CC BY
69
© СОЛОДКОВ А.П., ЛАЗУКО С.С., 2004
ФУНКЦИЯ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ
СТРЕССЕ
СОЛОДКОВ А.П.*, ЛАЗУКО С.С.**
Витебский государственный медицинский университет, кафедра нормальной физиологии*,
Центральная научно-исследовательская лаборатория**
Резюме. Целью настоящей работы было выяснить стресс-индуцированные изменения функции различных типов калиевых каналов, проявляющиеся в модуляции сократительной активности гладкой мышцы аорты, вызванной простагландином F2a.
Опыты были проведены на 18 препаратах изолированного кольца аорты крыс линии Вистар. Стресс вызывали фиксацией крыс на спине в течение 6 часов. Для выяснения роли внутренне очищающих калиевых каналов К(и') в модуляции тонуса гладкой мышцы в раствор Кребса-Хензелайата добавляли простагландин F2a (4*10-6 М) и ионы бария (10-4 М). Блокаду кальцийактивируемых калиевых каналов KCa создавали введением в перфузионный раствор тетраэтиламмония в концентрации (10 мМ). Все эксперименты проводили до и после блокады синтеза NO L-NAME (10-4 мкМ) и циклооксигеназы индометацином (10-5 М).
Под влиянием иммобилизации в условиях блокады синтеза NO, К(гг) каналов, а также К(гг), КСа каналов наблюдался значительно меньший прирост напряжения, вызываемый П^2а. В аорте крыс, перенесших стресс, после блокады синтеза NO, он составил всего лишь 29% (в контроле - 230%), К(1г) - 44% (в контроле 83%) и сочетанного влияние бария и тетраэтиламмония - 84% (в контроле - 300%). На фоне блокады синтеза NO барий и тетраэтиламмоний оказывали более выраженный эффект, однако величина приростов напряжения была на 51% и 40%, соответственно, меньшей, чем в контроле после добавления L-NAME. Следовательно, под влиянием стресса снижается функциональная роль калиевых каналов, в отношении регуляции сократительной активности гладкой мышцы аорты, а блокада синтеза NO ограничивает, но не устраняет характерное для стресса падение тонуса сосудистой гладкой мышцы. Сочетание блокады синтеза NO и различных семейств калиевых каналов практически полностью устраняет постстрессорное снижение напряжения гладкой мышцы, но в значительно меньшей степени, чем в контроле повышает сократительную активность П^2а.
Таким образом, система калиевых каналов является мишенью действия длительного и интенсивного стрессорного воздействия, такого, как иммобилизация.
Ключевые слова: калиевые каналы, монооксид азота, гладкомышечная клетка, стресс.
Abstract. The aim of this work is to detect stress-induced changes of function of different types potassium channels, manifested in modulation of contractile activity of aorta smooth muscle evoked by F2a prostaglandin.
The experiments have been performed on 18 preparations of rat isolated aorta rings. The stress has been evoked by rat fixation in the back position during 6 hours. For detection of the role of inwardly rectifying potassium channels K (ir) in tone modulation of smooth muscle F2a prostaglandin (4*10-6 M) and Ba2+ (10-4 M) have been added to Krebs buffer. The blockade of Ca - activated KCa potassium channels has been evoked by addition of tetraethylammonium (10 mM) in concentration to the perfused solution.
All experiments have been conducted before and after blockade of L-NAME NO synthesis (10-4mkM) and cyclooxygenase by indomethacine (10-5M).
Under the influence of immobilization in conditions of NO synthesis blockade, K(ir) channels and K (ir), Kv KCa channels significantly smaller increase of tension, evoked by PG F2a has been observed. In rat aorta after stress influence, NO synthesis blockade, NO became 29% (in control - 230%), K(ir) - 44% (in control - 83%), as for the combined influence of Ba and tetraethylammonium - 84% (in control - 300%). On the base of blockade of NO synthesis Ba and tetraethylammonium have produced more expressed effect, but the value of tension was by 51% and 40% smaller, than in control after L-NAME addition, respectively.
Therefore, under stress influence the functional role of potassium channels in the relationship of contractile activity regulation of aorta smooth muscle dicreases, blockade of NO synthesis limits but not eliminates specific for stress tone falling of vascular smooth muscle. The combination of blockade of NO synthesis and different families of potassium channels practically eliminates the poststressor reduction of smooth muscle tension but to significantly smaller degree than in control it elevates PG F2a contractile activity.
Hence, the system of potassium channels is the target of action of prolonged and intensive stressor influence such as immobilization.
В 1980 г. было показано, что эндотелий вносит существенный вклад в снижение сосудистого тонуса [10, 13]. В 1984 г. Болтон и др. [6] впервые продемонстрировали, что стимуляция эндотелия сосудов вызывает гиперполяризацию и расслабление гладкой мышцы мезентериальной артерии морской свинки. В то же время, эндотелиальный N0 способен гиперполяри-зовать гладкую мышцу лишь в некоторых сосудах. Позже стало очевидным, что подобную гиперполяризацию вызывает и простациклин [14].
Однако то обстоятельство, что в условиях блокады синтеза N0 и простагландинов стимуляция эндотелия многих сосудов все же способна вызвать гиперполяризацию сосудистых гладких мышц, послужило основанием назвать это соединение неизвестной природы эндотелиальным фактором гиперполяризации (ЕВИБ). В соответствии с этим N0, эйкозанои-ды и эндотелиальный фактор гиперполяризации (ЕВИБ) были идентифицированы как главные релаксирующие факторы эндотелиального происхождения.
Высвобождающиеся из эндотелиоцитов ионы К+, продукты Р-450 монооксигеназного пути (ЕЕТ), пероксид водорода и др. субстанции способны вызывать гиперполяризацию подлежащих гладкомышечных клеток, активируя К1г-каналы, №+/К+ АТФ-азу и/или ВКСа (кальцийактивируемые калиевые каналы большой проводимости), обнаруженные в их мембране [7, 8, 15, 17]. Образующийся под влиянием N0 ц-ГМФ в некоторых сосудах также способен их активировать [9, 16]. Активация калиевых каналов гладкомышечной клетки сопровождается закрытием потенциалзависимых кальциевых каналов, уменьшением входящего внутрь клетки кальция и снижением сократительной активности гладкой мышцы [9]. Таким образом, стало очевидным, что калиевые каналы гладкомышечных клеток имеют важное значение в регуляции силы сокращения гладкой мышцы, вызываемого различными вазоконстрикторами.
Методически эндотелийзависимое расслабление изолированных сосудов изучается на препаратах с предварительно повышенным на-
Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр.Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра нормальной физиологии - Солодков А.П.
пряжением при помощи одного из спазмогенов (норадреналин, фенилэфрин, простагландин F2a). При этом агонист вызывает деполяризацию и/или открытие кальциевых каналов сар-коплазматического ретикулума гладких мышц сосуда, которые сопровождаются увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. В свою очередь, это стимулирует выход калия из гладкого миоцита через кальцийзависимые калиевые каналы, что создает увеличение концентрации этих ионов на внеклеточной поверхности его мембраны («калиевое облако») [8]. Повышение внеклеточной концентрации ионов калия активирует Na/K-насос и Юг каналы, что в конечном итоге может приводить к гиперпо-лялризации и ослаблению эффекта вазоконстриктора. Следовательно, ингибируя в этих условиях различные калиевые каналы, можно определить их вклад в регуляцию тонуса сосудов.
Известно, что избыточная продукция NO может приводить к угнетению сердечной деятельности, вазоконстрикторных реакций на адренореактивные стимулы и глубокому, нередко необратимому падению артериального давления не только при септическом [4], анафилактическом [12], кардиогенном [2], геморрагическом [11], тепловом [3] и других видах шока, но и при стрессе [5]. Не исследованным остается вопрос о влиянии длительного стрес-сорного воздействия на вклад Kir (внутренне очищающих), кальцийактивируемых калиевых каналов в условиях постстрессорных изменений эндотелийзависимого расслабления и сократительной активности гладкой мышцы.
Целью настоящей работы было выяснить стресс-индуцированные изменения функции различных типов калиевых каналов, проявляющиеся в модуляции сократительной активности гладкой мышцы аорты, вызванной простагландином F2a.
Методы
Опыты были проведены на 18 препаратах изолированного кольца аорты крыс линии Ви-стар. Животных разделили на две группы: кон -трольные (n=8) и перенесшие стресс (n=10). Стресс вызывали фиксацией крыс на спине в течение 6 часов. После чего их освобождали и на 90 минут помещали в клетку.
Каждому животному внутрибрюшинно вводили гепарин (500 ед/кг) и затем под урета-новым наркозом (1 г/100 г веса тела) вскрывали грудную клетку, удаляли сердце, легкие, от-препаровывали грудную аорту, иссекали ее фрагмент длиной 15-20 мм и помещали его в охлажденный до 4°С раствор Кребса-Хензелай-та. В охлажденном растворе фрагмент аорты тщательно очищали от жировой и соединительной ткани и лезвием вырезали кольцевой сегмент шириной 3 мм. Один конец кольцевого сегмента аорты жестко фиксировали, а другой прикрепляли к рычажку датчика силы, в качестве которого использовали механотрон 6МХ1С. Препарат функционировал в изометрическом режиме [1]. Приготовленный таким образом кольцевой сегмент аорты помещали в термостатируемую ванночку объемом 27 мл, заполненную раствором Кребса-Хензелайта рН-7,4 при температуре 37°С. Раствор насыщали карбогеном (95% О2 и 5% СО2). Регистрацию напряжения препарата осуществляли при помощи потенциометра КСП-4. Исходное напряжение кольца аорты равнялось приблизительно 2 г. В течение периода стабилизации (60-80 мин.) раствор Кребса-Хензелайта, омывающий препарат аорты, обновляли каждые 15 минут.
Для выяснения роли внутренне очищающих калиевых каналов К(п) в модуляции тонуса гладкой мышцы в перфузионный раствор до-
бавляли простагландин F2a (4*10-6М) и затем ионы бария (10-4 М). Блокаду кальцийактиви-руемых KCa калиевых каналов создавали введением таким же образом в перфузионный раствор высокой концентрации тетраэтиламмо-ния (10 мМ) [16]. Все эксперименты проводили до и после блокады синтеза NO L-NAME (10-4 мкМ) и циклооксигеназы индометацином (ю-5М).
Прирост напряжения (развиваемое напряжение) рассчитывали как разницу между максимальным и исходным напряжением, выраженным в мг.
Цифровой материал обработали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
Все химреактивы были получены из Sigma и Aldrich (USA).
Результаты и обсуждение
Влияние ионов бария и тетраэтиламмо-ния на вызываемый простагландином F2a прирост напряжения контрольных колец аорты до и после блокады синтеза NO и про-стагландинов.
В контрольной группе до и после блокады синтеза NO исходное напряжение кольца аорты не различалось и составляло 2064+78 мг и 1971+24 мг, соответственно.
мг 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Контроль PGF2a Контроль PGF2a 4х10-6 4х10-6 + инд.+
NAME
□ Прирост напряжения после введения PGF2a
Прирост напряжения после L-NAME
Прирост напряжения после введения Ва-2(10-4М)
Прирост напр. после совместного введения ТЭА(10-2М) и ионов Ва-2 (10-4М)
Рис. 1. Прирост напряжения изолированного кольца аорты крысы, вызываемый простагландином Б2а на фоне блокады синтеза N0, введения ионов бария (10-4М) и их сочетание с тетраэтиламмонием (10-2 М); * - р<0,05 по сравнению со значением прироста напряжения аорты, полученного после введения только простагландина Б2а.
Добавление ПГБ2а (4*10-6 М) в условиях интактной системы синтеза N0 приводило к увеличению напряжения кольца аорты на 851+77 мг, а на фоне Ь-ЫАМЕ и индометацина его пророст был в 2,3 раза больше и составил 1951+61 мг (р<0,01) (рис. 1).
В условиях нормального синтеза N0 после добавления в перфузионный раствор блока-тора внутренне очищающих калиевых каналов (10-4 М ионов бария) прирост напряжения аорты, вызываемый ПГБ2а, увеличился на 708 мг по сравнению с действием только простаглан-дина Б2а и составил 1559+77 мг. В условиях блокады синтеза N0 под влиянием ионов бария прирост напряжения аорты, вызываемый ПГБ2а, увеличился на 829 мг (р>0,05) и равнялся 2780+385 мг (р<0,05).
Совместное добавление ионов бария и тетраэтиламмония (неспецифическая блокада большинства калиевых каналов) приводило к тому, что под влиянием ПГБ2а прирост напряжения аорты как в условиях интактного синтеза N0, так и блокады его синтеза оказался самым существенным и составлял в контроле 2518+351 мг и при добавлении Ь-ЫАМЕ и индометацина - 3286+268 мг (р<0,05).
Следовательно, блокада синтеза N0 увеличила констрикторный эффекта ПГБ2а в 2,3 раза, блокада К1г калиевых каналов - на 83%,
Юг и кальцийактивируемых калиевых каналов (так же, как и ингибирование синтеза NO) увеличила прирост напряжения, вызываемый ПГБ2а, в 2раза. Таким образом, вклад различных калиевых каналов в регуляцию сократительной активности сосудистой гладкой мышцы не менее важен, чем NO, высвобождаеого сосудистым эндотелием.
Сочетанная блокада синтеза NO и Kir калиевых каналов, а также NO и большинства калиевых каналов привела к увеличению прироста напряжения контрольного сегмента аорты в 3,3 и в 3,9 раза, по сравнению с действием только ПГБ2а в условиях интактной системы синтеза NO.
Следовательно, блокада синтеза NO усиливает блокирующий эффект ионов Ва+2 и тет-раэтиламмония в отношении калиевых каналов и снижает их противодействие констрикторно-му эффекту ПГБ2а.
Влияние иммобилизационного стресса на величину вызываемого простагландином F2a прироста напряжения кольца аорты, наблюдаемого при добавлении ионов бария, тетраэтиламмония до и после блокады синтеза NO и простагландинов.
Под влиянием иммобилизации в условиях блокады синтеза NO и простагландинов, К(п)
мг 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Стресс 6 ч. PGF2a 4х10-6 Стресс 6 ч. PGF2a 4х10-6+
инд.+ NAME
□ Прирост напряжения после введения PGF2a
Прирост напряжения после L-NAME
Прирост напряжения после введения Ва-2(10-4М)
I Прирост напр.после совместного введения ТЭА(10-2М) и ионов Ва-2 (10-4 М)
*
Рис. 2. Влияние 6-часового иммобилизационного стресса на прирост напряжения изолированного кольца аорты крысы, вызываемый простагландином Б2а на фоне блокады синтеза N0, введения ионов бария (10-4М) и их сочетания с тетраэтиламмонием (10-2 М); * - р<0,05 по сравнению со значением прироста напряжения аорты, полученного после введения только простагландина Б2а.
мг
3000
Контроль PGF2a Стресс 6 ч. 4х10-6 PGF2a 4х10-б
Контроль PGF2a Стресс 6 ч. PGF2a 4х10-б +инд. 4х10-б +инд.
+NAME +NAME
□ Прирост напряжения после введения PGF2a
■ Прирост напряжения после L-NAME
■ Прирост напряжения после введения Ва-2(10-4М)
И Прирост напр. после совместного введения ТЭА(10-2М) и ионов Ва-2 (10-4М)
Рис. 3. Сравнение влияния 6-часового иммобилизационного стресса на прирост напряжения изолированного кольца аорты крысы, вызываемый простагландином F2a после введения ионов бария (10-4М) и их сочетания с тетраэтиламмонием (10-2 М) до и после блокады синтеза NO, простагландинов, * - р<0,05 по сравнению с данным значением прироста напряжения аорты в контроле, полученным после введения только простагландина F2a.
мг
каналов, а также КСа каналов наблюдался значительно меньший прирост напряжения, вызываемый ПГБ2а (рис. 2, 3). В аорте крыс, перенесших стресс, после блокады синтеза NO, он составил всего лишь 29% (в контроле - 230%), К(1г) - 44% (в контроле 83%) и сочетанного влияние ионов бария и тетраэтиламмония - 84% (в контроле - 3 00%). На фоне блокады синтеза NO барий и тетраэтиламмоний оказывали более выраженный эффект, однако величина приростов напряжения была на 51% и 40%, соответственно, меньшей, чем в контроле после добавления L-NAME и индометацина.
Следовательно, под влиянием стресса снижается функциональная роль калиевых каналов, в отношении регуляции сократительной активности гладкой мышцы аорты, а блокада синтеза NO ограничивает, но не устраняет характерное для стресса падение тонуса сосудистой гладкой мышцы. Сочетание блокады синтеза NO и различных семейств калиевых каналов практически полностью устраняет пост-
стрессорное снижение напряжения гладкой мышцы, но в значительно в меньшей степени, чем в контроле, повышает сократительную активность ПГF2a.
Таким образом, становится очевидным, что NO, а также К(іг), КСа каналы гладкомышечной клетки представляют собой систему противодействия сокращению, вызываемому вазоконстрикторами. Кроме того, система калиевых каналов является мишенью действия длительного и интенсивного стрессорного воздействия, такого, как иммобилизация.
Обращает на себя внимание тот факт, что в отличие от контроля, после иммобилизационного стресса, блокирующий эффект L-NAME и индометацина оказывается менее сильным, чем действие ионов бария. Это дает основание полагать, что в регуляции сократительной активности гладкой мышцы после стресса не менее важную роль, чем монооксид азота играют внутренне очищающие, а также другие виды калиевых каналов (возможно, КСа)
Применяемая нами доза (10мМ) тетраэтиламмония неселективно блокирует КСа каналы [16], тем самым выявляя их функциональное значение. Известно, что монооксид азота имеет важное значение в регуляции функциональной активности К каналов. В связи с этим
Са
можно предположить, что характерное для стресса увеличение в эндотелии, а, возможно, и в гладкомышечных клетках продукции NO вносит существенный вклад в модуляцию функциональной активности калиевых каналов. Кроме того, в последнее время стало известно, что при стрессе снижается количество восстановленного глютатиона. Это также способно оказывать влияние на функцию калиевых каналов. В связи с этим можно заключить, что 6часовая иммобилизация сопровождается как повышением напряжения систем подавления кон-стрикторного потенциала гладкой мышцы, так, по-видимому, снижением сократительной активности гладкой мышцы, что, очевидно, имеет важное значение в предупреждении развития стресс-индуцированного повышения тонуса, а, возможно, и спазма артериальных сосудов. На основании вышесказанного можно предположить, что только сочетанное нарушение продукции эндотелиального NO и функции системы калиевых каналов гладкомышечных клеток может быть причиной критического сужения просвета артериальных сосудов, способного привести к нарушению кровоснабжения органа.
Литература
1. Блатнер Р., Классен Х., Денерт Х. и др. Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц // М.: Мир. - 1983.- С.208.
2. Ванин А.Ф., Манухина Е.Б., Лапшин А.В. и др. Усиление синтеза оксида азота в стенке аорты при экспериментальном инфаркте миокарда // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1993. - №8. - С. 142-144.
3. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Микоян В. Д. и др. Увеличение продукции оксида азота в органах крысы при тепловом шоке // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1996. - №5. - С.520-523.
4. Стокле Ж.-К., Мюллер Б., Андрианцитохайна Р., Кле-щев А. Гиперпродукция оксида азота в патофизиоло-
гии кровеносных сосудов // Биохимия. - 1998. - Т.7. - С.976-983.
5. Ульянинский Л.С., Медведев О.С., Бунятян А.М. и др. Изменение гемодинамики при иммобилизацион-ном стрессе // Бюлл. эксперим. биол. мед.- 1985.-№9.- C.262-265.
6. Bolton T.B., Lang R.J., Takewaki T. Mechanisms of action
of noradrenaline and carbachol on smooth muscle of guinea-pig anterior mesenteric artery // J. Physiol. - 1984. Vol.351. - P.549-572.
7. Edwards G., Dora K.A., Gardener M.J., Garland C.J. et al. K+ is an endothelium-derived hyperpolarrizing factor in rat arteties // Nature.- 1998.-Vol.396. - P.269-272.
8. Edwards G., R.R. Gillian, M.J. Gardener et al. Roles of the inward-rektifier K+ channel and Na+/K+-ATP-ase in the hyperpolarization to K+ in rat mesenteric arteries // EDHF 2002. -2003 - P.309-317.
9. Gauthier K. M., N.J. Rusch Potassium channels and membrane potential in vascular endothelial and smooth muscle cells // EDHF 2002.-Edited by Paul M.Vanhoutte.-Taylor & Francis, 2003. - P.256-260.
10. Furchgott R.F., Zavadzki J.V The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smoth muscle by acetylcholine // Nature.- 1980.- Vol.299. -P.373-376.
11. Koch M.A., Hasser E.M., Schadt J.C. Influence of nitric oxide on the hemodynamic response to hemorrhage in conscious rabbits // Am. J. Physiol. - 1995.
12. Mitsuhata H., Takeuchi H., Saitoh J. et al. An inhibitor of nitric oxide synthase, N(omega)-nitro-L-arginine-nethyl ester, attenuates hypotension but does not improve cardiac depression in anaphylaxis in dogs // Shock. -1995. - Vol.3. - P.447-453.
13. Nagao T.,Vanhoutte P.M Endothelium-derived hyperpolarizing factor and endothelium-dependent relaxation // Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.- 1993.- Vol. 8.-P. 1-6.
14. Parkington H.C., Chow J.M., Evans R.G. et al. Role for endothelium derived hyperpolarizing factor in vascular tone in rat mesenteric and hindlimb circulations in vivo // J. Physiol. - 2002. - Vol.542. - P.929-937.
15. Taddei S., Ghiadoni L., Virdis A. et al. Vasodilation to bradykinin is mediated by an ouabain-sensitive pathway as a compensatory mechanism for impaired nitric oxide availability in essential hypertensive patients // Circulation. - 1999. - Vol.100. - P. 1400-1405.
16. Vanhoutte P. I M. Endothelium-derived free radicals: for
worse and for better // J. Clin. Ivestig. - 2001. - Vol.107. № 1. - P.23-25.
17. Widman M.D., Weintraub N.L., Fudge J.L. et al. Cytochrome P-450 pathway in acetylcholine-induced canine coronary microvascular vasodilation in vivo // Am. J.Physiol. - 1998. - Vol.274. - P.H283-H289.
Поступила 18.06.2004 г. Принята в печать 25.06.2004 г.
