CC BY
35
© А. I. Руденко, Л. Я. Мельниченко, І. А. Кленіна, Ю. А. Гайдар, О. О. Галінський УДК 616. 36+572. 7:612. 015/616. 36-002
А. I. Руденко, Л. Я. Мельниченко, І. А. Кленіна, Ю. А. Гэйдар, О. О. Галінський ФУНКЦІОНАЛЬНО-МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ ПЕЧІНКИ
ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ГЕПАТИТІ
ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України» (м. Дніпропетровськ)
Робота є фрагментом науково-дослідної теми «Вивчити механізми прогресування запальних і фі-бротичних процесів при хронічних дифузних захворюваннях печінки і визначити шляхи їх гальмування» № держреєстрації ВН. 25.01.005.10.
Вступ. Хронічні дифузні захворювання печінки (ХДЗП) не вірусної етіології є предметом активного вивчення останніх десятиліть. До них відноситься група захворювань, які викликані тривалим впливом різних гепатотоксичних сполук, які порушують структуру та функцію печінки. Головними формами ХДЗП, як послідовних стадій єдиного патологічного процесу, є стеатоз печінки, хронічний гепатит (ХГ) (стеатоз печінки з некрозами гепатоцитів та мезен-хімальною реакцією) та цироз печінки (незворотній і неодмінно прогресуючий процес).
Відомо, що важливу роль в стимуляції проліферації зірчастих клітин відіграють ендотеліальні фактори: ендотелій-1, монооксиду нітроген (N0), ангіотензин-П, тромбін та інші, і що найменший дисбаланс у складній і взаємопов’язаній ендотеліальній системі призводить до тяжких пошкоджень гепатоцитів. Фіброзування печінкової тканини відноситься до статичних (незворотних) чинників зростання печінкового судинного опору. Динамічними або ж зворотними факторами є дисбаланс місцеводію-чих вазоактивних речовин: N0 та ендотеліну-1. Ці медіатори продукуються ендотелієм судин та синусоїдальними клітинами, тому участь N0 в розвитку патологічного процесу не викликає сумніву.
Відома участь N0-синтаз (N08) в розвитку експериментального гепатиту (ЕГ), особливо при надлишку N0, тоді як в умовах його недостачі при інгібуванні всіх ізоформ (N08 iN0S, eN0S і □N08) може спричинити порушення печінкового кровообігу і призвести до розвитку функціонально-морфологічних змін гепатоцитів. У зв’язку з цим правомірним є створення нової моделі ЕГ, що ґрунтується на інгібуванні неспецифічної N08 [3].
Але залишається відкритим питання щодо впливу зміни рівнів N0 в організмі на формування пата-логічних процесів, які викликають функціональне та структурне пошкодження органів шлунково-кишкового тракту і зокрема печінки [4].
Метою дослідження було встановлення змін функціонального та морфологічного стану печінки при моделюванні ЕГ
Об’єкт і методи дослідження. Дослідження проводили на 21 білих лабораторних щурах - самцях популяції Вістар, масою 200-240 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Дослідження проводили, дотримуючись нормативів Конвенції з біо-етики Ради Європи (1997), Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових досліджень, загальних етичних принципів експериментів на тваринах, ухвалених Першим національним конгресом України з біоетики (2001 р.) [ 6 ].
Проведено дві серії досліджень: І - моделювання ЕГ шляхом внутрішньочеревного введення неспецифічного блокатора NO-синтаз - КР-нітро-Ь аргініну (L-NNA) в дозі 40 мг/кг протягом 6 та 12 діб;
ІІ - (контрольна) тваринам внутрішньочеревино вводили ізотонічний розчин NaCl в дозі 1 мл протягом того ж терміну. В якості анестетика використовували розчин кетаміну гідрохлориду (110 мг/кг), для виведення тварин з експерименту через 6 та 12 діб моделювання патології печінки вводили подвійну дозу анестетика.
Стан системи ПОЛ оцінювали за концентрацією малонового діальдегіду (МДА) в сироватці крові [7], активність церулоплазміну (ЦП) - за Ревіним [7], білково-синтетичну функцію печінки оцінювали за вмістом білкових фракцій в сироватці крові щурів (альбумін, а,-, а2-, р- та у-глобупіни) [набір біотесту «Філісіт-діагностика»]. Після закінчення дослідження тваринам проводили евтаназію під кетаміновим наркозом, печінку вилучали та відразу фіксували в середовищі Bowin і готували мікроскопічні зрізи тканини із забарвленням гематоксилін-зозином і за Маллорі-Слінченко.
Усі вихідні дані, отримані при виконанні роботи для оптимізації математичної обробки вводилися у базу даних, побудовану за допомогою електронних таблиць Microsoft Excel 2010 та Origin Lab OriginPro v7. 5. Отриманий числовий матеріал оброблявся за допомогою стандартних методів математичної статистики з визначенням середніх величин, їх стандартних помилок та інтервалів вірогідності за t-критерієм Ст’юдента. Відмінності, отримані за методом парних порівнянь, вважали вірогідними при р<0,05.
Результати досліджень та їх обговорення.
Встановлено, що моделювання ЕГ на початкових стадіях розвитку патологічного процесу в печинці
ПАТОМОРФОЛОГІЯ
Таблиця 1
Вміст загального білку та білкових фракцій сироватки крові щурів на 6-ту та 12-ту добу експериментального гепатиту
Група ЗБ, г/л Фракції, %
АІ а1 а2 Р У
Інтактні тварини (п=7) 51,91+5,60 57,75+2,09 4,20+1,30 8,58+1,2 10,25+0,7 15,87+3,1
6-та доба (п=7) 37,15+1,92 37,88+1,0** 11,57+1,3 10,70+1,0** 16,37+1,4 21,59+2,5
12-та доба (п=7) 31,95+3,40 31,30+2,66* 10,20+2,0 10,34+0,94 15,46+2,3 24,46+3,3
Примітка: * - р<0,05; ** - р<0,01 вірогідність змін між показниками щурів в порівнянні інтактними.
(6 днів) не супроводжувалось змінами загального стану тварин, тоді як у подальшому (після 12 днів), спостерігалося пригнічення поведінкових реакцій за даними методики «відкритого поля», а також достовірне зменшення маси тіла на 7,5±2,3г. Зміна загального стану тварин супроводжувалась морфологічними і функціональніми перебудовами в печінці.
Результати досліджень біохімічних показників білкового обміну сироватки крові у щурів при тривалому дефіциті N0 наведено у таблиці 1. Як свідчать дані таблиці 1 у тварин з ЕГ на 6-ту добу пригнічувалася білково-синтетична функція печінки, про що свідчило зниження вмісту загального білку (ЗБ) в 1,4 рази до (37,15±1,92) г/л, в основному за рахунок підвищення глобулінових фракцій.
В подальшому на 12-ту добу зниження вмісту ЗБ було ще більш вираженим - в 1,6 рази до (31,95±3,40) г/л (р<0,05). Відбувалося також і порушення співвідношення між альбумінами та глобулінами, що слугує переконливою ознакою глибини функціонального порушення печінки. Зниження альбуміну свідчить про зниження синтезуючої здатності печінки, а дефіцит його поповнюється збільшенням кількості однієї чи декількох фракцій глобулінів.
Найбільш стабільною є Ь-фракція, зміни якої відбуваються при крайніх ступенях дегенеративних змін печінки, що можна спостерігати у щурів на 6-ту та 12-ту добу, де вміст Ь-глобулінів був підвищеним в 1,6 рази до (16,37±1,45) %, та в 1,5 разів до (15,46±2,3) % (р<0,05).
У щурів, як на 6-ту так і на 12-ту добу, вміст а-глобулінів був підвищений, що свідчить про прево-лювання дегенеративних процесів у печінці. Збільшення рівня д-глобулінів особливо на 12-ту добу в 1,5 рази (р<0,05) можливо обумовлено інфільтрацією печінки мононуклеарними елементами ретику-ло-ендотеліальної системи, яка мобілізує купферов-ські клітини, які фагоцитують детрітні маси загиблих клітин та накопичують д-глобуліни.
Таким чином, у щурів виявлено порушення білково-синтетичної функції печінки, що супроводжувалося гіпоальбумінемією та гіпергаммаглобулінемією.
Поряд з порушення білково-синтетичної функції печінки відмічаються зміна в системі перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантного захисту (АОЗ) (табл. 2).
Таблиця 2
Характеристика змін біохімічних показників сироватки крові щурів з експериментальним гепатитом
Показник МДА, нМоль/мл ЦП, мг/мл
М±т М±т
Інтактні тварини (п=7) 3,62±0,13 254,85±9,17
ЕГ, 6-та доба (п=5) 4,94±0,35* 298,75±10,39«
ЕГ, 12 доба (п=7) 5,67±0,88* 457,13±21,2***
Примітка: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 вірогідність змін між показниками щурів у порівнянні з інтактними.
Так на 6-ту добу моделювання гепатиту і особливо на 12 добу вміст вторинного продукту ПОЛ - МДА підвищувався в 1,4 і 1,6 рази (р<0,05) відповідно. В ці ж строки відмічається зростання неклітиного антиоксиданта ЦП в 1,2 рази (р<0,01) на 6 добу та в 1,8 рази (р<0,001) на 12 добу відповідно.
Так, у більшості щурів на 12-й день створення дефіциту N0 гістоструктура печінки характеризувалась: стазом крові у венах портальних трактів, який
Рис. 1. Печінка щура в умовах пригнічення N0-синтаз. Портальний тракт. Венозний стаз крові і розширення жовчних проток. Лейкоцити в стромі. Поширений апоптоз гепатоцитів прикордонної пластини. Забарвлення гематоксиліном та еозином. X 200.
Рис. 2. Печінка щура в умовах пригнічення N0-синтаз. Стаз крові в центральній венулі. Дрібнокра-плинна ліпідна дистрофія гепатоцитів перивенозної зони. Апопоз поодиноких гепатоцитів. Забарвлення гематоксиліном і еозином. X 200.
Рис. 3. Печінка щура в умовах пригнічення N0-синтаз. Зональна дрібнокраплинна жирова дистрофія печінки. Забарвлення гематоксиліном та еозином. X 200.
проявлявся поширенням діаметру просвіту вен, заповнених плазмою та елементами крові (рис. 1). Аналогічна картина була у центральних венах печінкових часток (рис. 2). Одночасно спостерігався апоптоз гепатоцитів прикордонної пластинки портальних трактів, у перипортальній, інтермедіарній і
перицентральнї зонах паренхіми печінкових часток. У портальних трактах накопичувались лейкоцити (рис. 1, 2). Типовим був дрібнокраплинний жировий гепатоз печінки (рис. 3).
Морфологічні зміни в печінці при моделюванні дефіциту N0 супроводжувались змінами білкового обміну в організмі щурів.
Отже, тривале пригнічення всіх ізоформ N0-синтаз за допомогою введення нітро-І_-аргініну призводило до формування гістоструктурних змін в печінці внаслідок порушення в ній кровообігу, застою крові в малих і великих венах портального тракту, яке створювало гіпоксичні умови для діяльності гепатоцитів. Саме останнє і запускало механізми апоптозу, особливо в тих гепатоцитах які прилеглі до венозного кровотоку, а також сприяють формуванню дрібнокапельно ліпідной дистрофії. Розвиток патологічного процесу в печинці порушував її білково-синтетичної функції, і супроводжувався гіпергам-маглобулінемією і зростанням продукці ПОЛ -МДА. Активація ж антиоксидантної системи- ЦП в ці строки свідчить про те що система захисту біологічних мембран гепатоцитів від ушкоджуючої дії перекисів зберігається.
Таким чином, отримана нова модель ЕГ, яка поширює наші знання відносно розуміння ролі N0 в формуванні дрібнокапельной ліпідної дистрофії через гіпоксичні умови в діяльності гепатоцитів, ранніми проявами яких було порушення білково-синтетичної функції печінки.
Висновки.
Розроблена нова модель ЕГ заснована на пригніченні діяльності всіх форм NО-синтаз за допомогою тривалого введення неспецифічного блокатора N0-синтаз _-NNA.
Максимально виражені біохімічні зміни показників білкового обміну та ПОЛ - МДА відбувались після
12 днів введення _-NNA. В ці ж строки відбувалися і морфологічні зміни: стаз крові у венозній системі печінки, апоптоз і розвиток дрібнокраплинної жирової дистрофії гепатоцитів.
Перспективи подальших досліджень. В подальшому планується продовжити дослідження по встановленню змін функціонального та морфологічного стану печінки при моделюванні ЕГ та вивченню стану антиоксидантної системи в більш віддалені строки.
Список літератури
1. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике / В. С. Камышников (в 2-х т.). -Mинск: Беларусь, 2009. - Т. 2. - 4б5 с.
2. Покровский В. И. Биомедицинская этика / В. И. Покровский. - M., 1997. - 224 с.
3. Саркисов Д. С. Воспроизведение болезней человека в эксперименте / Д. С. Саркисов, П. И. Ремисов. - Mосква,
19б0. - 780 с.
4. Скакун Н. П. Поражение печени четыреххлористым углеродом / Н. П. Скакун, Г. Т. Писько, И. П. Mосийчук. - Mосква, HИИТЭXИM, 1989. - 105 с.
5. Шерлок III. Заболевания печени и желчных путей / Шерлок III., Дули Дж. / Пер. с англ. - M.: ГЭOТAP-MEД, 2002. - С. 8б4.
6. Bohus E. Temporal metabolic modeling of L-arginine induced exocrine pancreatitis / E. Bohus, M. Coen, H. C. Keun //
J. Proteom Res. - 2008. - Vol. 7 (10). - P. 4435-4445.
7. Fredstrom S. B. Pancreatitis induced in rats by repetitive administration of L-argigine / S. B. Fredstrom, J. Jessurun, D. D. Gallaher // Pancreas. - 2009. - Vol. 38, № 3. - P. 344-345.
УДK б1б. 3б+572. 7:б12. 015/б1б. 3б-002
ФУHKЦIOHAЛЬHO-MOPФOЛOПЧHI ЗMIHИ ПEЧIHKИ ^И EKCПEPИMEHTAЛЬHOMУ ГEПATИTI
Pyденко A. I., Mельниченко Л. Я., Kленіна I. A., Гайдар Ю. A., Галінський O. O.
Pезюме. В експерименті на щурах лінії Вістар розроблена нова модель дрібнокрапельного жирового гепатиту, яка заснована на пригніченні діяльності всіх NO-синтаз за допомогою довготривалого введення неспецифічного блокатору NO-синтаз L-NNA. Mаксимально варажені зміни біохімічних показників білкового обміну та системи перекисного окислення ліпідів (за вмістом малонового діальдегіду) та морфологічні зміни в гепатоцитах відбувалися після 12 дневного введения L-NNA.
^ючові слова: модель експериментального гепатита, оксид азоту.
УДK б1б. 3б+572. 7:б12. 015/б1б. 3б-002
ФУHKЦИOHAЛЬHO-MOPФOЛOГИЧECKИE ИЗMEHEHИЯ ПEЧEHИ ПPИ ЭKCПEPИMEHTAЛЬHOM ГEПATИTE
Pyденко A. И., Mельниченко Л. Я., Kленина И. A., Гайдар Ю. A., Галинский A. A.
Pезюме. В эксперименте на крысах линии Вистар разработана новая модель мелкокапельного жирового гепатита, основанная на угнетении деятельности всех NO-синтаз при помощи длительного введения неспецифического блокатора NO-синтаз L-NNA. Mаксимально выраженные изменения биохимических показателей белкового обмена и системы перекисного окислениялипидов ^ДА) и морфологические в гепатоцитах происходили после 12 дневного введения L-NNA.
^пючевыю слова: модель экспериментального гепатита, оксид азота.
UDC б1б. 3б+572. 7:б12. 015/б1б. 3б-002
Functional And Morphological Changes In The Liver In Experimental Hepatitis
Rudenko A. I., Melnichenko L. Y., Klenino I. A., Gaidar Y. A., Galinsky O. O.
Summary. In experiments on rats Wistar developed a new model of smalldrip fatty hepatitis fatty hepatitis based on suppressed activity of NO-synthase by prolonged administration of nonspecific NO-synthase blocker L-NNA. Most pronounced changes in biochemical indicators of protein metabolism and lipid peroxidation - (MDA levels) and morphology in hepatocytes occurred after 12 days of administration L-NNA In experiments on Wistar rat line designed new model smalldrip fatty hepatitis Based oppression activities isoforms of NO-synthase after long-term inroduction L-NNA. Maximum changes in biochemical indicators protein metabolism, processes peroxidation (MDA in the blood) and morphological was in liver after 12 days mtroduction L-NNA.
Key words: model of experimental hepatitis, oxides of nitrogen, NO-synthase.
^аття надійшла 4.09.2012 р.
Рецензент - проф. Гасюк А. П.
