Функциональная идентификация Cl−/h+- антипортера в мембранной фракции клеток корня галофита Suaeda altissima (L. ) Pall Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 577.352.45

A.B. Шувалов1, Ю. В. Орлова1, Н. А. Мясоедов1, Д. В. Беляев1'2, Л. А. Халилова1, И. М. Андреев1, Ю. В. Балнокин1'3

1 Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН Московский физико-технический институт (государственный университет) Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Функциональная идентификация С1"/Н+-антипортера в мембранной фракции клеток корня галофита Suaeda

altissima (L.)Pall.

На выделенном из корней галофита Suaeda altissima мембранном препарате, обогащенном плазмалеммой, показано функционирование С1_/Н+-антипортера. Идентификацию С1_/Н+-антипортера и исследование свойств осуществляемого им С1_/Н+-обмена проводили с помощью оптических зондов (акридиновый оранжевый, пиранин и сафранин О), позволяющих регистрировать изменения pH внутри везикул и изменения электрического трансмембранного потенциала, которые происходят при наложении на мембрану концентрационного градиента С1-. Предполагается, что физиологическая роль С1-/Н+-аптипортера состоит в поддержании концентраций С1- в цитоплазме на нетоксическом уровне в условиях засоления.

Ключевые слова: галофит Suaeda altissima, мембранная фракция, плазмалемма, С1-/Н+-антипортер, С1- гомеостаз.

Введение

Исследование механизмов, лежащих в основе устойчивости растений к высоким концентрациям солей в почве, является одной из актуальных проблем современной биологии растений. При высоких концентрациях NaCl в почве равновесный электрический потенциал

С1- на плазмалемме (ПМ) клеток корня может быть более отрицательным, чем трансмем-

-

ют из экстраклеточной среды в цитоплазму по градиенту электрохимического потенциала

-направленного обратно в экстраклеточную среду или в вакуоль.

-

мов экспорта Na+, слабо изучены. Известно, что в трансмембранный перенос С1-вовлечены мембранные белки семейства CLC, которое включает анионные каналы и анион/протонные антипортеры. Гены семейства CLC и их продукты обнаружены у бактерий, животных и растений [2; 3]. К представителям этого семейства относятся С1-/Н+-антипортеры, которые осуществляют вторично активный транспорт С1- в обмен на Н+, используя энергию

градиента электрохимического потенциала протонов. Такой переносчик мог бы транспор--

Функционирование С1-/Н+-антипортера продемонстрировано в плазмалемме прокариот [4, 5] и внутренних мембранах клеток животных [6; 7]. Несмотря на то, что гены семейства CLC обнаружены v нескольких растений [8], сведения о С1-/Н+-антипортерах растительного происхождения крайне скудны. Имеется лишь одна работа, свидетельствующая о функционировании такого переносчика, названного AtCLCc, в клетках растений

[9]. Показано, что продукт гена AtCLCc локализован в тонопласте замыкающих клеток

-

-

тонопласт этих клеток и к нарушению работы устьичного аппарата.

Мы предположили, что С1_/Н+-антипортер выполняет функцию поддержания концентраций С1" в цитоплазме на нетоксическом уровне в клетках галофитов — растений, обитающих на засоленных почвах. Настоящая работа посвящена функциональной идентификации С1_/Н+-антипортера в выделенной из клеток корня S. altissima мембранной фракции, обогащенной везикулами плазмалеммы.

Материалы и методы

Семена Suaeda altissima (L.)Pall. проращивали во влажном песке при комнатной температуре, на пятнадцатые сутки проростки пересаживали на аэрируемый раствор Робинсона и Даунтона [10], в который был добавлен NaCl в конечной концентрации 100 мМ. Дальнейший рост S. altissima осуществляли в факторостатной камере при 24 °С в условиях водной культуры. Растения освещали натриевыми лампами высокого давления Reflux, ДНаЗ-400 (Россия) 12 часов в сутки при интенсивности света 150 вт/м2.

Мембранную фракцию из клеток корней, обогащенную везикулами плазмалеммы, получали путем центрифугирования суспензии микросом в ступенчатом градиенте плотности сахарозы по модифицированной методике [11]. Модификации состояли в применении сахарозных градиентов иных профилей (см. подписи к рис.) и во введении в среды, использовавшиеся при выделении мембран, дополнительно 5 мМ ,0-меркаптоэтапола. Содержание плазмалеммы и тонопласта в выделенной мембранной фракции оценивали по чувствительности АТФ-зависимого закисления везикулярного люмена к ингибитору Н+-АТФазы плазмалеммы ортованадату и ингибитору Н+-АТФазы тонопласта нитрату.

О функционировании С1_/Н+-антипортера суди ли по ДрС1-зависимому переносу Н+ через мембрану, а также по генерации трансмембранного электрического потенциала (Дф) при наложении на везикулярную мембрану концентрационного градиента С1-.

Перенос Н+через мембрану регистрировали двумя методами: по изменению дифференциальной абсорбции (ДА492—540) ДрН-индикатора акридинового оранжевого (АО) [12] и по изменению параметров флуоресценции рН-индикатора пиранина (Хех = 405 нм, \ех = 463 нм, Ает = 510 нм), находящегося внутри везикул [13]. Пиранин загружали в везикулы с помощью гипоосмотического шока, ресуспендируя выделенные мембранные везикулы в содержащих пиранин средах низкой осмолярности. Снижение осмолярности среды приводило к разрыву и последующему замыканию везикул, которое сопровождалось захватом «загрузочной» среды. Пиранин удаляли из среды, пропуская суспензию везикул через колонку с сефадексом G-50.

Генерацию Дф со знаком «минус» внутри везикул регистрировали как увеличение раз-554 524

Разность поглощения АО и сафранина О регистрировали с помощью двухволнового спектрофотометра «Hitachi 557». Для измерения параметров флуоресценции пиранина использовали спектрофлуориметр «Hitachi 850».

Результаты

—

ходило защелачивание везикулярного люмена. Один из экспериментов, демонстрирующих трансмембранный С1—/Н+обмен, показан на рис. 1. Выделенные везикулы содержали ионы Na+, которые попадали в везикулярный люмен на начальной стадии процедуры выделения везикул при гомогенизации корней. Встраивающийся в мембрану экзогенный Na+/H+ — антипортер, моненсин, вызывал обмен содержащихся внутри ионов Na+ на наружные

Д

Д

—

вызывало диссипацию предварительно созданного АрН (возрастание дифференциальной абсорбции АО). Проникающий через мембрану липофильный катион тетрафенилфосфоний (ТФФ+) ускорял диссипацию АрН.

моненсин

ТФФ+

О

о о

II ^

Рис. 1. АрС1-зависимая диссипация АрН с более кислым рН внутри везикул чем в наружной среде (эксперимент с АрН-индикатором акридиновым оранжевым). Мембраны выделяли в сахарозном градиенте плотности (25/34%), отбирая везикулы на границе двух слоев. Реакцию проводили в

А

мембране был предварительно создан путем внесения ^+/Н+-антииортера моненсина в суспензию везикул, содержащих Исходные концентрации и СI- в везикулярном люмене составляли

20 и 50 мМ соответственно. Липофильный катион ТФФ+ ускорял АрС1-зависимую диссипацию А

рид — 200 мМ, ТФФ+ -1мМ

Рис. 2. АрС1-зависимая генерация А^ на везикулярной мембране (эксперимент с А^-индикатором сафранином О). ТФФ+ приводил к медленной диссипации Аф. Условия проведения эксперимента такие же, как указано в подписи к рис. 1

Использование А^-индикатора сафранина О выявило электрогенный характер С1-/Н+ обмена (рис. 2). Последовательность добавок к суспензии везикул была такой же, как в эксперименте, представленном на рис. 1. Внесение в суспензию моненсина не обнаружило заметного изменения Аф, поскольку этот ионофор осуществляет электронейтральный ^+/Н+-обмен. Однако последующее добавление холинхлорида при водило к генерации Аф со знаком «минус» внутри везикул (возрастание дифференциальной абсорбции сафранина О). Добавление тфф+ вызывало медленную диссипацию сформированого в присутствии С1- трансмембранного электрического потенциала (А^), что регистрировалось как сниже-

ние дифференциальной абсорбции сафранина О.

Рис. 3. Спектр возбуждения флуоресценции пиранина при разных значениях рН раствора, \ргт = 510 нм

Рис. 4. Зависимость отношений интенсивностей флуоресценции пиранина, загруженного в везикулы, при Аеж = 463 нм и Аеж = 405 нм (Леш = 510 нм) от рН в везикулярном люмене. Мембраны выделяли в сахарозном градиенте плотности (34/64 %), отбирая везикулы на границе двух слоев. Везикулы загружали буферными растворами (20 мМ ВТР-МЕЯ) с разными рН, содержащими 200 мкМ пиранина. Загрузку производили гипоосмотическим шоком (см. раздел «Материалы и методы»). Спектры возбуждения флуоресценции пиранина, загруженного в везикулы при разных рН, регистрировали в средах следующего состава (в мМ): 100 сахароза, 20 ВТР-МЕЯ с рЯ, соответствующих их внутривезикулярным значениям

Использование флуоресцентного рН-индикатора, пиранина, который загружали в везикулы, также показало наличие ДрС1-зависимого транспорта через мембрану. Применение этого индикатора, в отличие от АО, не требует предварительной генерации на мембране Д

кул. Спектр возбуждения флуоресценции пиранина, записанный при постоянном значении длины волны эмиссии (Аеш = 510 нм) имеет два характерных пика при \ех = 405 нм и Хех = 463 нм (рис. 3). При защелачивании раствора интенсивность флуоресценции пиранина при Хех = 405 нм снижается, а при Хех = 463 нм возрастает. На рис. 4 показана зависимость отношения интенсивностей флуоресценции пиранина при двух указанных длинах

волн в спектре возбуждения флуоресценции от рН везикулярного люмена. В этом эксперименте везикулы загружали растворами пиранина с разными значениями рН. В последующих экспериментах полученную зависимость использовали как калибровочную кривую для определения рН внутри везикул.

Рис. 5. Защелачиваиие везикулярного люмена в ответ на внесение в суспензию везикул С1- (эксперимент с pii-индикатором пиранином, загруженным в везикулы). Везикулы выделяли и загружали пиранином как указано в подписи к рис. 4. Исходная концентрация хлорида в везикулярном люмене 2 мМ, pH 6,8 (20 мМ BTP-MES). Реакцию проводили в среде следующего состава: 100 мМ

сахароза, 20 мМ BTP-MES, pH 7,2. А — спектр возбуждения флуоресценции пиранина до внесения

--

зию в концентрации 200 мМ (Хех = 463, Хет = 510 нм); В — спектр возбуждения флуоресценции

-

pH в везикулярном уровне 8,2

Рис. 5 демонстрирует защелачиваиие везикулярного люмена в ответ на внесение С1-

в среду. На рис. 5а показан спектр возбуждения флуоресценции пиранина при исходном

-

рис. 56 — кинетика изменения флуоресценции пиранина при Хех = 460 нм и Хет = 510

-

возбуждения флуоресценции пиранина после достижения состояния равновесия. Конечное значение pH внутри везикул составило 8,2.

- зависит от

трансмембранного электрического потенциала. Электрический потенциал той или иной величины задавали, поддерживая на мембране соответствующий диффузионный калиевый потенциал. Для этой цели помимо пиранина везикулы нагружали ионами К+ в разных концентрациях. Концентрации К+ варьировали также в наружной среде. При разных отношениях концентрации

снаружи и внутри везикул в присутствии калиевого ионофора валиномицина на мембране генерировались разные диффузионные потенциалы К+. В трех вариантах эксперимента наружные и внутренние концентрации К+([К+0] / [К+¿п]), выраженные в мМ, были следующими: 50/5, 50/50, 5/50. При этом диффузионный потенциал описывается уравнением Нернста

где Я, Т и Р имеют обычные термодинамические значения. Согласно уравнению Нернста (1), для этих вариантов эксперимента диффузионный калиевый потенциал на мембране должен составить +58, 0, и -58мВ соответственно.

F К1'

(1)

При трех заданных значениях электрического потенциала и разных отношениях концентраций С1- снаружи и внутри везикул по изменению отношения интенсивности флуоресценции пиранина при Хех = 405 и 463 нм (Аеш = 510 нм) определяли изменение внутри-

везикулярного рН (рис. 6). Можно видеть, что (1) изменение внутривезикулярного рН, а

-

бране, (2) защелачивание больше при положительном значении электрического потенциала и оно снижается по мере смещения потенциала в отрицательную область, (3) не было обнаружено реверсии транспорта Н+через мембрану. Вход Н+ внутрь везикул (закисление везикулярного люмена) не наблюдался ни при каких условиях данного эксперимента.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100105

[СПоп/[СГ];п

Рис. 6. Защелачивание везикулярного люмена в ответ на создание на везикулярной мембране концентрационного градиента С1- при разных значениях электрического потенциала. Везикулы вы-

-

тем изменения концентрации этого иона в наружной среде Электрический потенциал задавали, поддерживая на мембране соответствующий диффузионный калиевый потенциал

Обсуждение результатов

Одним из наиболее продуктивных подходов в идентификации ионных транспортеров мембраны является исследование транспорта ионов на выделенных мембранных везикулах. Получаемые препараты ИМ обычно более чем наполовину состоят из инвертированных везикул, т.е. мембранных пузырьков, обращенных цитоплазматической стороной наружу. В некоторых случаях это создает определенные удобства, в частности, при исследовании функций локализованных в плазмалемме АТФаз. Поскольку активные центры АТФаз находятся на цитоплазматической стороне мембраны, то при работе на выделенных везикулах можно инициировать транспорт иона через ИМ, добавляя АТФ в суспензию везикул. Этот подход был использован нами для оценки содержания везикул плазмалеммы и тонопла-ста в полученной фракции. Н+-АТФаза плазмалеммы растительных клеток специфически подавляется ортованадатом — ингибитором АТФаз Р-типа и не чувствительна к нитрату, тогда как Н+-АТФаза вакуолярной мембраны, наоборот, подавляется нитратом и не чувствительна к ортованадату. В наших экспериментах АТФ-зависимый транспорт Н+ через мембрану ингибировался ортованадатом и практически не подавлялся нитратом, что говорит о преимущественном содержании в препарате везикул ИМ (данные не приведены).

Д

зависимого защелачивания везикулярного люмена (рис. 1, 5, 6). Наблюдавшееся защелачивание не может быть объяснено транспортом по градиенту электрохимического по-

тенциала. Во всех проведенных экспериментах исходное значение рН внутри везикул было таким же, как в среде. Внесение С1- в суспензию везикул в форме холинхлорида могло приводить к генерации электрического потенциала на мембране со знаком «минус», но не «плюс» внутри везикул, поскольку мембраны в гораздо большей степени проницаемы для С1-, чем для холина. Перенос С1- внутрь везикул посредством С1-/Н+-антипортера также осуществляет генерацию электрического потенциала со знаком «минус» внутри. Эксперименты с Д^-индикатором сафранином О (рис. 2) прямо указывают на генерацию электрического потенциала со знаком «минус» внутри после добавления к суспензии везикул С1-. Таким образом, пассивное движение Н+ в этих условиях возможно лишь внутрь

-

ного внутрь везикул, мы наблюдали защелачивание, но не закисление внутривезикуляр-ного люмена. Полученный результат прямо указывает на функционирование в ИМ клеток корня 5. аШввгта С1-/Н+-антипортера. Перенос С1-внутрь везикул и перенос Н+ в противоположном направлении обеспечивают перенос отрицательных зарядов внутрь везикул. Электрогенный обмен двух ионов должен зависеть от электрического потенциала на мембране, что нашло подтверждение в экспериментах с разным диффузионным калиевым потенциалом на мембране (рис. 6). При отрицательных значениях электрического потенциала («минус» внутри везикул) защелачивание было слабее, чем при нулевом значении потенциала. Смещение потенциала к положительным значениям усиливало защелачивание. Представленное ниже уравнение (2), описывающее работу С1-/Н+-антипортера [4], связывает равновесный трансмембранный потенциал (Еед), т.е. потенциал, при котором отсутствует движение С1- и Н+через мембрану, с концентрационными градиентами С1- и Н+!

[С1о] + [Яр]

[С1

(П + 1)Д^ед^ = -ПКТ + КТ , (2)

где п — стехиометрия обмена, т.е. число обмениваемых ионов С1 та 1Н+.

Проведенные нами эксперименты не позволяют произвести расчеты по уравнению (2), однако его анализ показывает, что при отрицательных значениях Д^ и градиентах С1- на мембране небольшой величины должно происходить обращение направления транспорта Н+и СI-, и защелачивание везикулярного люмена должно сменяться закислением. Однако закисления не наблюдалось ни при каких условиях данного эксперимента (рис. 6). Наиболее

вероятной причиной этого является наличие на мембране других процессов (наряду с -+

зикулярного люмена. Не исключено также, что полученные нами везикулы не являются идеальной системой, способной поддерживать трансмембранный электрический потенциал (диффузионный калиевый потенциал) в соответствии с заданными по уравнению (1) значениями. Например, из-за высокой протонной проводимости мембраны возможен пассивный транспорт протона из среды в везикулярный люмен и смещение благодаря этому Дф к более положительным значениям.

-+

-

-+

+

+

-+

направлены на получение мембранных препаратов более высокого качества, дающих воз-

-+

-+

Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-00-709-а.

Литература

1. Teakle N.L., Tyerman S.D. Mechanisms of CI- transport contributing to salt tolerance // Plant, Cell and Environment. - 2010. - V. 33, I. 4. - P. 566-589.

2. Marmagne A., Vinauger-Douard M., Monachello D., Falcon de Longevialle A., Charon C., Allot M., Rappaport F., Wollman F.A., Barbier-Brygoo H., Ephritikhine G. Two members of the Arabidopsis CLC (Chloride Channels) family, AtCLCe and AtCLCf, are associated with thvlakoid and Golgi membranes respectively // Journal of Experimental Botany. — 2007. - V. 58. - P. 3385-3393.

3. Jentsch T.J. CLC Chloride Channels and Transporters: From Genes to Protein Structure, Pathology and Physiology 11 Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. - 2008. - V. 43, N. 1. -P. 3-36.

4. Accardi A., Miller C. Secondary active transport mediated by a prokarvotic homologue of

-

-

selective channel designed from a CLC CI-/H+ exchanger // PNAS. — 2008. — V. 105, N. 32. - P. 11194-11199.

6. Graves A.R., Curran P.K., Smith C.L., Mindell, J.A. The Cl-/H+ antiporter CLC-7 is the primary chloride permeation pathway in lvsosomes // Nature. — 2008. — V. 453. — P. 788-792.

7. Pusch M., Zifarelli G. It's the proton also in C1C-2 // Journal of Physiology. — 2009. — V. 587, I. 7. - P. 1379-1380.

8. de Angeli A., Thomine S., Frachisse J.M., Ephritikhine G., Gam,bale F., Barbier-Brygoo H. Anion channels and transporters in plant cell membranes // FEBS Letters. — 2007. — V. 581, I. 12. - P. 2367-2374.

9. Jossier M., Kroniewitcz, L., Dalmas, F., Le Thiec, D., Ephritikhine, G., Thomine, S., Barbier-Brygoo, H., Vavasseur, A., Filleur, S., and Leonhardt, N. The Arabidopsis vacuolar anion transporter, AtCLCe, is involved in the regulation of stomatal movements and contributes to salt tolerance // Plant Journal. — 2010. — V. 64, I. 4. — P. 563-576.

10. Robinson S.P., Downton W.J.S. Potassium, Sodium and Chloride Ion Concentration in Leaves and Isolated Chloroplasts of the Halophvte Suaeda australis R. Br. // Aust. J. Plant Physiol. - 1985. - V. 12. - P. 471-478.

11. Лупьков P.B., Андреев И.М., Мясоедов H.A., Хайлова Г.Ф., Куркова Е.В., Валнокин Ю.В. Функциональная идентификация Н+-АТФазы и Na+/H+ антипортера в плазматической мембране, выделенной из клеток корня соленакапливающего галофита Suaeda altissima // Физиология растений. — 2005. — Т. 52. — С. 717-725.

12. Palmgren M.G. Acridine orange as a probe for measuring pH gradients across membranes mechanism and limitations // Anal. Biochem. — 1991. — V. 192, I. 2. — P. 316-321.

13. Overly C.C., Lee K.D., Berthiaume E., Hollenbeck P.J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lvsosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pvranine // PNAS. - 1995. - V .92, I. 8. - P. 3156-3160.

14. Akerman K.E., Wikstr^m M.K. Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential 11 FEBS Letters. - 1976. - V. 68, I. 2. - P. 191-197.

Поступим в редакцию 26.12.2011.