CC BY
43
© О. А. Романенко, Г. В. Довгаль, М. А. Довгаль УДК 611. 36: 611. 136. 41:611. 013]-092. 9 О. А. Романенко, Г. В. Довгаль, М. А. Довгаль
ІМУНОГІСТОХІМІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ В ПІЗНЬОМУ ПРЕНАТАЛЬНОМУ ПЕРІОДІ ПІД ВПЛИВОМ АЦЕТАТУ СВИНЦЮ ТА ЗА УМОВ КОРЕКЦІЇ
Державний заклад «Дніпропетровська медична академія» (м. Дніпропетровськ)
Виконане дослідження є частиною планової наукової теми кафедри анатомії людини «Розвиток та морфо-функціональний стан органів та тканин експериментальних тварин та людини в нормі, в онтогенезі, під впливом зовнішніх чинників», № держ. реєстрації 011111009598.
Вступ. Свинець - одна з найстаріших та найбільш розповсюджена промислова отрута, механізм шкідливого впливу якої обумовлений спроможністю замінювати іони кальцію, цинку та заліза в біохімічних реакціях, викликаючи блокування багатьох ен-зимів[2]. Вплив сполук свинцю на формування органів плоду та постнатальний розвиток є предметом уваги дослідників останні 20 років. Доведено, що вживання свинцю до вагітності й протягом вагітності призводить до порушень в органах сечостатевої, травної, кісткової систем плодів та потомства [3, 8, 10]. В науковій літературі багато досліджень присвячене молекулярно-біологічним особливостям печінкової тканини в нормальному онтогенезі [5, 12, 13] та впливу сполук свинцю на зрілу печінку [1, 6]. Для профілактики та лікування хронічної свинцевої інтоксикації були запропоновані пектиновмісні речовини, вітамін Е, сорбенти [6, 7, 9, 11]. На даний час відсутні дослідження щодо молекулярно-біологічних змін при впливі сполук свинцю в пренатальному онтогенезі печінки та за умов корекції.
Метою дослідження було встановлення імуно-гістохімічних змін в печінці щурів протягом пізнього пренатального розвитку під впливом ацетату свинцю та при корекції фервіталом та коензімом 010.
Об’єкт і методи дослідження. Самиці білих безпорідних щурів протягом 21 доби до вагітності отримували 40мл0,01% розчину ацетату свинцю замість води. Після настання вагітності тварин експериментальної групи розділили на такі підгрупи: підгрупа «свинець» продовжувала вживати воду з ацетатом свинцю без домішок, підгрупа «свинець+фервітал» вживала воду з ацетатом свинцю та 1% розчином фервіталу (ООО «Пик III»), підгрупа «свинець+кофермент 010» вживали воду з розчином ацетатом свинцю та 1% розчином коферменту 010 (виробник «Віталайн»).
Утримання тварин та експерименти проводилися відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» (Страсбург,
1985), «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», ухвалених Першим національним конгресом з біоетики (Київ, 2001).
Вилучену з ембріонів печінку фіксували 10% нейтральним формаліном, заливали у парафін за загальноприйнятими методиками та виготовляли гістологічні зрізи, які монтували на предметні стекла SuperFrostPIus. Після депарафінізації для відновлення антигенних властивостей тканини проводили теплову індукцію епітопного звороту шляхом нагрівання в цитратному буфері. Інкубацію зрізів з первинними антитілами проводили у вологих камерах при температурі 23-250С на протязі 30 хвилин. Використовували спектр антитіл, який включав маркери альбуміну, aSMA (а гладком’язовий актин), eNOS (ендотеліальна або конститутивна синтаза оксиду азоту) (поліклони, LabVision). Титр антитіл підбирався індивідуально для кожного маркера. Наступний етап імуногістохімічного дослідження проводили з використанням системи візуалізації UltraVisionQuanto (LabVision). Ідентифікація реакції проводилась завдяки нанесенню хромогену DAB під контролем мікроскопа протягом від 20 секунд до 3 хвилин, з проявом у вигляді темно-коричневого забарвлення специфічних структур. Для диференціювання структур тканин зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майєра.
Результати досліджень та їх обговорення.
Контрольна група. Альбумін, як маркер печінкових клітин, мав велику інтенсивність забарвлення в цих клітинах (рис. 1) та чітко визначав ділянки саме паренхіматозного компоненту органу протягом 16-20 діб. Мембрани гепатоцитів при цьому були не чіткими, в цитоплазмі барвник відкладався гранулами, що відносно рівномірно заповнювали цитоплазму печінкового епітелію. Ми не спостерігали наявність будь-якої гетерогенності в гепатоцитах в накопиченні цього маркеру. Клітинами, позитивними на eNOS, в ембріональній печінці були ендо-теліальні клітини судин всіх порядків, за винятком ендотелію синусоїдів (рис. 2). Рівень забарвлення дозволяв визначити цей маркер як один з маркерів судинного ендотелію в ембріональній печінці щурів. Позитивна реакція на eNOS була виразною в ен-дотеліальних клітинах міжчасточкових судин, центральних вен та інших судин. Клітинами, позитивними на aSMA, в печінковій тканині були клітини стінки
судин, що розвиваються, а також зірчасті клітини (Іто), кількість яких була незначною. Навколо судин середнього та крупного калібру відбувалося інтенсивне кровотворення, при цьому іноді ці острівки мали в основі аБМД позитивні клітини. Клітини Іто частіше за все були поодинокими.
Після впливу ацетату свинцю. В печінковій паренхімі були наявними ділянки з майже повністю пригніченою синтетичною функцією, що поряд з дистрофічними явищами, носило характер слабкого накопичення альбуміну. Суттєвий вплив токсиканту на стан судин ми спостерігали при імуно-гістохімічному дослідженні на еИОБ. Пригнічення синтезу ферменту призводило до ледве помітного накопичення барвнику в ендотелії судин. Подальші спостереження показали стійке пригнічення синтезу цього ферменту. Накопичення клітин, позитивних на аБМД, ми спостерігали в периферичних ділянках печінках, що зазнавали найглибших патологічних змін (рис. 3).
При цьому клітини були розташовані уздовж си-нусоїдів, ендотелій яких не прослідковувався. На 20 добу аБМД позитивні клітини найбільше спостерігалися в периферичних відділах органу, де ще збереглася печінкова паренхіма. В ділянках, що зазнали фіброзних змін, клітин Іто не спостерігалось. аБМД позитивні клітини були лише в складі судин, що почали інтенсивно формуватися в сполучній тканині фіброзно змінених ділянок печінки.
Після впливу ацетату свинцю при корекції' фервіталом. В зразках печінки зародків в цій групі накопичення маркеру альбуміну було менш пригніченим, ніж у групі без корекції, але не набувало інтенсивності, яка спостерігалася в контрольній групі. Інтенсивність забарвлення на еИОБ зменшувалась, це відбувалося нерівномірно, найбільш уразливими виявилися судини малого калібру. Ділянки з виразними дистрофічними та некротичними змінами втрачали звичайний судинний малюнок. При цьому залишалися поодинокі судини середнього калібру з достатнім рівнем синтезу ензиму в ділянках з різним ступенем збереженості печінкової паренхіми. Накопичення клітин, позитивних на аБМД, наближалося до норми, але в ділянках, що зазнали суттєвих дистрофічних змін, ми спостерігали підвищену кількість цих клітин. До 20 доби ми спостерігали накопичення аБМД позитивних клітин уздовж синусоїдів, а також структур, що нагадували синусоїди, однак, втрачали ряд своїх ознак, зокрема ендотелій.
Після впливу ацетату свинцю при корекції коферментом 010. Забарвлення на альбумін було слабким. Ділянки з відносно рівномірним забарвленням перемежалися з тими, що мали різну ступінь накопичення в зв’язку з дистрофічними або некротичними явищами. Імуногістохімічна реакція на еИОБ була слабкою в більшості досліджених ділянок печінкової паренхіми. Реакція на аБМД показала ті ж самі закономірності, що в інших експериментальних групах, а саме тенденцію до накопичення
Рис. 1. Імуногістохімічна реакція на альбумін в печінці зародка щура на 16 добу ембріогенезу в нормі. Додаткове забарвлення гематоксиліном Майєра. Збільш.: ок. 410, об. 4100.
Рис. 3. Імуногістохімічна реакція на а БМД в печінці зародка щура на 16 добу ембріогенезу після впливу ацетату свинцю. Додаткове забарвлення гематоксиліном Майєра. Збільш.: ок. Ч10, об. Ч100.
Рис. 2. Імуногістохімічна реакція на еМОБ в печінці зародка щура на 16 добу ембріогенезу в нормі. Додаткове забарвлення гематоксиліном Майєра. Збільш.: ок. 410, об. 410.
позитивних на цей маркер клітин в ділянках, що демонстрували дистрофічні та некротичні зміни.
Експресія альбуміну, що ми спостерігали в нормі на 16 добу ембріогенезу, зазвичай є наявною на більш ранніх строках [13]. Цей протеїн є основним маркером дозрівання печінкових клітин, пригнічення його синтезу вказує на втручання ацетату свинцю в найбільш стабільні та важливі молекулярно-біологічні процеси в гепатоцитах. Частково ці процеси можуть бути захищені при додаванні в раціон речовин, що зменшують всмоктування сполук свинцю з киш-ково-шлунового тракту (фервітал) або стимулюють активність ензимів та підтримують енергетичний метаболізм (кофермент 0 10). На 16 добу частина клітин, що була позитивною на альбумін, могла належати популяції біпотенціальних клітин [13], але в подальшому ми спостерігали лише зростання кількості гепатоцитів, тобто ця біпотенціальна популяція продукувала клітини печінкової паренхіми. Кількість позитивних на альбумін гепатоцитів не зростала після 18 доби, що відповідає даним RabatA. Е. [14].
Пригнічення синтезу конститутивної форми син-тази окису азоту (еЧОБ), особливо в судинах малого калібру, відповідало загальному токсичному впливу свинцю, що також спостерігалось в зрілій печінці [1]. Використані нами протектанти частково маскували вплив свинцю й на процес пригнічення активності еЧОБ.
Особливий інтерес представляє стимулювання токсикантом проліферації аБМД позитивних клітин. В ділянках, що демонстрували виразні дистрофічні зміни, зміни судинного малюнку, концентрація цих клітин була максимальною. За даними Гумерової А. А. [4, 5], клітинами, що позитивні на а гладком’язовий актин, є зірчасті клітини печінки або
клітини Іто. їх накопичення пов’язане з фіброзом в зрілій печінці, а нітрат свинцю описаний як речовина, яка стимулює проліферацію та апоптоз клітин Іто в печінці щурів. В наших дослідженнях, накопичення аБМД позитивних клітин на 16-18 добу ембріогенезу передувало подальшим фіброзним змінам, особливо в периферичних частинах органу, а ділянки, що заміщувались сполучною тканиною вже не містили цих клітин. Тому, ми вважаємо, що клітини Іто навіть в пренатальному періоді є асоційованими з фіброзними процесами в печінці. Після формування фіброзної тканин вони піддаються апоптотичним змінам.
Висновки. Таким чином, за допомогою імуно-гістохімічного дослідження ми встановили біологічні зміни, що відбуваються в ембріональній печінці щурів під впливом ацетату свинцю. Вони полягають в зменшенні синтетичної активності гепатоцитів, що поєднується з дистрофічними процесами; накопиченні клітин Іто, що відбувається в ділянках, які зазнали патологічних перетворень. Також відбувається зменшення функціональної активності судинного ендотелію. При корекції впливу токсиканту за допомогою фервіталу ми спостерігали менш виразне пригнічення синтетичних процесів в гепатоцитах та активності синтази окису азоту в ендотелії судин печінки. Проліферація клітин Іто була залежною від локальної активності дистрофічних та фіброзних процесів. Кофермент 010 мав менший проективний ефект, ніж фервітал, що було відповідним до ступеню загально патологічних змін.
Перспективи подальших досліджень. Подальші дослідження в цьому напрямку висвітять інші молекулярно-біологічні аспекти впливу сполук свинцю на розвиток органів та можливі шляхи корекції.
Список літератури
10
Апихтіна О. Л. Продукция оксиду азоту в печінці за умов впливу ацетату свинцю в експерименті / О. Л. Апихтіна,
А. В. Коцюруба, І. М. Анхрусишина // Современные проблемы токсикологии. - 2007. - № 2. - С. 22-26.
Измеров Н. Ф. Свинец и здоровье. Гигиенический и медико-биологический мониторинг / Измеров Н. Ф. - Москва,
2000. - 256 С.
Грызлова Л. В., Киреева Ю. В., Шубина О. С. Влияние свинца на потомство белых крыс // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 5 - С. 68-68.
Гумерова А. А. «Прямой митоген» нитрат свинца вызывает усиление перекисного окисления липидов и активацию клеток Ито в печени крыс / А. А. Гумерова, И. X. Валеева, А. П. Киясов // Онтогенез. - 1999. - Т. 30, № 4. - С. 289-295. Гумерова А. А. Экспрессия маркеров различных типов клеток печени на ранних этапах пренатального развития человека / А. А. Гумерова, М. А. Титова, А. П. Киясов // Цитология. - 2007. - № 2. - С. 133-141. .
Купша А. И. Морфо-функциональные проявления компенсаторно-приспособительных реакций стромального компонента печени белых мышей при длительном поступлении в организм малых доз свинца и их коррекция / А. И. Купша, О. М. Грабовой // Научный вестник Национального медицинского университета имени О. О. Богомольца. - 2008. -№ 4. - С. 57-63.
Купша Е. И. Морфо-функциональное состояние печени при свинцовой интоксикации и корригирования процесса токоферолом и эрбисолом / Е. И. Купша, Н. К. Каширина // Таврический медико-биологический вестник. - 2004. - Т. 7, № 4. - С. 64-69.
Мостовой С. О. Репаративный остеогенез нижней челюсти у потомства самок нелинейных белых крыс, подвергнутых в период беременности свинцовому отравлению, получавшего на протяжении всего исследования ацетат свинца / Мостовой С. О., Плеханова К. А., Пикалюк В. С. // Український морфологічний альманах. - 2010. - Т. 8, № 1. - С. 65-70. Остапенко О. В. Морфометрические изменения экзокринной части поджелудочной железы при интоксикации свинцом и коррекции витамином Е / О. В. Остапенко, Н. К. Каширина// Таврический медико-биологический вестник. -2008. - Т. 11, № 3. - С. 112-115.
Шубина О. С. Влияние свинцовой интоксикации на морфофункциональное состояние системы плацента плод / Шубина О. С., Киреева Ю. В. // Вестник ОГУ. - 2008. - Т. 88, № 6. - С. 118-121.
11. Эффективность яблочного пектина медекопекта для профилактики инкорпорации свинца в организме рабочих I
В. А. Остапенко, А. И. Тепляков, А. С. Прокопович, Т. И. Чегерова II Медицина труда и промышленная экология. -
2001. - № 5. - С. 44-47.
12. Cell growth and differentiation of differenthepatic cells isolated from fetal ratliver in vitro I Fiegel H. C., Bruns H., Hцper C. [etal.] II TissueEng. - 200б. - Vol. 12, № 1. - P. 123-130.
13. Isolation, characterization and culture of Thy1-positive cells from fetal ratlivers I Zvibel I., Bronstein M., Hubel E. [etal.] II World J. Gastroenterol. - 200б. - Vol. 12, № 24 - P. 3841-3847.
14. RabatA. E. A. Characterization of foetal hepatic cells during ratliver development: Dissertation zu Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissen schaftlichen Fakultaten I Abderrahim Elmaouhoub Aus Rabat. G^tingen, 200б. - 148 р.
УДК б11. Зб: б11. 13б. 41:б11. 01З]-092. 9
ІМУНОГІСТОХІМІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ В ПІЗНЬОМУ ПРЕНАТАЛЬНОМУ ПЕРІОДІ ПІД ВПЛИВОМ АЦЕТАТУ СВИНЦЮ ТА ЗА УМОВ КОРЕКЦІЇ Романенко О. А., Довгаль Г. В., Довгаль М. А.
Резюме. Для встановлення молекулярно-біологічних змін в печінці зародків під впливом ацетату свинцю та в умовах корекції самиці білих безпорідних щурів протягом 21 доби до вагітності отримували 40мл0,01% ацетату свинцю. Після настання вагітності тварини продовжували вживати воду з ацетатом свинцю або вживали воду з ацетатом свинцю та 1% розчином ферветалу або 1% розчином коферменту Q10. Вилучену печінку з ембріонів 1б-20 доби розвитку піддавали імуногістохімічному дослідженню на альбумін, aSMA,eNOS. Під впливом ацетату свинцю зменшувалась синтетична активність гепатоцитів, що поєднувалося з дистрофічними процесами та частковими фіброзними змінами периферичних частин органу, накопичувались aSMA позитивні клітини Іто. В більшості судин відбувається зменшення функціональної активнoстieNOS. При корекції фервіталом ми спостерігали часткове збереження синтетичних процесів в гепатоцитах та активності eNOS в ендотелії судин печінки. Проліферація клітин Іто була залежною від локальної активності дистрофічних та фіброзних процесів. Кофермент Q10 мав менший протективний ефект, ніж фервітал.
Ключові слова: печінка, пренатальний розвиток, ацетат свинцю, имуногістохімічне дослідження.
УДКб11. Зб: б11. 13б. 41:б11. 01З]-092. 9
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕЧЕНИ КРЫС В ПОЗДНЕМ ПРЕНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ АЦЕТАТА СВИНЦА И ПРИ КОРРЕКЦИИ Романенко А. А., Довгаль Г. В., Довгаль М. А.
Резюме. Для определения молекулярно-биологических изменений в печени зародышей под влиянием ацетата свинца и при коррекции самки белых крыс получали 40мл 0,01% раствора ацетата свинца вместо воды на протяжении 21 дня до беременности. После наступления беременности животные продолжали получать раствор ацетата свинца без добавок или вместе с 1% фервиталом или 1% коферментом Q10. В печени зародышей 1б-20 суток развития с помощью иммуногистохимических методов изучали содержание альбумина, aSMA, eNOS. Под влиянием ацетата свинца уменьшалась синтетическая активность гепатоцитов, что сопровождалось дистрофическими процессами и частичными фиброзными изменениями периферических частей органа, накапливались aSMA позитивные клетки Ито. В сосудах наблюдалось уменьшение активнoстиe NOS. При коррекции фервиталом частично сохранялась синтетическая активность гепатоцитов и eNOS. Пролиферация клеток Ито зависела от локальной активности дистрофических и фиброзных процессов. Кофермент Q10 оказывал менее выраженный протективный эффект.
Ключевые слова: печень, пренатальное развитие, ацетат свинца, иммуногистохимическое
исследование.
UDC б11. Зб: б11. 13б. 41:б11. 01З]-092. 9
The Immunohistochemical Examination Of RatLiver in The Late Embryonic Period Under The influence Of Lead Acetate And After Correction
Romanenko A. A., Dovga! G. V., Dovga! M. A.
Summary. The female white rats received the 40 ml 0,01% lead acetate instead of water during 21 day before pregnancy to determine the molecular changes in the fetal liver. After fertilization one group had the same dose of lead, other - lead and 1% fervital, orleadand 1% coenzyme Q 10. The albumin, aSMA,eNOS were examined immunohistochemical lyin the fetal livers on 1б-20 embryonic day. Lead acetate broughtto the decrease of protein synthesis in hepatocytes accompanied by liver dystrophy and fibrosis in peripheral parts of organ, the increase of aSMA positive Ito cells, the depression of eNOS. In lead and fervital group the particular saving of protein synthesis and eNOS activity was observed. The number of Ito cells depended on local pathological changes. The coenzyme Q10 had less protective effect.
Key words: liver, embryonic development, lead acetate, immunohistochemical examination.
Стаття надійшла 11. 07. 2012 р.
Рецензент - проф. Гасюк А. Ї.
