CC BY
26УДК 57.084.1
A.V. Popov, D.O. Vinokhodov, M.V. Rutto
GALVANOTACXIS AS A WAY OF BIOASSAYS PROCEDURE AUTOMATION
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: vinokhodov@list.ru
Modern information on Protozoa galvanotaxis mechanism is presented. Ciliata cells galvanotaxis effect for control in bioassay procedure have been introduced. The scheme of the device for automation of procedure of bioassays using ciliata Paramecium caudatum is proposed. The results of the device application for toxicity control of various water samples having different composition were demonstrated. Results of toxicological analysis with the device and those obtained with classical bioassays methods are compared.
Keywords: Protozoa, galvanotaxis, Paramecium caudatum, bioassay
А.В. Попов1, Д.О. Виноходов2, М.В. Рутто3
ГАЛЬВАНОТАКСИС КАК СРЕДСТВО АВТОМАТИЗАЦИИ ПРОЦЕДУРЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр., 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: vinokhodov@list.ru
Приведены современные данные о механизме гальванотаксиса простейших организмов. Показано, что эффект гальванотаксиса может быть использован для контроля движения клеток инфузорий в условиях постановки биотестовой реакции. Представлена схема прибора, разработанного для автоматизированного процесса биотестирования на инфузориях Paramecium caudatum. Продемонстрированы результаты использования прибора при оценке токсичности водных сред различного состава. Проведено сравнение результатов токсикологического анализа, проведённого с использованием прибора и классическими методами.
Ключевые слова: Protozoa, простейшие, гальванотаксис, Paramecium caudatum, биотестирование.
D0l:10.15217/issn998984-9.2015.29.70
Простейшие (Protozoa) являются традиционным модельным объектом для проведения различных лабораторных экспериментов. Одной из форм их реакций на воздействия окружающей среды являются таксисы, то есть изменения характера движения. По характеру раздражителя у Protozoa выделяют следующие таксисы: геотаксис, обусловленный влиянием гравитационного поля Земли; хемотаксис, возникающий под действием химических раздражителей в среде; реотаксис, проявляющийся при механическом движении среды; гальванотаксис, происходящий под влиянием электрического поля.
В ходе исследования различных таксисов разработаны разнообразные физиологические и биохимические модели. Биофизическая модель гальванотаксиса, разработанная Наоко Огавой [1], описывает движение клеток Paramecium caudatum, находящихся в электрическом поле, и объясняет возникновение у них крутящего момента. При пропускании постоянного электрического тока на катодном конце возникает деполяризации, а на анодном конце - гиперполяризация мембраны. В первом случае это приводит к активации селективного потенциал-зависимого канала ионов Ca2+ и цилиарной реверсии (к реверсивному биению ресничек), а во втором - к активации селективного потенциал-зависимого K+ канала и к усиленному биению ресни-
чек. При этом возникает обратная сила и сила тяги. При отклонении клетки от линий напряженности электрического поля асимметрия двух противоположно направленных сил приводит к возникновению крутящего момента. Таким образом, клетка ориентируется под действием крутящего момента по линиям напряженности электрического поля и движется в сторону катода (рисунок 1).
Рисунок 1. Физическая механистическая модель гальванотаксиса P. Caudatum
Приведенная модель учитывает, что гальванотаксис возникает под действием электрохимических, физио-
1 Попов Антон Владимирович, ассистент каф. молекулярной биотехнологии, e-mail: biotechnology_dept@technolog.edu.ru Popov Anton V., assistant Department of Molecular biotechnology, e-mail: biotechnology_dept@technolog.edu.ru
2 Виноходов Дмитрий Олегович, д-р биол. наук, профессор, каф. молекулярной биотехнологии, e-mail: vinokhodov@list.ru Vinokhodov Dmitriy O., Dr Sci (Biol.), Professor, Department of Molecular biotechnology, e-mail: vinokhodov@list.ru
3 Рутто Марика Валерьевна, канд. хим. наук, доцент, каф. молекулярной биотехнологии, e-mail: biotechnology_dept@technolog.edu.ru Rutto Marika V. PhD(chem.), Associate Professor, Department of Molecular biotechnology, e-mail: biotechnology_dept@technolog.edu.ru
Дата поступления - апреля 2015 года Received April , 2015
логических и физических факторов. Воздействие электрического поля не на одиночную клетку, а на популяцию, приводит к согласованному движению всех клеток популяции по направлению к катоду. Данный эффект, хотя и был обнаружен более 100 лет назад, практического применения не находил. Между тем он позволяет управлять движением популяции клеток инфузорий путем изменения ориентации и напряженности линий электрического поля в среде. Ранее нами были разработаны методы концентрирования и отмывания клеток P. caudatum, основанные на гальванотаксисе [2]. В настоящей работе мы использовали гальванотаксис для другой цели - для контроля движения клеток инфузорий в условиях постановки биотестовой реакции и автоматизации процедуры биотестирования объектов окружающей среды.
На основе указанной идеи нами был разработан и изготовлен прототип прибора для оценки интегральной токсичности водных сред TOVS. Он представляет собой портативную установку (рисунок 2), снабженную жидкокристаллическим дисплеем и регуляторами, связанными с фотоэлементом.
до 5,5 В; ток потребления в рабочем режиме, не более 100 мкА. Для создания рабочего напряжения на электродах использован линейный регулируемый стабилизатор LM1085. В качестве фотодетекторов использованы фоторезисторы ФР1-3. Размеры фоточувствительного элемента 1,0x5,8 мм, рабочее напряжение не более 15 В, темновое сопротивление не менее 0,05 МОм, максимальная мощность излучения не более 6 мВт.
Данный прибор позволяет управлять движением клеток P. caudatum путем смены полярности электродов кюветы, при этом непрерывно измеряются оптические свойства культуры клеток, находящейся в кювете (рисунок 4).
Рисунок 2. Внешний вид «ТОУЗ» портативной установки для биотестирования и схема рабочей кюветы
Рабочая кювета прибора выполнена из стекла. Геометрические параметры кюветы: 45x10x10 мм. Сверху и снизу вмонтированы графитовые электроды. Управление направлением тока в кювете осуществляется с помощью контроллера. Принципиальная схема прибора представлена на рисунке 3.
Рисунок 3. Принципиальная схема прибора «TOVS»
Смена полярности электродов кюветы происходит через заданные промежутки времени (от 10 с до 5 мин). Сконцентрированное облако инфузорий периодически пересекает ось «источник излучения - фотоэлемент», формируя сигнал определенной интенсивности. Сигналы с фотоэлемента поступают на компьютер, где оформляются в форме таблиц Excel для дальнейшей обработки (рисунок 5).
Компьютерная программа, управляющая прибором, позволяет устанавливать общее количество прогонов и время одного прогона, в течение которого направление тока в кювете не меняется. В экспериментах показано, что слишком долгие прогоны (более 2 мин) нецелесообразны - при «долгих» прогонах клетки, сконцентрировавшись у верхнего электрода, начинают оседать вниз - возникает серия случайных пиков, никак не характеризующих токсичность среды.
За «короткие» прогоны (менее 30 с) парамеции не успевают сконцентрироваться в области катода. Оптимальное время, за которое практически все клетки концентрируются у электрода, составляет 60 с.
Техническая характеристика прибора
Прибор состоит из электронной платы со встроенным блоком питания и жидкокристаллическим дисплеем. Блок питания подключается к сети переменного тока напряжением 220 В и осуществляет питание элементов электронной платы стабилизированным гальванически развязанным от сети постоянным напряжением 5 В.
Электронная плата работает под управлением микроконтроллера ATMEGA32, который управляет работой ключей для подачи потенциалов на электроды, обработкой сигналов фотодетектирования и передачей данных на персональный компьютер. Для подачи потенциалов на графитовые электроды служат ключи на базе транзисторов КТ3102Г. Для преобразования сигналов фотодетекторов применены операционные усилители (ОУ) МСР601. Характеристики ОУ: рабочее напряжение от 2,7
Рисунок 4. Поведение клеток в рабочей кювете прибора
Откликом прибора является сигнал, поступающий каждые 0,25 с с фотоэлемента и коррелирующий с числом клеток, пересекающих ось «источник излучения-
фотоэлемент». На экран в режиме реального времени выводится графическая зависимость интенсивности отклика прибора от времени. Рассмотрим более подробно отклик прибора на движение облака клеток парамеций в нетоксичной среде Лозина-Лозинского. Наблюдение за клетками показало, что в результате действия ряда факторов облако клеток движется к верхнему электроду более плотным фронтом, чем при движении вниз. Таким образом, поскольку отклик прибора прямо пропорционален плотности облака клеток, для каждого четного прогона (катод наверху) характерен более высокий пик. На нечетных прогонах наблюдается серия из относительно низких нерегулярных пиков, поскольку при движении вниз облако клеток имеет более «рыхлый» фронт (рисунок 5). Таким образом, для оценки токсичности целесообразно использовать динамику изменения пиков четных прогонов, когда клетки движутся плотным фронтом. Эти пики регулярны и хорошо различимы. Площадь и амплитуда этих пиков зависят от характера движения, плотности и скорости движения облака клеток P. caudatum.
Материалы и методы
Культура инфузорий P. caudatum, клон 94А Б6-18, была любезно предоставлена нам сотрудниками кафедры инженерной защиты окружающей среды Санкт-Петербургского государственного электротехнического университета.
Для культивирования и отмывания клеток использовали стандартный минеральный раствор Лозина-Лозинского: NaCl - 0,1 г; KCl - 0,01 г; CaCl2 - 0,01 г; MgCl2 - 0,01 г; NaHCO3 - 0,02 г., вода - до 1 л. Инфузорий культивировали на сенном отваре по общепринятой методике. Питательную среду разливали по 100 мл в конические колбы объемом 250 мл и настаивали сутки для развития кормовой культуры бактерий - сенной палочки. Затем колбы засевались 5 мл культуры P. caudatum с концентрацией около 1000 клеток/мл, колбы закрывали ват-но-марлевыми пробками. Культуру содержали при комнатной температуре.
Для отмывания и концентрирования культуры использовали ранее разработанный прибор и традиционный метод отмывания (в пикнометрах) [3]. Синхронизацию культуры перед постановкой токсикологической реакции не проводили.
В качестве модельных токсинов использовались соли тяжелых металлов: CdI2, CuSO4, Pb(NO3)2, CrCl3, NiCl2.
Результаты
В первую очередь, исследовали отклик прибора в отсутствии токсичных веществ: варьирование осуществлялось только по таким параметрам как концентрация клеток, возраст культуры, метод отмывания клеток, минеральный состав среды. Данные эксперименты проводились с целью выявления воспроизводимого, легко интерпретируемого отклика прибора на нетоксичную контрольную среду.
Как и предполагалось, наибольший эффект на отклик оказывало изменение концентрации клеток в образце. С одной стороны, чем меньше концентрация клеток в кювете, тем будет слабее рассеяние света и тем сложнее выделить «эффективный» сигнал прибора. С другой стороны, при высоких концентрациях (около 4000 клеток/мл) возникают сильные гидродинамические потоки среды вследствие синхронного движения большого числа организмов, данные потоки нарушают целостность облака, что приводит к хаотичному движению клеток. Вероятно, характер этих гидродинамических потоков также зависит от геометрических параметров кюветы.
Оптимальный рабочий интервал концентраций пришелся на 1000-2000 клеток/мл, далее мы использовали именно этот диапазон. Важно отметить, что в случае превышения порога равного 2000-5000 клеток/мл, чувс-
твительность клеток к определенным типам токсинов начинает существенно снижаться, что иногда выражается в полном отсутствии токсического эффекта. Это особенно заметно, когда концентрация токсина невелика - при этом, в экспериментах, где использовались одиночные клетки, эффект проявлялся достаточно быстро (обездвиживание, деформация определенных структур, гибель, лизис), тогда, как в клеточной суспензии токсин этой же концентрации равномерно распределённый между организмами не давал каких бы то ни было видимых эффектов.
Для оценки влияния возраста культуры на поведение клеток в кювете были исследованы 2-, 5-, 10-, 14-суточные культуры парамеций. Возраст культуры практически не влиял на отклик прибора. Однако следует учитывать, что возраст и условия культивирования могут оказать существенное влияние на чувствительность клеток к определенным классам токсичных веществ. Данное явление корреляции чувствительности и возраста отмечают многие исследователи, особенно у биологических объектов имеющих тенденцию существенно изменять свои физиологические параметры с течением времени (старение клеток у высших животных, клональные циклы у простейших и т.д.) [4, 5]. Отмывание же клеток от питательных сред желательно проводить в любом случае, так как взвеси и любая органика могут реагировать с тестируемыми веществами, частично снижая их токсичное действие и, тем самым, искажая результаты биотестирования.
Все эксперименты по исследованию токсичности сред первоначально проводились «классическим методом» [6]. Каждая проба исследовалась под микроскопом, подсчет погибших клеток за каждый промежуток времени делался визуально и на основании этого строились кривые динамики гибели культуры, а также оценивались такие токсикологические показатели как летальные экспозиции (^ - время-эффект, ^ - доза-эффект). Было показано, что все стандартные минеральные среды, использованные для культивирования и отмывания клеток, подходят для экспериментов и не влияют на чувствительность организмов. Следует заметить, что в силу физиологии клеток, для проявления ими нормальной двигательной активности и способности к гальванотаксису необходимо, в первую очередь, обращать внимание на концентрацию ионов калия и кальция в среде. Обмен этими ионами, осуществляемый специфическими белковыми порами мембраны клетки, помимо прочих регулятор-ных и сенсорных функций играет основную роль в работе двигательного аппарата клеток [1].
Для оценки токсичности на приборе использовали динамику изменение относительной высоты пиков, возникающих при движении, плотным фронтом, клеток к верхнему электроду. Эти пики регулярны и хорошо различимы. Показано, что они располагаются через каждые 73 с от старта. Площадь и амплитуда этих пиков зависят от характера движения, плотности и скорости движения облака клеток P. caudatum. Подбор оптимальных характеристик культуры (концентрации клеток в пробе, возраста культуры) проводили с целью получения стабильных пиков на четных прогонах. В экспериментах использовались культуры клеток возрастом 2-5 суток. Для каждого возраста культуры ставили тесты, в которых варьировали концентрация клеток в пробе. Оптимальная концентрация клеток составила около 1500 клеток/мл.
Шкала времени
Рисунок 5. Формирование серии пиковых откликов TOVS
Как видно из рисунка 5, по изменению высоты четных пиков (огибающей пиков) мы можем делать заключение о свойстве исследуемого раствора: токсичен ли он или нет для инфузорий. Так как чувствительность многих одноклеточных организмов может на несколько порядков превышать чувствительность многоклеточных к одним и тем же концентрациям химических веществ [7], то эта первичная качественная оценка приближается к установленным значениям ПДК некоторых веществ и их смесей. Сравнение графиков откликов отдельных экспериментов можно вести, например, путем прямого сопоставления динамики изменения относительной высоты пиков (то есть сравнение характера огибающих пики кривой). В качестве сравниваемых характеристических параметров, в наших экспериментах были выбраны моменты времени, когда относительная высота пиков уменьшается на 50 % от первоначальной высоты. Данный тест-критерий был выбран по аналогии с традиционными токсикологическими параметрами, такими как летальные экспозиции (иг50 и иг100).
Анализ токсичных образцов проводили с использованием, в качестве токсинов растворов, солей тяжелых металлов. Тестирование каждой пробы велось в течение 1 ч (до 100 прогонов) и 3 ч (до 240 прогонов), в зависимости от степени токсичности среды. В качестве токсинов использовалось по несколько разведений солей: Cdl2, 0^04, СгС1з, Zna2.
Для лучшего понимания принципа биотестирования на приборе, перед тем как перейти к построению реальных графиков огибающих откликов прибора, рассмотрим основные идеализированные графики, которые могут быть получены с использованием T0VS (рисунок 6).
Шкала времени
Рисунок 6. Модельные кривые огибающих пиковых откликов TOVS в токсикологических испытаниях (описание в тексте)
В зависимости от степени токсичности образца возможны следующие исходы экспериментов биотестирования на приборе:
Кривая 1. Нетоксичная среда. Относительная высота откликов прибора не должна статистически значимо уменьшаться - то есть не должен проявляться отрицательный тренд. Отметим, однако, что высота отклика нетоксичной пробы может возрастать до 30 %. Данное явление вызвано синхронизацией движения облака клеток парамеций с течением времени [8].
Кривая 2. Слаботоксичная среда. Как видно из графика: кривая не достигает значения в 50 % (ни за 1 ч, ни за 3 ч). Чем слабее токсичность среды, тем незначительнее будет уменьшение относительной высоты отклика прибора в ходе эксперимента, вплоть до статистически незначимого отличия от отрицательного контроля. В данном случае гибнут только высокочувствительные клетки популяции инфузорий. При концентрации токсина в среде соответствующей «хроническому отравлению» гибели организмов уже не происходит. При такой концентрации у тест-объекта могут проявляться специфические изменения биохимического и физиологического состояния, зафиксировать которые можно такими методами как: изменением удельной скорости роста популяции, этологи-ческими реакциями, изменения в динамике работы тех или иных органов (органелл) биологического тест-объекта.
Кривая 3. Токсичная среда «средняя токсичность». В течение эксперимента относительная высота пиков падает более чем на 50 % от исходной. В конце эксперимента живой остается только небольшая часть популяции (кривая выходит на плато). Существование этого плато обусловлено двумя причинами. Во-первых, всегда существует доля клеток популяции обладающих большей устойчивостью к токсину. Во-вторых, в силу различных факторов, распределение токсина может быть неравномерным.
Кривая 4. Высокотоксичная среда. Гибель всей популяции происходит максимум в течении 5-7 мин от начала эксперимента.
Таким образом, с помощью разработанного нами метода биотестирования мы можем различить высокотоксичные, слаботоксичные и нетоксичные среды.
Эффект же действия сред «средней токсичности» может быть оценен путем сопоставления времени затрачиваемого на преодоление 50 % порога относительной высоты пиков у анализируемого образца и положительных контролей (по аналогии с LT50). Для этого, на шкале времени выбираются пики, высота которых меньше либо равна 50 % от исходной высоты, и, далее, учет ведется уже по этим точкам.
Теперь приведем реальные графики, полученные на T0VS. На рисунке 7 представлены обработанные данные по тестированию стандартных растворов сульфата меди. Точками отмечена относительная высота пиков четных прогонов, вертикальными линиями отмечено время пересечения 50 % порога, время задано в секундах. Во всех экспериментах ставились отрицательные контрольные тесты.
Для сравнения графиков динамики откликов мы строили сводный график (рисунок 8). На нем, по аналогии с кривой «доза-время» LE50 (штриховая жирная линия) [7], строилась зависимость времени (необходимого для уменьшения относительной высоты пиков на 50 %) от концентрации токсина (степени токсичности исследуемого модельного образца).
Из графика видно, что существует определенная зависимость (близкая к кривой «доза-эффект» LE5о [7]) между временем (требующимся для уменьшения высоты пика на 50 %) и токсичностью исследуемого образца. Таким образом, при биотестировании на T0VS, мы можем давать количественную оценку токсичности исследуемого раствора относительно серии положительных контролей (серии разведений какого-либо известного токсина). Однако, это будет только предварительная оценка, и на аналитическую точность она претендовать, конечно же, не может. В связи с этим удобно представлять результаты экспериментов в полуколичественном формате. Так, например, временная шкала на графике (рисунок 8) условно подразделялась нами на три интервала и, в зависимости от того, в какой интервал попадал тестируемый образец, его относили к «высокотоксичному», «токсичному» либо «слаботоксичному» и давали приблизительную количественную оценку в единицах концентраций модельного токсина, использованного в качестве положительного контроля.
Рисунок 7. Огибающие откликов полученные при тестировании проб содержащих тяжелые металлы в разной концентрации
Аналогично поступая, были протестированы растворы солей других тяжелых металлов, состроены сводные графики и найдены концентрации, при которых среда считалась бы высокотоксичной и слаботоксичной (таблица). В качестве предельной чувствительности прибора была выбрана концентрация тяжелого металла, когда огибающая кривая откликов статистически незначимо отличается от огибающей кривой отрицательного контроля. Для автоматизации статистической обработки данных, как и для построения графиков, был использован Microsoft Office Excel.
Таблица 1. Интервалы чувствительности автоматизированной тест-системы
Время падения относительной высоты пиков на 50 % Качественная оценка среды Концентрации токсина определены графически из кривой откликов тестирования модельных токсинов
CUSO4
0-500 с высокотоксичная среда более 9,5 10 -5 моль / л
500-3000 с токсичная среда 2,0 10 -5 моль / л - 9,5 10 -5 моль/л
более 3000 с слаботоксичная среда менее 2,0 10-5 моль / л
При концентрации CuSO4 менее 6,0 10-6 моль / л огибающая откликов статистически незначимо отличается от огибающей отрицательного контроля в течении 3 часов
Cdl2
0-500 с высокотоксичная среда более 6,8 10 -5 моль / л
500-3000 с токсичная среда 7,1 10 -6 моль / л - 6,8 10 -5 моль/л
более 3000 с слаботоксичная среда менее 7,1 10-6 моль / л
При концентрации Cdl2 менее 1,0 10-6 моль / л огибающая откликов статистически незначимо отличается от огибающей отрицательного контроля в течении 3 часов
СгС13
0-500 с высокотоксичная среда более 2,0 10 -4 моль / л
500-3000 с токсичная среда 6,5 10 -5 моль / л - 2,0 10 -4 моль/л
более 3000 с слаботоксичная среда менее 6,5 10-5 моль / л
Рисунок 8. Сводный график: точками отмечена зависимость времени уменьшения высоты пиков (на 50 %) от концентрации
токсина (сульфата меди). Пунктирная линия - кривая доза-эффект ^Е5о), полученная способом визуального контроля динамики гибели организмов.
При концентрации СгС1з менее 3,0 ■ 10-5 моль / л огибающая откликов статистически незначимо отличается от огибающей отрицательного контроля в течении 3 часов
Выводы
1. Эффект гальванотаксиса может быть использован для контроля движения клеток инфузорий в условиях постановки биотестовой реакции.
2. Разработанный прибор позволяет вести автоматизированный контроль за поведением клеток парамеций в токсичной среде, что даёт возможность проводить экспресс-анализ интегральной токсичности различных объектов окружающей среды.
Литература
1. Ogawa N., Okua H., Hashimoto K., Ishikawa M. A physical model for galvanotaxis of Paramecium cell // J. of Theoretical Biology. 2006. V. 242. P. 314-328.
2. Виноходова М.В., Попов А.В., Серегина А.А., Зубанов П.А., Виноходов Д.О. Выделение биомассы инфузорий c помощью гальванотаксиса // Известия СПбГТИ(ТУ). 2012. № 13(39). С. 61-63.
3. Попов А.В., Виноходов Д.О., Серегина А.А. Автоматизированное определение токсичности с использованием таксисов инфузории туфельки: сб. науч. тр. Высокие технологии, исследования, промышленность. СПб.: СПбПУ, 2010. С. 14-17.
4. Зализняк Л.А., Кокова В.Е. Культивирование парамеций как тест-объекта на отваре дрожжей // Цитология. 1992. Т. 34. № 4. С. 62.
5. Самойлова К.А. Изменение чувствительности инфузорий Paramecium caudatum к ингибиторам дыхания и гликолиза в связи с возрастом культуры // Докл. АН
СССР. 1964. Т. 153. № 3. С. 670-672.
6. Виноходов Д.О. Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий. СПб. 1995. 80 с.
7. Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: дис. ... д-р биол. наук. СПб, 2001. 353 с.
8. Казанцева А. Г., Захаров И. С. Исследование влияния биологических и технических факторов на тест-реакцию гальванотаксиса // Известия СПбГЭТУ «ЛЭТИ». 2010. № 5. С. 109-114.
