CC BY
221
ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ
Н.В. Лаврова
Н.В. Лаврова
ГАПЛОИДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ В СЕЛЕКЦИИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
Преамбула. Указаны разработанные автором методические подходы получения гаплоидов озимой мягкой пшеницы в культуре in vitro. Приводятся составы синтетических питательных сред, индуцирующих получение новообразований в культуре изолированных пыльников и микроспор. Внимание уделяется перспективе использования гаплоидой биотехнологии в селекции озимых злаков.
Введение
Для получения гаплоидов методами биотехнологии в культуре in vitro злаковых применяют несколько методов: метод селективной элиминации хромосом в гибридном зародыше с последующей эмбриокуль-турой [3], культивирование неоплодотворенных завязей и семяпочек [4], культивирование изолированных пыльников и микроспор [1; 2].
Методы культивирования изолированных пыльников и микроспор основаны на использовании явления андрогенеза (андроклинии) в системе in vitro. Это особая система размножения растений различных семейств, позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные ра-стения-регенеранты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолированных пыльников. Нами разработана эффективная система получения гаплоидов при культивировании пыльников и микроспор различных генотипов мягкой пшеницы с озимым типом развития, защищенная двумя авторскими патентами (№2006134942, №2006134941) и предложена универсальная индукционная среда для последовательного отбора зеленых растений-регене-рантов этой зерновой культуры.
Объекты и методы исследований
Растительный материал. Растения-доноры пяти сортов озимой пшеницы: Немчиновская 24, Галина, Инна, Московская 39 и Памяти Федина выращивали в поле на экспериментальных делянках НИИСХ ЦРНЗ (Московская обл.). Колосья с сортов-доноров отбирали в поле в фазу сильновакуолизированной микроспоры по морфологическим признакам: размеру и цвету пыльника, степени плотности чешуй колоса. Детально стадию развития микроспор пшеницы анализировали на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии по методу З.П. Паушевой [5].
Холодовая предобработка. Из доступных нам литературных источников известно, что ре-
жимы холодовой предобработки пыльцы способствуют возникновению меристематических очагов в каллусах и определяют дальнейший ход органогенеза в них на средах для регенерации растений. Колосья стерилизовали (вместе с листовой оберткой) раствором гипохлорита Na, отмывали в нескольких объемах стерильной дистиллированной воды, после чего у них удаляли ости и раскрывали колосковые чешуи. Стерильные колосья помещали на агаризованные питательные среды по прописи MS, не содержащие регуляторов роста и выдерживали в условиях низких положительных температур в течение 417 суток. Выдерживание стерильных колосьев на питательной среде (а не в стерильной воде) продлевало жизнеспособность микроспор от 2-х недель до 3-х месяцев в зависимости от сорта.
Культура пыльников и микроспор. Пыльники извлекали из нижних цветков средней части одного колоса глазными хирургическими иглами и размещали равномерно по поверхности индукционной среды, содержащей различный состав углеводов. Штативы с пробирками и чашки Петри на 4-7 сут. помещали в темноту и культивировали при температуре 32-33°С до появления гаплоидных новообразований.
Образование эмбриоидов и регенерация растений. В каллусной ткани, имеющей сферическое строение, через 28-30 дней с момента инокуляции пыльников образовывались андроклин-ные структуры. Крупные эмбриоиды переносили на модифицированные нами по ауксинам среды Potato 11 и Блейдса для регенерации растений, содержащие половинную концентрацию макросолей, хелата железа и агара. Дальнейшее культивирование проводили при температуре 9-11°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 20 тыс. лкс. Развившиеся растения-регенеранты (n=21) укореняли на жидкой среде до образования хорошей корневой системы и яровизировали при температуре 2-4°С не менее 60 дней, затем колхицинировали (0,02% раствор). Высаженные в условия подогреваемой теплицы НИИСХ
22
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 4, 2006
© Н.В. Лаврова, 2006
Гаплоидная биотехнология в селекции озимой пшеницы
Рис. Гаплоидная биотехнология создания форм озимой мягкой пшеницы.
1 этап - полевой отбор колосьев остистых и безостых сортов-доноров озимой пшеницы по комплексу морфологических признаков в фазе сильновакуолизированной микроспоры (1); подготовка колосьев к стерилизации (обрезка остей и колосковых чешуй); стерилизация цветков и/или выделение пыльников (2);
2 этап - эксплантирование цветков, пыльников и семяпочек in vitro в жидкой индукционной среде: разрыв стенки пыльника и «самопроизвольный» выход микроспор в среду (3), осаждение микроспор центрифугированием и определение стадии развития микроспор под микроскопом (4);
3 этап - культивирование микроспор на средах для эмбриоидогенеза до образования многоклеточных комплексов (5) и пыльников до образования каллусирующих гаплоидных структур сферического типа (6), последовательный отбор плотных эмбриоидоподобных структур и пересадка их на среды для регенерации;
4 этап - органогенез в культуре андрогенной каллусной ткани и получение растений-регенерантов (8);
5 этап - укоренение регенерантов in vitro (9);
6 этап - цитологический и цитофотометрический контроль плоидности регенерантов (10) и яровизация андрогенных гаплоидов при температуре 2-4°С в течение 60 дней;
7 этап - диплоидизация регенерантов колхицином, пересадка в почву и доращивание (в зависимости от сезона) в поле или в условиях подогреваемой теплицы (11) до получения колосьев (R0); (12) - R1 и R2 поколений;
8 этап - размножение растений-регенерантов R1 и R2 поколений методами биотехнологии: андрогенез или эмбриокультура зародыша.
ЦРНЗ дигаплоиды образовывали озерненные колосья (рис.).
Результаты исследований
На примере культивирования изолированных пыльников и микроспор 5-ти сортов озимой пшеницы мы оценивали длительность воздействия низкими положительными температурами на колосья донорных растений и способ их стерилизации (подбор компонента стерилизации и
его экспозиции). При этом учитывалось время, прошедшее от момента срезания колосьев до инокуляции пыльников на питательные среды (табл. 1). В результате проведенных исследований было отмечено, что холодовая предобработка колосьев у всех изучаемых сортов озимой пшеницы не оказывала существенного влияния на выход новообразований (каллусов и эмбрио-идов), но сохраняла жизнеспособность микроспор в изолированной культуре от 2-х недель до
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 4, 2006
23
ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ
Г. С. Матвеева
Таблица 1
Влияние продолжительности воздействия пониженной положительной температурой на частоту индукции андрогенеза in vitro у озимой мягкой пшеницы
Продолжительность воздействия, сут.
Сорт 0 4 9 15 17
П", Н", П, Н, П, Н, П, Н, П, Н,
шт. шт./% шт. шт./% шт. шт./% шт. шт./% шт. шт./%
Немчинов 24 500 60/12,0 500 59/11,8 500 58/11,6 500 55/11,0 500 42/8,4
Галина 500 35/7,0 500 29/5,8 500 27/5,4 500 21/4,2 500 18/3,6
Инна 500 75/15,0 500 60/12,0 500 53/10,6 500 47/9,4 500 40/8,0
Московская 39 500 115/23.0 500 102/20,4 500 100/20.0 500 82/16,4 500 82/16,4
Памяти Федина 500 50/10.0 500 49/9.8 500 50/10,0 500 37/7,4 500 29/5,8
Примечание: П* - пыльников высажено; Н* - новообразований получено.
3-х месяцев в зависимости от генотипа. Мы считаем, что холодовое воздействие на экспланты перед инокуляцией их на питательные среды является для микроспор стрессовым фактором. Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что деление ядер микроспор происходит только в тех из них, которые отрываются от орбикул и «выпадают» в полость гнезда пыльника, а те микроспоры, которые остаются прикрепленными к орбикулам и через них -к стенке гнезда пыльника, и микроспоры, находящиеся на средней фазе микроспорогенеза и прикрепленные к тапетуму, к делению не приступают. Наши исследования убеждают в том, что холодовая предобработка колосьев растений-доноров озимой пшеницы напрямую не влияет на продуктивность эмбриоидогенеза in vitro, и ее назначение заключается только в том, чтобы направить развитие микроспоры по спорофит-ному пути развития. Это обусловлено новыми, подобранными нами условиями выдерживания стерильных колосьев-доноров на средах при низких положительных температурах, вызывающих низкотемпературный стрессовый шок для содержащихся внутри колосьев пыльников.
В экспериментах изучались также различные концентрации углеводов - глюкозы, саха-
розы и мальтозы. Результаты исследований показали преимущество питательной среды, содержащей сахарозу или мальтозу в концентрации 0,26 М (табл. 2).
В научной литературе встречаются сообщения, что с помощью манипулирования концентрациями сахарозы можно получать растения пшенично-пырейных гибридов, у которых листья имеют вид «зебры», то есть идет чередование зеленых и белых полос. Такие растения получала В.Н. Чистякова [3].
Заключение
В результате проведенных исследований показано, что выдерживание стерильных колосьев озимой пшеницы в культуре in vitro на агаризо-ванных питательных средах при низких положительных температурах (2-4°С) способствует сохранению жизнеспособности микроспор до 3-х и более месяцев. Частота формирования андрок-линных структур в культуре in vitro зависит от комплекса взаимосвязанных факторов: условий стерилизации донорных растений, предобработки низкими положительными температурами и выдерживания на средах МС без регуляторов роста, а также от стадии развития микроспор и состава индукционной питательной среды, со-
Таблица 2
Влияние состава углеводов в индукционной среде на продуктивность эмбриоидогенеза озимой мягкой пшеницы in vitro, %
Глюкоза Глюкоза Сахароза Мальтоза
Сорта (0,26 M) (0,52М) (0,26М) (0,26М)
Галина 1,7 0,5 20,3 19,7
Инна 1,3 0,3 18,3 26,2
Московская 29 1,7 0,4 29,5 23,3
Памяти Федина 1,2 0,05 5,9 7,8
Немчиновская 24 0,7 0,2 3,7 4,7
24
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 4, 2006
Анализ среднесуточного прироста живой массы дочерей различных производителей и их кровности
держащей в качестве углеводов сахарозу и мальтозу в концентрации не менее 0,26 М.
Библиографический список
1. Анапияев Б.Б. Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор яровой пшеницы: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2001.
2. Lavrova N. V. The working out biotechnology receiving haploided plants of winter wheat (Triticum aestivum L.) // Third Moskow international Congress: «Biotechnology: state of the art and
prospects of development», March, 14-18, 2005. -Р. 264-265.
3. Чистякова В.Н. Гаплоиды неполных пше-нично-пырейных амфидиплоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование. -М.: МАКС-Пресс, 2000.
4. Чистякова В.Н., Неттевич Э.Д., Гуляев Г. В. Возможности генотипа в повышении эффективности метода Bulbosum. // Генетика. -1994. - Т. 30.
5. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Колос, 1988. - С. 66-102.
Г.С. Матвеева
АНАЛИЗ СРЕДНЕСУТОЧНОГО ПРИРОСТА ЖИВОЙ МАССЫ ДОЧЕРЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ И ИХ КРОВНОСТИ
Изучена динамика живой массы от рождения до 1-го осеменения при скрещивании черно-пестрой породы и гол-штинских быков-производителей разных генотипов.
Цель. Установить влияние генотипа быков-производителей на динамику роста живой массы дочерей за период от рождения до 1-го осеменения.
Актуальность. В анализ материалов по изучению динамики живой массы дочерей различных быков-производителей от рождения до их 1-го осеменения были включены потомки 7-и быков-производителей с общим числом -161 дочь. Результаты анализа прироста живой массы дочерей различных быков-производителей за период выращивания до 1-го осеменения представлен в таблице 1. Анализ таблицы 1 показал, что живая масса дочерей различных быков-производителей составила при 1-ом осеменении от 396,8 до 415,7 кг при среднесуточ-
ном приросте от 610,7 до 648,2 г за этот период, при достижении живой массы в 19,5 мес. возрасте 406,9 кг.
Исследования полученных данных показали, что дочери быков-производителей Черри, Стингера и Дебюта имели среднесуточный прирост при 1-ом осеменении 610,7, 612,0, 618,0 г - соответственно. Эти результаты оказались несколько ниже по сравнению с показателями дочерей Босса, Нарзана и Клерка.
Так, дочери Босса, Нарзана и Клерка имели лучшие показатели по среднесуточному приросту (648, 642, 641 г), живой массе (409, 415, 405 кг) и они оказались более скороспелы: 19,3; 19,8; 19,3 мес. - соответственно.
В результате анализа полученных данных установлено, что за период выращивания до 1-го осеменения дочерей отдельных быков-производителей имели различия по среднесуточному
Таблица 1
Динамика роста живой массы дочерей различных производителей
Кличка производителя Число дочерей Живая масса (кг) в возрасте, мес.
при рождении 6 10 12 18 при 1-ом осеменении
возраст, мес. живая масса, кг среднесуточный прирост, г
Черри 26 34,0 151,4 221,4 261,2 357,1 19,8 396,8 610,7
Дебют 31 34,0 149,5 218,7 251,4 354,7 20,6 408,3 618,0
Босс 22 33,7 153,7 225,2 263,4 374,4 19,3 409,0 648,2
Хакас 22 34,4 155,4 224,8 260,2 365,1 19,8 405,4 624,6
Стингер 17 33,9 152,7 225,5 259,2 355,6 20,4 407,9 612,0
Нарзан 19 34,1 149,9 221,6 258,9 364,5 19,8 415,7 642,4
Клерк 24 34,2 158,2 238,6 275,8 379,3 19,3 405,8 641,8
© Г.С. Матвеева, 2006
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 4, 2006
25
