CC BY
69
■ ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Меньшикова Н.С.
Сибирский государственный медицинский университет
г. Томск
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ
ИММУНОСУПРЕССОРНЫХ ЦИТОКИНОВ
ПРИ НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ
Наружный генитальный эндометриоз сопровождается повышением концентрации иммуносупрессорных цитокинов IL-10 и TGF-в в сыворотке крови. Высокий уровень IL-10 ассоциирован с генотипомАА и аллелемА полиморфизма С-592А гена IL10, а TGF-P - с генотипом ТТ и аллелемТ полиморфизма С-509Т гена TGFB. У женщин-носительниц генотипов АА полиморфизма С-592А гена IL10 и ТТ полиморфизма С-509Т гена TGFB риск развития генитального эндометриоза статистически значимо выше, чем у здоровых женщин.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: наружный генитальный эндометриоз; интерлейкин-10;
трансформирующий фактор роста-бета; полиморфизм генов цитокинов.
Menshikova N.S.
Siberian State Medical University, Tomsk
FUNCTIONAL POLYMORPHISM GENES IMMUNOSUPPRESSIVE CYTOKINES IN EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS
External genital endometriosis is associated with increase of immunosuppressive cytokines IL-10 and TGF-P concentration in blood serum. High level of IL-10 is associated to genotype AA and allele A of С-592А polymorphism IL10 gene, and TGF-P to genotype TT and allele T of С-509Т polymorphism TGFB gene. Female bearers of the given genotypes AA polymorphism С-592Agenes IL10 and TT polymorphism С-509Т genes TGFB are rather more statistically amenable to genital endometriosis in comparison to salutary females.
KEY WORDS: external genital endometriosis; interleukin-10; transforming factor of growth-beta; cytokine gene polymorphisms.
Несмотря на существенные достижения отечественной и зарубежной медицины и фармакологии, эндометриоз является одной из ведущих проблем современной медико-биологической науки. В структуре гинекологической заболеваемости эта патология занимает третье место. Частота эндометриоза среди женщин репродуктивного возраста колеблется в пределах 7-59 % [1, 2]. Многообразие локализаций очагов эндометриоза лежит в основе нескольких гипотез о его происхождении. Современные исследователи склонны расценивать рост очагов эндометриоза как результат иммуносупрессии. Одной из возможных причин распространения, инвазии и гиперпролиферации эндомет-риоидных гетеротопий служит повышение уровня имуносупрессорных цитокинов — интерлейкина (IL)-10 и трансформирующего фактора роста-бета (TGF-Р). Установлено, что гены цитокинов, для большинства из которых описан аллельный полиморфизм, являются важнейшими генами-регуляторами, контролирующими иммунный ответ. Наиболее часто встречающиеся аллельные варианты генов цитоки-нов образуются в результате мутаций, затрагивающих некодирующую область генов, в результате чего структура белкового продукта остается прежней, а изменяется уровень экспрессии и количество
Корреспонденцию адресовать:
МЕНЬШИКОВА Наталья Сергеевна,
634050, г. Томск, Московский тракт, 2,
ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.
Тел.: +7-913-884-38-32.
E-mail: natali100583@mail.ru
самого цитокина, нарабатываемого иммунокомпе-тентными клетками [3-6].
Цель исследования — изучить распределение аллельных вариантов и генотипов генов ^10и TGFВ, оценить их ассоциацию с концентрацией соответствующих цитокинов (^-10 и TGF-p) в сыворотке крови у женщин с наружным генитальным эндометриозом.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В программу исследования вошли 300 женщин репродуктивного возраста, находившихся на стационарном лечении в гинекологической клинике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Основную группу составили 200 женщин с наружным генитальным эндометриозом, подтверждённым при лапароскопии. В группу контроля были включены 100 женщин, которым проводилась диагностическая лапароскопия по поводу синдрома хронической тазовой боли, бесплодия, и у которых не было выявлено органической патологии, а также женщины, которым проводилась добровольная хирургическая стерилизация.
Всем женщинам была проведена лапароскопия по стандартной методике и последующим гистологическим исследованием операционного материала. У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор венозной крови и использование её для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетического исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при -70°С до момента использования.
№1(52) 2013 с/^иь и^пя вс7|узбассе
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИММУНОСУПРЕССОРНЫХ _______ЦИТОКИНОВ ПРИ НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ
Для оценки уровня IL-10 и TGF-P в сыворотке крови использовали твердофазный иммунофермен-тный «сэндвичевый» метод (ELISA), который проводили по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем. Выделение ДНК из периферической крови проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В». Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической амплификации специфических участков генома. Были исследованы полиморфные варианты генов цитокинов C-592A гена IL10 (rs1800872) и С-509Т гена TGFB (rs1800469). Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к набору «АмплиСенс-200-1», в пробирках типа «Эппендорф» путём полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе с применением амплификатора «Терцик МС2». После проведения ПЦР 8 мкл амплификата разделяли в 2 % агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этутиума бромида, при напряжении 150 В в течение 10 минут для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду риС19, расщеплённую рестриктазой Mspl.
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных алгоритмов биометрии. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Средний возраст пациенток составил 30 ± 1,26 лет. Больные эндометриозом женщины предъявляли жалобы на тазовую боль, дисменорею, диспареунию и бесплодие. Так, на тазовую боль жаловались 57,1 % женщин, на дисменорею — 28,9 % и диспареунию — 17,7 %. Жалобы на бесплодие предъявляли 101 женщина. Первичное бесплодие встречалось у 45,2 % женщин, а вторичное — у 16,1 %.
Было проведено изучение распределения аллельных вариантов промоторных регионов генов имму-носупрессорных цитокинов, а также степени их ассоциации с уровнем продукции соответствующих белковых продуктов при генитальномэндометриозе.
Иммуногенетический анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма С-592А промотор-ного участка гена ^10 позволил установить, что у женщин с эндометриозом значимо чаще встречались носители гетерозиготного генотипа СА (34 %) и были обнаружены носители редкого гомозиготного генотипа АА (13,5 %) промоторного участка С-592А гена ^10. Редкий аллель А также статистически значимо был выше, чем аналогичный показатель у женщин без ГЭ. Кроме того, была показана положительная ассоциация генотипа АА (OR = 31,86) и аллеля А (OR = 3,95) с заболеванием и защитная роль генотипа СС (OR = 0,28) в отношении генитального эндометриоза.
В результате проведенного нами иммунофермен-тного анализа было установлено статистически значимое увеличение концентрации ^-10 (28,85 пг/мл) у женщин с наружным генитальным эндометриозом по сравнению с аналогичными показателями женщин без эндометриоза (11 пг/мл, р < 0,05).
Для гена ^10, который находится в промотор-ном участке первой хромосомы человека (^31^32), описан функциональный полиморфизм С-592А. Определение концентрации ^-10 в сыворотке крови в зависимости от аллельного полиморфизма С-592А гена ^10 показало, что у женщин, больных эндо-метриозом, по всем генотипам уровень данного ци-токина значимо превышал его содержание у женщин без эндометриоза (р < 0,001).
При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного сайта С-509Т гена TGFB было выявлено, что у женщин с генитальным эндометрио-зом имелись значимые различия в распределении аллеля Т и генотипа ТТ (32,5 % и 13 %, соответственно) относительно аналогичных параметров у женщин контрольной группы (соответственно, 22,5 % и 5,5 %). Кроме того, была выявлена положительная ассоциация аллеля Т (OR = 1,66) и генотипа ТТ (OR = 2,34) полиморфизма С-509Т гена TGFB с заболеванием.
Иммуноферментный анализ позволил зарегистрировать, что у женщин с наружным генитальным эн-дометриозом содержание TGF-p (911,94 пг/мл) в сыворотке крови было статистически значимо (р < 0,001) выше, чем у женщин без эндометриоза (605,89 пг/мл).
Аллельные варианты полиморфизма C-509T гена TGFB, находящегося в девятнадцатой хромосоме (19q31.1), могут вызывать разные фенотипические эффекты. В группе женщин с генитальным эндомет-риозом у гомозигот по аллелю Т отмечалась максимальная (1113,45 пг/мл), а у гомозигот по аллелю С — минимальная концентрация TGF-p (875,55 пг/мл), однако эти показатели были значимо выше аналогичных группы контроля (р < 0,05).
Сведения об авторах:
МЕНЬШИКОВА Наталья Сергеевна, врач акушер-гинеколог, акушерская клиника, соискатель кафедры патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: natali100583@mail.ru
Information about authors:
MENSHIKOVA Natalia Sergeevna, obstetrician-gynecologist, obstetric clinic, candidate of pathophysiology department, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: natali100583@mail.ru
с^яъ11^пяъ(У^з6зссе №1(52) 2013
■ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИММУНОСУПРЕССОРНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ_______
Таким образом, зафиксированная нами генетически детерминированная повышенная концентрация иммуносупрессорных цитокинов ведёт,с одной стороны, к формированию иммуносупрессии и неадекватному иммунному ответу. Происходит угнетение пролиферации и функций иммунокомпетентных клеток: цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов (и, следовательно, синтез ими перфоринов и гранзимов), Т-хелперов 1 и 2 типа (что препятствует индукции и реализации Т-зависимых реакций), макрофагов (ингибируется продукция ими как цитокинов, так и реактивных соединений азота и кислорода), естественных киллеров и лимфокинактивированных клеток. Происходит смещение баланса в сторону ТЬ2-пути, неэффективного в отношении наружного генитального эндометриоза [4]. Также угнетается секреция иммуноглобулинов активированными В-лимфоцитами и синтез цитокинов Т-клетками [3]. Ослабление иммунного надзора создает благоприятные условия для инвазии, имплантации и развития функциональных очагов эндометрия вне их нормальной локализации.
С другой стороны, повышенный уровень TGF-P, обнаруженный нами у женщин с генитальным эндо-метриозом, может лежать в основе избыточной про-
лиферации фрагментов эктопированного эндометрия и формирования спаечного процесса, способствующего развитию бесплодия и хронических тазовых болей. Поскольку известно, что TGF-P — противовоспалительный цитокин с иммуносупрессивным эффектом, участвующий в процессах тканеобразования, репарации, усиливающий рост фибробластов и синтез коллагена [5, 7, 8].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Течение генитального эндометриоза сопровождается повышением концентрации иммуносупресорных цитокинов ^-10 и TGF-P в сыворотке крови. Повышенное содержание ^-10 ассоциировано с генотипом АА (С-592А) гена ^10, а TGF-p — с генотипом ТТ (С-509Т) гена TGFB. Также выявлена протек-тивная роль генотипа СС (OR = 0,28) полиморфизма С-592А гена ^10 в отношении генитального эндометриоза. Риск развития генитального эндометриоза ассоциирован с генотипом АА (OR31,86) и аллелем А (OR = 3,95) полиморфного сайта С-592А гена ^10 и генотипом ТТ (OR = 2,34) и аллелем Т (OR = 1,66) полиморфизма С-509Т гена TGFB.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Адамян, Л.В. Эндометриозы /Л.В. Адамян, В.И. Кулаков, Е.Н. Андреева. - М., 2006. - 416 с.
2. Полиморфизм одиночных нуклеотидов в генах цитокинов и их рецепторов: биологический эффект и методы идентификации /Д.Д. Абрамов, И.А. Кофиади, К.В. Уткин и др. //Иммунология. - 2011. - Т. 32, № 5. - С. 275-280.
3. Эндометриоз: от трудности диагностики к новым возможностям терапии /В.Н. Прилепская, Е.В. Иванова, А.В. Тагиева, А.Б. Летунов-ская //Гинекология. - 2012. - Т. 14, № 4. - С. 4-9.
4. Interleukin-10 gene promoter polymorphisms and their protein production in peritoneal fluid in patients with endometriosis /X. Zhang, P. Hei, L. Deng et al. //Mol. Hum. Reprod. - 2007. - V. 13. - P. 135-140.
5. Role of TGF-betas in normal human endometrium and endometriosis /C.O. Omwandho, L. Konrad, G. Halis et al. //Hum. Reprod. - 2010. -V. 25. - P. 101-109.
6. Transforming growth factor-p1 gene polymorphisms in Korean women with endometriosis /H.J. Lee, H. Kim, S.Y. Ku et al. //Am. J. Reprod. Immun. - 2011 . - V. 66. - P. 428-434.
7. Vassiliadis, S. The endometriotic stem cell and known immunological processes as stepping stones for the onset of endometriosis: a novel theory /S. Vassiliadis, I. Athanassakis, I.M. Matalliotakis //New Developments in Endometriosis /eds. I. Matalliotakis, A. Arici. USA, 2011. -Ch. 4. - P. 116-143.
8. Zhang, F. Association between TGF-p1-509C/T polymorphism and endometriosis: a systematic review and meta-analysis /Y. Yang, Y. Wang //Eur. J. Obstet. Gynec. Reprod. Biol. - 2012. - V. 164. - P. 121-126.
№1(Б2) 2013 с/^иь и^пя вс7|узбассе
