CC BY
20УДК 57.084.1
М.В. Виноходова1, А.В. Попов2, А.А. Серегина3, П.А. Зубанов4, Д.О. Виноходов5
На сегодняшний день инфузории являются одним из перспективных объектов в биотехнологии. Они могут быть использованы в биотестовых реакциях в экологических и токсикологических лабораториях, кроме того, биомасса инфузорий может служить стартовым кормом для молоди рыб и источником полноценного животного белка [1].
Ресничные инфузории - наиболее высоко организованные одноклеточные организмы. Благодаря специфической чувствительности и развитым клеточным ультраструктурам, в частности, ресничному аппарату, они способны проявлять разнообразные ярко выраженные реакции на изменения внешней среды. К числу таких реакций относят изменение направления движения клеток под влиянием внешних раздражителей. Это явление называют таксисом. Различают геотаксис, возникающий под влиянием гравитационного поля Земли, гальванотаксис, происходящий вследствие воздействия электрического поля, хемотаксис, вызываемый химическими раздражителями, реотаксис, проявляющийся при механическом движении среды и другие [2].
Гальванотаксис инфузорий был открыт в конце XIX в. Его механизм в настоящее время изучен достаточно подробно. Мембрана клетки инфузории имеет небольшой электрический заряд. При этом передняя часть клетки заряжена положительно, а задняя - отрицательно. Таким образом, клетка инфузории представляет собой гигантский вытянутый диполь. В электрическом поле её задний конец начинает притягиваться к аноду, а передний - к катоду, в результате чего электрическое поле разворачивает клетку и ориентирует её в пространстве определённым образом, заставляя плыть в сторону катода.
Это явление было использовано нами для осуществления операций, связанных с выделением биомассы из культуральной жидкости.
Условия эксперимента
Культура инфузорий Paramecium caudatum, клон 94А Б6-18, была любезно предоставлена нам сотрудниками кафедры инженерной защиты окружающей среды Санкт-Петербургского Государственного электротехнического университета.
ВЫДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ИНФУЗОРИЙ C ПОМОЩЬЮ ГАЛЬВАНОТАКСИСА
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26,
Обсуждаются перспективы использования гальванотаксиса в операциях выделения биомассы инфузорий. Показано, что для этих целей целесообразно использовать электрическое поле напряжённостью 1,5-2,0 В/см. Разработана экспериментальная установка для отмывки культуры Paramecium caudatum в лабораторных условиях. Метод гальванотаксиса опробован для выделения P. caudatum при культивировании в иску-ственных водоёмах.
Ключевые слова: Paramecium caudatum, гальванотаксис, выделение биомассы.
Инфузорий культивировали на минеральном растворе Лозина-Лозинского [3] с добавлением сухих пекарских дрожжей производства Санкт-Петербургского комбината пищевых продуктов в качестве единственного источника питания.
Стерильный раствор Лозина-Лозинского разливали по 100 мл в конические колбы объемом 250 мл, добавляли дрожжи из расчёта 0,3 г/л. Колбы инокулировали культурой P. caudatum с концентрацией около 1400 кл./мл, инокулят добавляли в количестве 2 мл, колбы закрывали ватно-марлевыми пробками. Культуру содержали в освещённом месте при комнатной температуре. Периодичность пересева - один раз в три дня. В экспериментах использовали культуру в возрасте 3-5 суток.
Реакцию гальванотаксиса наблюдали под микроскопом в микроаквариуме, оснащённом электродами, при увеличении 35х.
Эксперименты по выделению биомассы проводили в специально сконструированном приборе, описание которого приведено ниже, а также в искусственном водоёме объёмом 170 л. Концентрацию инфузорий в культурах определяли методом прямого подсчёта с помощью бинокулярной лупы МБС-2 при увеличении 25х в объёме 0,02 мл. Подсчёт вели в десяти повторностях.
Результаты и обсуждение
При наблюдении поведения клеток P. caudatum в электрическом поле (в диапазоне напряженности от 0,2 до 3,0 В/см) в условиях микроаквариума было установлено, что наиболее выраженную реакцию инфузории проявляют при напряжённости от 0,5 до 2,1 В/см. При значениях этого параметра ниже 0,2 В/см наблюдали лишь дезориентацию клеток, а при его повышении до 3,0 В/см наступала их гибель. В постоянном электрическом поле клетки двигались по направлению к катоду по спиральным траекториям, шаг и диаметр которых зависели от напряжённости поля (рисунок 1).
Основываясь на этих данных, мы сконструировали портативный прибор для изучения гальванотаксиче-ской реакции на уровне лабораторной культуры. Принципиальная электрическая схема прибора приведена на рисунке 2.
1 Виноходова Мария Владимировна, аспирант каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, 196084 Санкт-Петербург, ул. Черниговская д. 5, hscmvmv@mail.ru
2 Попов Антон Владимирович, аспирант каф. молекулярной биотехнологии, , 4qm56r@rambler.ru
3 Серегина Александра Александровна, аспирант каф. молекулярной биотехнологии, MiracleSA@yandex.ru
4 Зубанов Павел Алексеевич, аспирант каф. молекулярной биотехнологии, zubanov_pavel@mail.ru
5 Виноходов Дмитрий Олегович,д-р биол. наук, профессор каф. молекулярной биотехнологии, vinokhodov@list.ru
Дата поступления - 12 октября 2011 года
сопротивлением (К1) постоянный ток в направлении снизу вверх.
При подаче напряжения на рабочую колбу с культурой инфузорий (Кн) организмы двигаются в сторону катода вверх или вниз, в зависимости от положения переключателя (П1).
Электрическая схема смонтирована в специально изготовленном корпусе с соблюдением правил техники безопасности при эксплуатации электроустановок.
Рисунок 1. Траектория движения клеток в электрическом поле при разных значениях напряжённости: а) Е = 0,83 В/см; б) Е = 1,25 В/см; в) Е = 1,67В/см
Рисунок 2. Принципиальная электрическая схема прибора для изучения гальванотаксической реакции
Схема представляет собой регулируемый стабилизированный выпрямитель переменного тока, рассчитанный на постоянное напряжение до 50 В с ручным переключением полярности питания нагрузки. В качестве источника питания использован трансформатор (Тр1), первичная обмотка которого включена в сеть через предохранитель (Пр1) и первую секцию синхронного переключателя (П1-1). Параллельно первичной обмотке трансформатора включена неоновая лампа (Л1) - индикатор работы прибора. Часть вторичной обмотки трансформатора (Тр1) используется для питания рабочей колбы прибора (Кн). Для этого в схеме использован выпрямитель (Д1С1). Отрицательная часть контура и корпус трансформатора заземлены. Для регуляции и контроля рабочего напряжения на колбе (Кн) последовательно с выпрямительным контуром включено переменное сопротивление (К1), а параллельно - стрелочный вольтметр. На рабочую колбу ток нагрузки подается через синхронный переключатель (П1-3) и (П1-4), который обеспечивает смену полярности питания нагрузки (Кн). Светодиоды (Д2) и (Д3) включены во вторую часть вторичной обмотки трансформатора (Тр1) через синхронный переключатель (П1-2). Они предназначены для индикации направления электрического тока в рабочей колбе (Кн). Таким образом переменный электрический ток трансформируется через понижающий трансформатор (Тр1) до величины 50В и поступает на выпрямительный контур (Д1С1). Снятый с контура постоянный ток поступает на регулятор напряжения (К1), величина которого контролируется с помощью вольтметра. Выбранное рабочее напряжение поступает на синхронный переключатель (П1-3) и (П1-4), к которому подключена рабочая колба прибора (Кн).
При включении синхронного переключателя (П1) в положение 1 включается индикаторная лампа (Л1), загорается индикаторный светодиод (Д2) и на рабочую колбу (Кн) подается выбранный сопротивлением (К1) постоянный ток в направлении сверху вниз. При переводе синхронного переключателя (П1) в положение 2 прибор отключается от сети переменного тока. При включении синхронного переключателя П1 в положение 3 включается индикаторная лампа (Л1), загорается индикаторный светодиод (Д3) и на рабочую колбу (Кн) подается выбранный
Рисунок 3. Внешний вид прибора и схематическое изображение рабочей кюветы заполненной культуральной средой.
Колба с культурой инфузорий представляет собой стеклянный цилиндрический сосуд диаметром 28 мм, высотой 200 мм, со штуцером и краном для слива в нижней части и кольцевыми электродами из нержавеющей стали в нижней и верхней частях сосуда. Расстояние между электродами 180 мм. Внешний вид прибора показан на рисунке 3.
Движение культуры Р. саис!аШт в приборе изучали следующим образом. В колбу помещали культуру инфузорий. Затем устанавливали заданное напряжение. После этого отмечали время начала движения клеток и следили за их перемещением. Инфузории двигались плотным облаком, лишь отдельные клетки значительно обгоняли основную массу, были и такие, которые отставали. С помощью секундомера отмечали время, в течение которого катода достигала первая из движущихся инфузорий, основная масса движущихся инфузорий и последняя из движущихся инфузорий. Зная расстояние между электродами, которое проходили инфузории (а = 18 см), рассчитывали скорости первой из движущихся клеток (Утах), основной массы инфузорий (У50) и последней из них (Утт). Напряжённость электрического поля определяли по формуле: Е = и/а, где и - заданное напряжение, В.
По результатам эксперимента построили график, приведённый на рисунке 4.
Полученные данные позволяют заключить, что электрическое поле в изученном диапазоне значений напряжённости не оказывает значительного влияния на абсолютную скорость движения каждой отдельной инфузории. Однако от напряжённости электрического поля существенно зависит траектория движения клеток, а следовательно, и скорость их миграции. Область оптимальных значений напряжённости лежит в пределах 1,5-2,0 В/см.
Процедура выделения биомассы инфузорий и её отмывки в разработанном нами приборе выглядит следующим образом. Культуру инфузорий помещают в сосуд, заполняя его до уровня на 5 мм выше верхнего электрода. Верхний электрод подключают к катоду, а нижний к аноду и замыкают цепь. Через 2 минуты, когда инфузории концентрируются в зоне катода, напряжение снимают, открывают кран и сливают культуральную жидкость в химический стакан, оставляя концентрированную биомассу в сосуде.
Затем сосуд заполняют промывным раствором Лозина-Лозинского и снова подают напряжение. Так повторяют многократно до требуемой очистки культуры инфузорий.
После этого вновь доливают в сосуд промывной раствор и меняют полярность электродов таким образом,
что нижний электрод становится катодом, а верхний -анодом. Подключают напряжение и после того как все инфузории концентрируются в зоне катода в нижней части сосуда, отмытую концентрированную культуру сливают в чистый химический стакан.
Трёхкратное повторение этой операции позволяет проводить отмывку культуры инфузорий от компонентов питательной среды в течение 15 минут в различных целях. Одной из таких целей является подготовка культуры инфузорий для работы приборов экологического контроля серии «Биотестер». Обычная процедура отмывки, использующаяся в настоящее время, занимает до 3-4 часов.
Разработанный прибор может применяться в экологических лабораториях, использующих инфузорий в своих исследованиях. Созданный прототип прибора может быть запущен в производство.
0.50
0.25 [ | | | | | | |
0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 2,50
Напряженность, В/см
— — Vmax,MM/c -------V50,mm/c — ■ -Vmin,MM/c
Рисунок 4. Зависимость скорости движения клеток от напряжённости электрического поля
Для моделирования процесса выращивания инфузорий в природных водоёмах использовали искусственный водоём объёмом 170 л, находящийся в уличных условиях и защищённый от попадания дождевой воды. Водоём заполнили природной водой, добавили сенной отвар из расчёта 1 кг сухого сена на 170 л конечного объёма. Подготовленную таким образом питательную среду инокули-ровали культурой P. caudatum и бактериями Bacillus sub-tilis (количество инокулята 5 л, концентрация клеток P. caudatum - 1400 кл./мл, Bac. subtilis - 6107 кл./мл). Процесс культивирования вели в августе месяце в течение 20 суток, при ежедневном перемешивании. Среднесуточная температура воздуха в этот период составляла +13°С.
В процессе культивирования инфузорий в искусственном водоёме было отмечено, что инфузории распределяются в толще воды не равномерно, а образуют скопления в виде крупноячеистой трёхмерной сети. По окончании культивирования, когда концентрация инфузорий составила 150 кл./мл, провели отделение биомассы инфузорий с помощью гальванотаксиса. В водоём поместили электроды из нержавеющей стали на расстоянии 30 см друг от друга. С помощью универсального источника питания на электроды подавали напряжение 50 В. В течение 3 часов через каждые пять минут в области катода отбирали концентрированную культуру инфузорий в сосуд объёмом 0,25 л. В итоге было отобрано 7 л культуры, концентрация инфузорий в которой составила 1600 кл./мл. На другой день вторично сняли урожай тем же методом, концентрация инфузорий в этом случае составила 2050 кл./мл. В течение 20 суток культивирования было получено 25,6 г сырой биомассы инфузорий (11,2 г - на 20-е сутки и 14,4 г - на 21-е сутки). Таким образом, предло-
женный нами метод выделения биомассы инфузорий из питательной среды может быть использован при культивировании инфузорий в природных водоёмах с периодическим снятием урожая. Эта технология может быть применена для получения пищевого белка высокого качества и готовых форм стартовых кормов для выращиваемой молоди рыб.
Выводы
1. При использовании гальванотаксиса инфузорий Paramecium caudatum в биотехнологических целях целесообразно применять электрические поля напряжённостью 1,5-2,0 В/см.
2. Разработана экспериментальная установка для отмывки культуры Paramecium caudatum методом гальванотаксиса, позволяющая снизить временные затраты на подготовку прибора серии «Биотестер» к работе.
3. Гальванотаксис может быть использован в качестве одного из методов выделения биомассы в биотехнологических производствах, основанных на культивировании подвижных простейших.
Литература
1. Простейшие - новые объекты биотехнологии: сб. науч. трудов. Л.: Наука. 1989. 148 с.
2. Хаусман К. Протозоология. М.: Мир. 1988. 336 с.
3. Кокова В.Е. Непрерывное культивирование простейших. Простейшие - новые объекты биотехнологии. Л.: Наука. 1989. С. 113-137.
