., Franck S., Messinger M. et all. Reticulocyte hemoglobin measurement -comparison of two methods in the diagnosis of iron-restricted erythropoiesis //Clinical chemistry and laboratory medicine. - 2CC5. - Vol.43. - № 11. - P.1193 -12C2.
4. Назаренко Г.И., Коленкин C.M., Луговская C.A. и др. Значение показателей автоматизированного анализа ретику-лоцитов для диагностики и оценки эффективности лечения В12-дефицитной анемии. // Клиническая лабораторная диагностика . - 2СС4. -№ 5. - C.42-44.
5.Thomas L.,Thomas Ch. Biochemical markers and hematological indices in the diagnosis of functional iron deficiency // Clinical Chemistry. - 2CC2. - Vol.48. -№7 - P.1C66-1C76.
6.Луговская C.A., Морозова B.T., Почтарь M.E., Долгов В.В.Лабораторная гематология. - М. -Тверь: ООО «Издательство «Триада». - 2СС6. -224 с.
7А.Н. Окороков. Диагностика болезней внутренних органов: Т.4. Диагностика болезней системы крови: - М.: Мед. лит.- 2СС1.- 512 с.
8.Щербинина СП., Романова E.A., Левина A.A. и др .Диагностическое згачение комплексного исследования показателей метаболизма железа в клинической практике //Гематология и трансфузиология. -2СС5. -Т.5С. - № 5. -C.23 -28.
9. S.Franck, J. Linssen, M.Messinger, L.Thomas. Potential utility of RET-Y in diagnosis of iron - restricted erythropoiesis // Clinical Chemistry. - 2CC4. - Vol.50, №7. - P.124C-1242
1C. C.Brugnara B.,Schiller,J.Moran. .Reticulocyte hemoglobin equivalent (Ret He) and assessment of iron-deficient states// Clinical and Laboratory Haematology.-2CC6.-Vol.28, № 5. - P.3C3 -3C8.
II. T.S.Kickler, M.J.Borowitz, R.E.Thompson, N.Charintranont, R. Law. RET-Y a measure of reticulocyte size: a sensitive indicator of iron deficiency anemia // Clinical and Laboratory Haematology. -2CC4. -Vol.26, № 6. -P.423- 427.
