CC BY
110
УДК 618.177-06:618.14-002]-08-035.7-097 Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
Т. А. АГАРКОВА, К. С. КУБЛИНСКИЙ, И. Д. ЕВТУШЕНКО, И. О. НАСЛЕДНИКОВА, В. Н. ТКАЧЕВ, В. В. НОВИЦКИЙ, М. Г. СКОРОХОДОВА
НЕУДАЧИ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ, АССОцИИРОВАННОГО С ЗНДОМЕТРИОЗОМ: иммуногенетические аспекты
Кафедра акушерства и гинекологии, кафедра патофизиологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации,
Россия, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: agarkina@mail.ru
Проведены клиническое и молекулярно-генетическое обследования и лечение 150 больных с генитальным эндометри-озом, страдающих бесплодием. Комплексное лечение включало применение хирургического лапароскопического метода и гормональных препаратов (агонисты гонадотропин-рилизинг-гормонов, комбинированные оральные контрацептивы). Низкая эффективность лечения бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, связана с носительством рисковых генотипов: АА и GA полиморфизма G-308A гена TNFA.
Ключевые слова: бесплодие, генитальный эндометриоз, фактор некроза опухолей - альфа, трансформирующий фактор роста - бетта, полиморфизм генов цитокинов.
T. A. AGARKOVA, К. S. KUBLINSKY, I. D. EVTUSHENKO, V. N. TKACHEV,
V. v. NOVITSKY, M. G. SKOROHODOVA
THE FAILURES OF ENDOMETRIOSIS ASSOCIATED INFERTILITY TREATMENT: IMMUNOGENETIC ASPECTS
Department of obstetrics & gynecology, department of pathophysiology, Siberian state medical university of the Russian Federation Ministry of healthcare & social development,
Russia, 634050, Tomsk, Moscovsky tract, 2. E-mail: agarkina@mail.ru
Clinical and molecular-genetic analysis and treatment of 150 patients with genital endometriosis and infertility were made. Complex treatment included laparoscopic surgery and hormonal therapy (agonists of gonadotropin releasing hormones, combined oral contraceptives). Law efficiency of endometriosis associated infertility treatment correlates with the risk genotype AA and GA polymorphism of G308A gen TNFA.
Key words: infertility, genital endometriosis, tumor-alpha necrosis factor, transforming factor of growth-beta, cytokine gens polymorphism.
Бесплодие является одной из важнейших проблем в гинекологии и относится к тяжелым состояниям, нарушающим социальную и психологическую адаптацию женщины, влияющим на здоровье и качество жизни. Удельный вес женского бесплодия колеблется в пределах 60-70%. Ассоциация эндометриоза с бесплодием отмечается многими исследователями, изучающими данную проблему [1, 2, 6, 7, 10].
Несмотря на актуальность и большое количество предположений, однозначного и удовлетворительного объяснения увеличения частоты бесплодия у пациенток с эндометриозом до сих пор не существует. Кроме того, частота наступления беременности у женщин с бесплодием, ассоциированным с эндометриозом, после проведения курса лечения не превышает 30-33% [3, 10], что требует углубления исследований и поиска новых стратегий, направленных на повышение эффективности лечения.
Бесплодие при эндометриозе обусловлено нарушениями в иммунной системе, которые могут опосредоваться несколькими путями. Инфертильность может развиваться из-за повышенного фагоцитоза макрофагами сперматозоидов и яйцеклеток. В свою очередь,
повышенное содержание макрофагов в перитонеальной жидкости обусловлено развитием воспаления, вызванного присутствием самих гетеротопий, а активация фагоцитарной активности обусловлена наличием повышенного содержания ионов железа, попадающих в брюшную полость с ретроградной менструацией, наличием антител к фосфолипидам, эндометрию и сперматозоидам [2, 3, 7, 9, 11].
Еще одна причина бесплодия при эндометриозе -количественные изменения в цитокиновой системе. В перитонеальной жидкости у женщин с эндометрио-зом и бесплодием значительно повышен уровень ингибитора миграции макрофагов, что способствует росту гетеротопий. Сами гетеротопии секретируют специфические вещества, стимулирующие макрофагально-макроцитарную систему, в результате чего происходит изменение уровня интерлейкинов (^), фактора некроза опухолей, факторов роста [2, 3, 11].
Фактор некроза опухолей - альфа (TNF-a) - один из основных провоспалительных цитокинов, с одной стороны, регулирующий нормальную дифференцировку, рост и метаболизм разных клеток, а с другой - выступающий в роли медиатора патологических иммуново-
спалительных процессов при различных заболеваниях человека [5]. При эндометриозе показано повышение содержания TNF-a и других факторов роста в перитонеальной жидкости [8]. Трансформирующий фактор роста - бетта (TGF-p) - полипептидный полифункци-ональный фактор роста, участвующий в процессах тканеобразования, репарации, роста фибробластов и синтеза коллагена, с иммуносупрессивным и противовоспалительным действием. Установлено, что при развитии патологии TGF-p является основным медиатором формирования фиброза [8, 9], с чем связывают возможную роль цитокина в патогенезе эндометриоза.
Методами молекулярной медицины было установлено, что гены цитокинов характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые оказывают влияние на функциональную активность или уровень экспрессии кодируемых белков [5]. В связи с этим цель настоящего исследования -оценить эффективность медикаментозного лечения бесплодия, ассоциированного с эндометриозом, в зависимости от иммуногенетических особенностей организма пациенток.
Материалы и методы исследования
В программу исследования вошли 215 пациенток репродуктивного возраста от 23 до 37 лет (средний возраст 29,2±2,4 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России в 2009-2012 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Показанием к оперативному вмешательству явилось бесплодие. Основную группу составили 150 пациенток (70%) с эндометриозом, страдающих бесплодием, у которых был исключен трубно-перитонеальный фактор бесплодия при проведении лечебно-диагностической лапароскопии. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования с последующим гистологическим подтверждением. Группа сравнения была сформирована из 65 пациенток (30%) с бесплодием различной этиологии, которым была выполнена диагностическая лапароскопия и исключены трубно-перитонеальный фактор бесплодия и генитальный эндометриоз. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия).
У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при -70° С до момента исследования. Содержание цитокинов (TNF-a и TGF-p) в сыворотке крови и перитонеальной жидкости оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями, прилагаемыми производителями тест-систем («Cytimmune», США). Оптическую плотность растворов регистрировали на микропланшетном фотометре Multiskan EX («ThermoLabSystems», Финляндия). Концентрацию цитокинов рассчитывали по калибровочной кривой.
Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, при-
лагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («Ин-терЛабСервис», Россия). Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Были исследованы два полиморфных варианта: G-308A гена фактора некроза опухолей - альфа (TNFA) и C-509T гена трансформирующего фактора роста -бетта (TGFB), локализованных в промоторных участках генов и отвечающих за уровень экспрессии соответствующих цитокинов. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкл амплифика-та разделяли в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 B, в течение нескольких минут для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).
Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова-Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по t-критерию Стьюдента (в случае нормального распределения) и U-критерию Манна-Уитни (при отклонении распределения от нормального). Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)) с расчетом для него 95%-ного доверительного интервала (CI).
Результаты исследования и их обсуждение
По данным отечественных и зарубежных ученых, бесплодие при эндометриозе встречается в 30-60% случаев и является одним из основных симптомов проявления данной патологии [2, 3, 10]. В то же время в обзорах, обобщающих данные о взаимоотношении бесплодия и эндометриоза за последние годы, так и не был дан ответ на вопрос: имеют ли эти состояния четкую причинно-следственную, патогенетически обусловленную связь между собой?
В ходе проведенного нами исследования было установлено, что средняя продолжительность бесплодия у пациенток с эндометриозом составила 3,6±1,1 года, которое у 99 пациенток (66%) было первичным, а у 51 женщины (34%) оказалось вторичным. Кроме того, 111 женщин (74%) данной группы предъявляли жалобы на болевой синдром, 111 (74%) - на дисменорею, 57 (38%) - на диспареунию, 54 (36%) - на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии.
Наиболее часто, в 86% случаев (у 129 пациенток), во время лапароскопии диагностировались малые формы эндометриоза, в то время как эндо-метриоидные кисты - в 64% (96 пациенток), из них двусторонние - в 30% случаев. Частота ретроцервикаль-ного эндометриоза не превышала 14% (21 пациентка). У 87 больных (58%) в малом тазу был выявлен спаечный процесс различной степени выраженности. Чаще встречался умеренно выраженный спаечный процесс
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
органов малого таза: 1-11 степени составила 71,3% (62 пациентки), III и IV степени составили соответственно 22,9% и 5,8% случаев.
Соответственно выявленной патологии пациенткам проводилась лапароскопическая коррекция, направленная в первую очередь на максимальное удаление всех видимых и пальпируемых очагов эндометриоза и восстановление нормальных отношений органов малого таза: термокаутеризация очагов эндометриоза выполнена 129 пациенткам (86%), разделение спаек -90 (60%) и цистэктомия - 96 (64%).
В группе сравнения продолжительность бесплодия составила 2,5±1,1 года. Первичное бесплодие встречалось у 26 женщин (40%), вторичное - у 39 (60%). Основные жалобы, предъявляемые пациентками, распределились следующим образом: на наличие болевого синдрома указывали 13 пациенток (20%), дисменорею -7 (10,8%), нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии - 7 (10,8%). Объем оперативного вмешательства для всех пациенток данной группы был одинаков и представлен, как уже указывалось выше, гистероскопией и диагностической лапароскопией.
В патогенезе генитального эндометриоза важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза, в том числе и генетически обусловленным, предрасполагающим к определенному ответу иммунной системы на формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение. В последние годы большое внимание уделяется изучению цитокинов, контролирующих процессы апоптоза, пролиферации и дифференцировки, а также обеспечивающих благоприятные условия для внедрения и развития жизнеспособных элементов эндометрия [1, 4, 8].
При исследовании содержания цитокинов в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа были выявлены следующие результаты: у пациенток с генитальным эндометриозом содержание TNF-a значимо превышало таковое у женщин без данной патологии, а уровень TGF-p в обследованных группах достоверно не различался (табл. 1). Аналогичная тенденция наблюдалась при оценке содержания цитокинов и в перитонеальной жидкости.
Следующим этапом исследования явился анализ полиморфизма генов, кодирующих продукцию изученных нами факторов, а именно генов TNFA и TGFB. Гены цитокинов являются высококонсервативными структурами, в связи с чем мутации внутри экзонов редки и обусловливают изменение функций или вовсе отсутствие экспрессируемого белка. Консервативные
мутации не затрагивают аминокислотную последовательность, однако могут влиять на экспрессию белка другими путями: изменяя сплайсинг или стабильность мРНК, влияя на уровень транскрипции исследуемого гена. Наиболее часто встречающиеся аллельные варианты генов цитокинов образуются в результате мутаций интронных областей, напрямую не изменяющих аминокислотную последовательность, но влияющих на продукцию белков [5, 8, 9].
Известно, что ген TNFА локализован в кластере генов системы Н1_А, аллельный полиморфизм которых подробно изучен. Замена в позиции G-308A гена TNFА влияет на изменение транскрипции и продукции TNF-a [5, 9]. В ходе иммуногенетического исследования было выявлено, что среди пациенток с генитальным эндометриозом и бесплодием чаще встречаются носители генотипа АА (40,7%) полиморфного участка G-308A гена TNFA. В группе женщин с бесплодием без эндометриоза достоверно чаще встречался гомозиготный по аллелю G генотип (61,5%). Сравнительная оценка распределения аллелей и генотипов исследуемого гена показала значимое увеличение частоты аллеля А и генотипов АА и GA у пациенток с генитальным эндометриозом и бесплодием (р=0,0001) по сравнению с аналогичным показателем у женщин с бесплодием без данной патологии. Кроме того, была показана положительная ассоциация генотипов АА (OR=1,61) и GA (OR=2,31) полиморфизма G-308A гена TNFA с генитальным эндометриозом, ассоциированным с бесплодием. Наличие данных генотипов увеличивает относительный риск развития эндометри-оз-ассоциированного бесплодия (табл. 2).
Контроль транскрипции гена TNFA связан с промо-торной областью, где расположены сайты связывания транскрипционных факторов. Установлено, что большинство сайтов связывания расположено в промоторах в районе [-1; -200] пар оснований по отношению к старту транскрипции. Тем не менее функциональные сайты встречаются и в очень удаленных 5'-энхансерах, вплоть до -5000 пар оснований, а также в энхансерах, расположенных в интронах, до +1500 пар оснований по отношению к старту транскрипции [5, 8, 9, 11]. Поскольку взаимодействие энхансеров транскрипции происходит по типу «ключ - замок», становится понятно, что замена даже одного нуклеотида в области промотора гена ведет к изменению структуры сайтов связывания. Это в конечном итоге позволяет транскрипционным факторам приобретать большее или меньшее сродство к регуляторным участкам и в дальнейшем напрямую
Таблица 1
Содержание TNF-a и TGF-p в сыворотке крови у обследованных женщин, Ме Ю ф )
' 25% 75%'
Регистрируемый показатель (пг/мл) Женщины без эндометриоза (п=65) Женщины с эндометриозом (п=150) р
TNF-a 38,5 (29,0:47,5) 77,5 (49,2:96,1) 0,030
TGF-p 6957 (6902:7813) 7120 (6728:9513) 0,780
Примечание: р - достоверность различий показателей по сравнению с их значениями у женщин без эндометриоза.
Таблица 2
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G-308A гена TNFА (%) среди обследованных женщин
Регистрируемый показатель Женщины без эндометриоза (п=65) Женщины с эндометриозом (п=150) х2 OR (95% С1)
GG 0,615 0,320 16,46 р=0,0003 0,29 0,16-0,54
GА 0,169 0,273 1,85 0,88-3,87
АА 0,215 0,407 2,50 1,27-4,90
G 0,700 0,457 21,56 р=0,0001 0,36 (0,23-0,56)
А 0,300 0,543 2,78 (1,79-4,30)
Примечание: здесь и в таблице 3: х2 - стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов; OR - критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с женщинами без эндометриоза с 95%-ным доверительным интервалом.
связано с уровнем транскрипции закодированного ци-токина [5, 11].
Исходя из того, что исследуемый полиморфизм G-308A гена TNFA расположен в промоторной области, нами была предпринята попытка выяснить характер влияния данного полиморфизма на содержание кодируемого цитокина. Проведенное исследование показало, что минимальный уровень TNF-a в крови ассоциирован с гомозиготным по аллелю G генотипом полиморфизма G-308A гена TNFA (р=0,05). Таким образом, генетически запрограммированный повышенный или пониженный синтез TNF-a сказывается на способности иммунной системы человека реагировать на развитие целого ряда иммунопатологических процессов, в том числе и генитального эндометриоза. Наличие аллеля А локуса G-308A гена TNFA в генотипах приводит к увеличению транскрипционной активности и ускорению синтеза мРНК, в результате чего увеличивается уровень данного цитокина в крови, он повышает способность эндометриоидных клеток к миграции и имплантации в ткани за пределами слизистой оболочки матки.
Изучение транскрипционного контроля гена TGFB представляет особый интерес в связи с тем, что этот цитокин является супрессорным фактором в отношении клеточного иммунного ответа: показано, что ТGF-p угнетает пролиферативный ответ Т-клеток [8, 9]. ТGF-p подавляет экспрессию на Т-клетках рецепторов к ^-1, что приводит к снижению их способности реагировать на антигенную стимуляцию; ингибирует эффекты, оказываемые на лимфоциты ^-12 посредством блока фосфорилирования молекул STAT4, приводит к угнетению пролиферации Т-клеток; блокирует проведение сигнала от ^-2, ^-5 в Т-клет-ках и эозинофилах. Препятствуя адгезии лейкоцитов к эндотелию, ТGF-p ингибирует секрецию супероксид-ных радикалов и оказывает негативное воздействие на функцию нейтрофилов и макрофагов, вызывая локальную иммуносупрессию [5, 8].
Дальнейшее иммуногенетическое исследование показало, что у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (48%) и пациенток с инфертильностью без данной патологии (56,9%) чаще встречался гомозиготный по аллелю С генотип полиморфизма С-509Т гена TGFB. Обращало на себя внимание отсутствие статистически значимых различий в частотах распределения аллелей и генотипов изученного гена среди обследованных женщин с бесплодием - как ассоциированным с эндометриозом, так и без такового (табл. 3).
Имеются данные, что присутствие аллельного варианта -509С ассоциировано с уменьшением продукции ТGF-p [5]. Однако проведенное исследование содержания ТGF-p в сыворотке крови обследованных женщин в зависимости от генотипа локуса С-509Т гена TGFB не выявило достоверных ассоциаций между уровнем продукции исследуемого цитокина и аллельным полиморфизмом гена TGFB.
Заключительным этапом исследования явилась оценка эффективности лечения, которая осуществлялась по частоте наступления маточной беременности в течение года с момента проведения оперативного вмешательства. У пациенток с эндометриоз-ассоции-рованным бесплодием частота ее наступления не превышала 28% (42 пациентки), в то время как в группе сравнения маточная беременность наступила в 60% случаев (39 пациенток). Среди пациенток с эндометри-озом наиболее часто - в 42,86% случаев (18 пациенток) - маточная беременность наступала после приема агонистов гонадотропин-рилизинг гормона, реже -после лечения комбинированными оральными контрацептивами - 26,19% (11 пациенток), без лечения -не превышала 9,5% (4 пациентки). Небезынтересно отметить, что низкая частота наступления беременности после лечения эндометриоза была ассоциирована с носительством рисковых генотипов АА и GA (OR=2,39 и OR=1,94 соответственно) полиморфизма G-308A гена TNFA, частота которых среди пациенток без эндометриоза оказалась гораздо ниже.
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
Таблица 3
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С-509Т гена TGFB (%) среди обследованных женщин
Регистрируемый показатель Женщины без эндометриоза (n=65) Женщины с эндометриозом (n=150) X2 OR (95% CI)
СС 0,569 0,480 1,58 р=0,45 0,70 (0,39-1,26)
СТ 0,200 0,220 1,13 (0,55-2,32)
ТТ 0,231 0,300 1,43 (0,73-2,80)
С 0,669 0,590 2,40 р=0,12 0,71 (0,46-1,10)
Т 0,331 0,410 1,41 (0,91-2,17)
Подводя итог, следует подчеркнуть, что изучение ассоциаций аллельных вариантов генов цитокинов с заболеваниями связано с попытками установить им-муногенетические маркеры заболеваний. Подобные исследования перспективны в попытке установить причинно-следственные связи цитокиновых генов с заболеваниями, но из-за трудности выбора возможных претендентов из большого числа генов-кандидатов и из-за незначительного влияния любого отдельного гена на восприимчивость к заболеванию требуют продолжения. Установленные нами изменения соотношения в распределении аллельных вариантов промоторных участков генов цитокинов у больных генитальным эн-дометриозом и бесплодием могут обусловливать функциональные нарушения, которые приводят к количественным изменениям протекания защитных реакций (но не к полному генетическому дефекту), что сказывается на развитии эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия.
Таким образом, терапия бесплодия у пациенток с генитальным эндометриозом должна проводиться исключительно после подтверждения диагноза. Максимально эффективным является сочетание лапароскопической коррекции патологии органов малого таза с последующей медикаментозной терапией, направленной на длительное подавление овуляции и создание гипоэстрогении. Дальнейшая идентификация генов и их аллелей, от экспрессии которых зависит предрасположенность или резистентность к эндометриозу, а также эффективность лечения бесплодия у данных пациенток являются актуальной задачей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамян Л. В., Кулаков В. И., Андреева Е. Н. Эндометри-озы. - М.: Медицина, 2006. - 416 с.
2. Герасимов А. М. Причины бесплодия при наружном эндо-метриозе // Вестник акуш. и гин. - 2008. - № 1. - С. 31-35.
3. Крутова В. А., Галустян С. А., Белкина Н. В. Комплексное лечение женщин, страдающих бесплодием, ассоциированным с генитальным эндометриозом // Вестник акуш. и гин. - 2008. -№ 2. - С. 46-49.
4. Ищенко А. И., Кудрина Е. А. Эндометриоз: диагностика и лечение. - М.: МИА, 2008. - 176 с.
5. Симбирцев А. С., Громова А. Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Иммунология. - 2005. - № 1. - С. 67-72.
6. Allaire C. Endometriosis and infertility: a review // J. Reprod. Med. - 2006. - V. 51. № 3. - Р. 164-168.
7. CampoS., Campo V., Benagiano G. Infertility and adenomyosis // Obstet. gynecol. int. - 2012. - V. 78. № 12. - Р. 956-960.
8. Harada T., Iwabe T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis // Fertil. steril. - 2001. - V. 76. № 1. - Р. 1-10.
9. Iwabe T., Harada T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis-associated infertility // Gynec. obstet. invest. - 2002. -V. 53. № 1. - Р. 19-25.
10. Senapati S., Barnhart K. Managing endometriosis-associated infertility // Clin. obstet. gynecol. - 2011. - V. 54. № 4. -Р. 720-726.
11. Stilley J. A., Birt J. A., Sharpe-Timms K. L. Cellular and molecular basis for endometriosis-associated infertility // Cell tissue res. - 2012. - V. 3. № 1. - Р. 44-49.
Поступила 04.07.2012
