CC BY
16
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК: 615.324:616.33-002.44-085-092.4
ГАСТРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ТКАНЕЙ СВИНЫХ ПОЧЕК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ «ИНДОМЕТАЦИНОВОЙ» ЯЗВЕ У КРЫС
Самира Эльшадовна ЛОРЕНЦ, Александр Юрьевич ЖАРИКОВ,
Игорь Петрович БОБРОВ, Олеся Николаевна МАЗКО,
Олеся Геннадьевна МАКАРОВА, Валерий Иванович КИСЕЛЕВ
Алтайский государственный медицинский университет Минздрава России 656038, г. Барнаул, просп. Ленина, 40
Цель исследования - макро- и микроскопическая оценка морфологического состояния слизистой оболочки желудка в условиях применения пептидного комплекса из тканей свиных почек при экспериментальной «индоме-тациновой» язве желудка. Материал и методы. Эксперименты были проведены на 16 самцах крыс сток Вистар, разделенных поровну на две группы: контрольную (моделирование язвенной болезни желудка) и подопытную (моделирование язвенной болезни желудка + введение пептидного комплекса из тканей свиных почек в дозе 15 мг). Пептидный комплекс был получен методом уксусно-кислой экстракции из лиофильно высушенного го-могената свиных почек. Модель индометацинового повреждения слизистой оболочки желудка крыс воспроизводили путем однократного внутрижелудочного введения индометацина в дозе 60 мг/кг в 1 мл физиологического раствора. Результаты. Установлено, что у животных контрольной группы введение индометацина вызывало явления выраженного эрозивного гастрита. На этом фоне в подопытной группе фиксировались отчетливые признаки восстановления нормальной структуры слизистой оболочки желудка. Оказалось, что в подопытной группе в сравнении с контролем заболевания в 2,2 раза снизилось количество полосовидных эрозий, в 3,6 раза уменьшился индекс Паулса (для обоихр < 0,001). Кроме того, на 85,6 % уменьшилась средняя глубина эрозий и в 1,2 раза увеличилась толщина слизистой оболочки желудка.
Ключевые слова: гастропротекторное действие, пептидный комплекс, свиные почки.
Ранее нами получен пептидный комплекс из тканей свиных почек, идентифицирован его аминокислотный состав и исследовано фармакологическое влияние на течение экспериментальной мочекаменной болезни. Оказалось, что данный комплекс обладает выраженным литолитическим действием, которое сопровождается регенерацией эпителия почечных канальцев, ослаблением окислительного повреждения тканей и усилением биосинтетической активности клеток [1, 3].
В настоящее время некоторые экспериментальные данные указывают на патогенетическую близость патологических процессов в нефро-телии при мочекаменной болезни и в эпителии желудка при язвенной болезни. Так, например,
при данных патологиях наблюдается усиление процессов свободнорадикального окисления в тканях, увеличение активности лактатдегидроге-назы - маркерного фермента цитолиза, ослабление биосинтетической активности клеток и т.п. [4-7]. В этой связи возникает предположение, что пептидный комплекс из тканей свиных почек, который в эксперименте продемонстрировал способность ослаблять действие факторов повреждения нефротелия, нивелировать окислительный стресс в тканях, а также нормализовать морфо-функциональные свойства эпителия [1, 3], может оказывать благоприятное действие на структуру и функцию клеток слизистой оболочки желудка (СОЖ) при язвенной болезни.
Лоренц С.Э. - преподаватель кафедры фармакологии, e-mail: pharm_s@mail.ru
Жариков А.Ю. - д.б.н., зав. кафедрой фармакологии, e-mail: zharikov_a_y@mail.ru
Бобров И.П. - д.м.н., зав. морфологической лабораторией Центра медико-биологических исследований,
e-mail:ig.bobrov2010@yandex.ru
Мазко О.Н. - к.б.н., зав. лабораторией биомедицины Центра медико-биологических исследований, е-mail: olesia.mazko@yandex.ru
Макарова О.Г. - к.фарм.н., старший научный сотрудник лаборатории биомедицины Центра медико-биологических исследований, е-mail: olesia552@mail.ru
Киселев В.И. - член-кор. РАН, д.м.н., проф. кафедры нормальной физиологии, e-mail:vik@agmu.ru СИБИРСКИЙ НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 37, № 6, 2017 5
Таким образом, целью настоящего исследования явилась макро- и микроскопическая оценка морфологического состояния слизистой оболочки желудка в условиях применения пептидного комплекса из тканей свиных почек при экспериментальной «индометациновой» язве желудка.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Пептидный комплекс получали по следующей технологии: 10 г гомогенизированной субстанции из лиофильно высушенных свиных почек заливали 100 мл 0,1Н уксусной кислоты и экстрагировали в течение 24 ч при ^ = 5 °С с периодическим перемешиванием. По окончании экстракции замораживали при ^ = -20 °С, затем сразу оттаивали и фильтровали, после чего осаждали пептиды при помощи ацетона (соотношение экстракт : ацетон 1 : 6) при ^ = 5 °С в течение 18 ч. Осадок отделяли, растворяли в дистиллированной воде и фильтровали, полученный суперна-тант выпаривали и высушивали в термостате при I = 60 °С.
Эксперименты проведены на 16 самцах крыс сток Вистар (возраст 7-8 недель, масса 211-229 г), разделенных поровну на две группы: контрольную (моделирование язвенной болезни желудка) и подопытную (моделирование язвенной болезни желудка + введение пептидного комплекса из тканей свиных почек). Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к еде и пище. Исследования выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Подопытной группе ежесуточно в течение 7 дней (до моделирования индуцированного ин-дометацином повреждения слизистой оболочки желудка) вводили внутрижелудочно через зонд в виде взвеси в крахмальной слизи пептидный комплекс из тканей свиных почек в дозе 15 мг на крысу. Последнее введение приходилось за 1 ч до начала действия язвообразующего фактора. Животные контрольной группы получали эквиобъ-емные количества растворителя в соответствующих режимах введения. Модель повреждения слизистой оболочки желудка крыс воспроизводили путем однократного внутрижелудочного введения индометацина в дозе 60 мг/кг в 1 мл физиологического раствора.
Через 6 ч после введения язвообразующего фактора крыс подвергали эвтаназии с использованием эфирного наркоза, желудки животных извлекали, вскрывали по малой кривизне и промывали
холодным физиологическим раствором. Материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина. Проводку материала осуществляли по изопропиловому спирту с помощью автомата проводки карусельного типа TISSUE-TEK VIPTM6 (Sakkura, Япония), заливали материал в парафин при помощи станции парафиновой заливки TISSUE-TEK TEC 5 (Sakkura), окрашивали в автомате для автоматической окраски микропрепаратов TISSUE-TEK Prisma (Sakkura) и заключали под пленку в автомате для автоматического заключения микропрепаратов TISSUE-TEK Film (Sakkura). Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм получали с использованием полуавтоматического роторного микротома Accu-Cut SRM (Sakkura). Окрашивали препараты гематоксилином и эозином, Шифф-раствором по Мак-Манусу на нейтральные гликозаминогликаны и 1%-м раствором альцианового синего на 3%-й уксусной кислоте (pH 2,5) по Стидмену на кислые гликозаминогликаны. Подсчитывали плотность воспалительного инфильтрата в 1 мм2 при помощи окулярной сетки Автандилова.
Для каждого вида повреждения слизистой оболочки желудка высчитывали индекс Паулса по формуле: (N х K) / 100, где N - среднее число деструкций на 1 животное, K - процент поражений животных в группе. Цифровые микрофотографии микропрепаратов получали с помощью микроскопа Nikon Eclipse E200 (Япония) и цифровой видеокамеры VIDI CAM (Россия). Мор-фометрические измерения осуществляли при помощи морфометрической программы Видио-Тест-Морфология 5.2. Непрерывные переменные представлены в виде среднего арифметического и ошибки среднего (М ± m). Номинальные данные представлены в виде относительных частот объектов исследования (n, %). Для оценки различий количественных данных использовали критерий Стьюдента, критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты проведенного морфологического исследования показали, что у животных контрольной группы индометацин вызывал явления выраженного эрозивного гастрита. При макроскопическом исследовании поверхность СОЖ имела бугристый вид, в ней были отчетливо видны деструктивные изменения в виде глубоких полосовидных и поверхностных точечных эрозий (рис. 1). На этом фоне у животных подопытной группы фиксировали значительные признаки восстановления структуры СОЖ. При
Рис. 1. Глубокая полосовидная эрозия в СОЖ крыс контрольной группы. Здесь и на рис. 2 окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 100
макроскопическом исследовании у данных животных рельеф СОЖ был ровный. Хотя деструктивные изменения в СОЖ были выявлены у всех подопытных животных, однако они были представлены в основном неглубокими полосовид-ными и поверхностными точечными эрозиями (рис. 2). Среднее число эрозий на 1 животное по сравнению с контрольной группой в группе подопытных животных было меньше в 1,4 раза. При этом число точечных эрозий в двух группах было одинаковым, а число полосовидных эрозий и их глубина в контроле превышали величины соответствующих показателей в опыте в 2,2 раза и на 85,6 %. Индекс Паулса для полосовидных эрозий в контрольной группе в 3,6 раза превысил таковой для подопытной группы (таблица).
Рис. 2. Поверхностная точечная эрозия с большим количеством солянокислого гематина в СОЖ у крыс подопытной группы
При микроскопическом исследовании СОЖ у крыс контрольной группы выглядела арофичной, покровно-ямочный эпителий находится в состоянии дистрофии. Толщина СОЖ по периферии эрозий по сравнению с подопытной группой была меньше в 1,2 раза. При гистохимическом исследовании по методу ШИК столбчатый эпителий поверхностных отделов СОЖ крыс контрольной группы давал слабую реакцию на нейтральные мукополисахариды. Кислые мукополисахариды были слабо выражены в клетках глубоких отделах желудочных ямок. Некротические изменения в язвенных дефектах достигали мышечного слоя. Во многих эрозиях отмечались массивные отложения солянокислого гематина. Воспалительный инфильтрат был выражен слабо и состоял из лим-
Таблица
Макро- и микроскопические показатели структуры слизистой оболочки желудка у крыс при применении пептидного комплекса из тканей свиных почек в условиях экспериментальной язвы желудка
Показатель Контрольная группа Подопытная группа
Число повреждений СОЖ, п 9,6 ± 1,7 6,8 ± 1,2*
Число полосовидных эрозий, п 4,8 ± 0,9 2,2 ± 1,0*
Число полосовидных эрозий, % 51,1 32,4
Число точечных эрозий, п 4,6 ± 1,4 4,6 ± 1,2
Число точечных эрозий, % 48,9 67,6
Индекс Паулса для полосовидных эрозий, % 24,0 6,6
Индекс Паулса для точечных эрозий, % 16,8 16,8
Толщина СОЖ, мкм 335,6 ± 12,4 406,7 ± 14,4*
Глубина эрозий, мкм 385,8 ± 23,7 207,8 ± 13,6*
Плотность воспалительного инфильтрата в СОЖ в 1 мм2 1333,3 ± 70,5 1720,0 ± 115,5*
Примечание. * - отличие от величины соответствующего показателя контрольной группы статистически значимо при р < 0,05.
фоцитов, плазматических клеток и макрофагов. Плотность воспалительного инфильтрата в под-слизистом слое составила 1333,3 ± 70,5 клеток в 1 мм2. В мышечном слое фиксировались явления отека и умеренно выраженного воспаления. Сосуды СОЖ были полнокровны.
У крыс подопытной группы при гистохимическом исследовании СОЖ по методу ШИК столбчатый эпителий поверхностных отделов СОЖ давал интенсивную реакцию на нейтральные мукополисахариды. Кислые мукополисаха-риды определялись умеренно в клетках глубоких отделах желудочных ямок. В подслизистом слое определялись явления умеренно выраженного воспаления, воспалительный инфильтрат составляли лимфоциты, плазматические клетки и нейтрофилы. Сосуды были в состоянии умеренно выраженного полнокровия.
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные результаты свидетельствуют о существенном ослаблении индуцированного ин-дометацином повреждения СОЖ у крыс при применении пептидного комплекса из тканей свиных почек, что подтверждают статистически значимые различия в данных, полученных при макро- и микроскопическом исследованиях. Как известно, именно глубокие полосовидные эрозии относятся к наиболее деструктивным нарушениям целостности СОЖ при воздействии индометацина, в связи с чем значительное уменьшение их количества свидетельствует о благоприятном действии пептидного комплекса. Это также подтверждается увеличением толщины СОЖ в группе подопытных животных относительно контроля.
Обсуждая возможные причины наблюдаемого эффекта, можно заключить, что, скорее всего, они связаны с пептидным и/или аминокислотным составом объекта исследования. В литературе нами встречен ряд данных о благоприятном воздействии пептидов и аминокислот на течение экспериментальной язвенной болезни. Так, например, синтетический дипептид глутамил-триптофан на индометациновой модели язвенной болезни показал гастропротекторный эффект, в основе которого лежало его цитопротекторное, антиок-сидантное и иммуномодулирующее действие [6]; ^ацетилцистеин проявил себя как гастропротек-тор за счет антиоксидантных, противовоспалительных и антиапоптотических механизмов [8]; показано антиульцерогенное действие ликофла-вона, реализуемое через регуляцию метаболизма аминокислот [9]. По нашим данным, полученным при проведении аминокислотного состава лио-филизата тканей свиных почек, из которого экс-
трагировали пептидный комплекс, в него входят 12 аминокислот: лизин, тирозин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин, валин, пролин, треонин, серин, аланин, глицин [3]. Не исключено, что выявленный в ходе экспериментов га-стропротекторный эффект пептидного комплекса из тканей свиных почек может быть обусловлен пептидами, в структуру которых входят указанные аминокислоты. Идентификация возможных механизмов такого действия станет целью наших дальнейших исследований.
Таким образом, приведенное исследование позволяет сделать вывод, что курсовое применение пептидного комплекса из тканей свиных почек в дозе 15 мг на крысу позволяет получить гастропротекторный эффект при экспериментальной «индометациновой» язве желудка. Введение препарата приводит к снижению количества глубоких полосовидных эрозий слизистой оболочки желудка и их глубины, уменьшению индекса Паулса, а также увеличению толщины слизистой оболочки желудка. Исследуемый пептидный комплекс может быть перспективным средством лечения и профилактики рецидивов язвенной болезни.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Жарикова Г.В., Жариков А.Ю., Киселев В.И., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Кирьякова В.О. Влияние пептидного комплекса из тканей свиных почек на показатели свободнорадикального окисления при экспериментальной мочекаменной болезни // Сиб. науч. мед. журн. 2017. 37. (2). 17-21.
2. Жариков А.Ю., Жарикова Г.В., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Кирьякова В.О. К вопросу идентификации биологически активных веществ нового средства для лечения мочекаменной болезни // Бюл. мед. науки. 2017. (1). 28-31.
3. Жариков А.Ю., Киселев В.И., Салдан И.П., Жарикова Г.В., Лепилов А.В., Бобров И.П. Морфологическая оценка влияния пептидного комплекса из тканей свиных почек на течение экспериментальной мочекаменной болезни // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2017. 164. (8). 237-240.
4. Осадчук А.М., КоганН.Ю., Кветной И.М. Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и прогнозировании течения заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori // Рос. журн. гастроэнтерол, гепатол., колопроктол. 2007. 17. (4). 20-23.
5. Подопригорова В.Г. Оксидативный стресс и язвенная болезнь. М.: Медицина, 2004. 176 с.
Podoprigorova V.G. Oxidative stress and peptic ulcer. Moscow: Medicine, 2004. 176 p. [In Russian].
6. Саватеева-Любимова Т.Н., Сивак К.В., Ма-линин В.В. Гастропротекторная активность анало-
гов дипептида глутамил-триптофана и мелатони-на // Эксперим. и клин. фармакология. 2012. 75. (2). 17-21.
7. Goineau S., Castagne V. Complementarity of in vitro and in vivo models for the evaluation of gastro-protective effects of pharmacological substances // Fundam. Clin. Pharmacol. 2017. 31. (2). 155-164.
8. Soliman N.A., Zineldeen D.H., Katary M.A., Ali D.A. N-acetylcysteine a possible protector against
indomethacin-induced peptic ulcer: crosstalk between antioxidant, anti-inflammatory, and antiapoptotic mechanisms // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2017. 95. (4). 396-403.
9. Yang Y, Wang S, Bao Y.R., Li T.J., Yang G.L., Chang X., Meng X.S. Anti-ulcer effect and potential mechanism of licoflavone by regulating inflammation mediators and amino acid metabolism // J. Ethnopharmacol. 2017. 199. 175-182.
GASTROPROTECTIVE ACTION OF THE PEPTIDE COMPLEX FROM PIG KIDNEYS AT EXPERIMENTAL «INDOMETHACINE» ULCER IN RATS
Samira Elshadovna LORENTS, Alexandr Yurjevich ZHARIKOV, Igor Petrovich BOBROV, Olesya Nikolaevna MAZKO, Olesya Gennadjevna MAKAROVA, Valeriy Ivanovich KISELEV
Altay State Medical University of Minzdrav of Russia 656038, Barnaul, Lenin av., 40
The aim of the study was a macro and microscopic evaluation of the structural state of the gastric mucosa under conditions of application of a peptide complex from the tissues of porcine kidneys with the experimental indomethacin-induced stomach ulcer. Experiments were carried out on 16 male Wistar rats divided equally into 2 groups: control (modeling gastric ulcer) and experimental (modeling gastric ulcer + introduction of the peptide complex from the tissues of porcine kidneys at a dose of 15 mg). The peptide complex was obtained by acetic acid extraction from a lyophilized dried pig kidney homogenate. The model of indomethacin damage to the gastric mucosa was reproduced by single intragastric administration of indomethacin at a dose of 60 mg/kg in 1 ml of physiological saline. It was established that in animals of the control group in the gastric mucosa the administration of indomethacin caused the phenomena of expressed erosive gastritis. Against this background, in the experimental group, there were definite signs of restoring the normal structure of the gastric mucosa. It turned out that in the experimental group, in comparison with the control of the disease, the number of strip-like erosions decreased 2.2 times, the Pauls index decreased by 3.6 times (for both p < 0.001). In addition, the average depth of erosion decreased by 85.6 % and the thickness of the gastric mucosa increased 1.2 times.
Key words: gastroprotective action, peptide complex, porcine kidneys.
Lorents S.E. - lecturer of the chair for pharmacology, e-mail: pharm_s@mail.ru
ZharikovA.Yu. - doctor of biological sciences, head of the chair for pharmacology, e-mail: zharikov_a_y@mail.ru Bobrov I.P. - doctor of medical sciences, head of morphological laboratory, e-mail: ig.bobrov2010@yandex.ru Mazko O.N. - candidate of biological science, head of biomedical laboratory, e-mail: olesia.mazko@yandex.ru Makarova O.G. - candidate ofpharmaceutical sciences, senior researcher of biomedical laboratory, e-mail: olesia552@mail.ru
Kiselev V.I. - doctor of medical sciences, corresponding member of the RAS, professor of the department of hominal physiology, e-mail: vik@agmu.ru
