CC BY
30
удК 616.71-002.5-074-092.4
функциональная активность нейтрофильных лейкоцитов и перитонеальных макрофагов при экспериментальном костно-суставном туберкулезе
Н. В. Заболотных, Т. И. Виноградова, С. Н. Васильева, А. С. Кафтырев
Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии, г. Санкт-Петербург
Изучено состояние кислородзависимых антибактериальных систем нейтрофильных гранулоцитов и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов в ходе развития костно-суставного туберкулеза на модели туберкулезного остита у кроликов, зараженных M. tuberculosis Erdman. Показано подавление спонтанной супероксидпродуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов кроликов, развивающееся через 2 месяца после инфицирования, на фоне преобладания альтеративного воспаления в очагах специфического воспаления в костной ткани. через 3 месяца после заражения установлено угнетение поглотительной и переваривающей функций перитонеальных макрофагов, что сочеталось с распространенным специфическим поражением костной ткани, выраженным некротическим компонентом и массивными фиброзными изменениями в синовиальной оболочке. установленное нарушение функциональной активности фагоцитов является обоснованием для включения иммунокорригирую-щих препаратов в комплексную терапию костно-суставного туберкулеза.
Ключевые слова: экспериментальный костно-суставной туберкулез, макрофаги, нейтрофильные гранулоциты, фагоцитоз, свободные кислородные радикалы.
Введение
Мононуклеарным фагоцитам, наряду с 1Ы-лимфоцитами, взаимно активирующимися антигенами M. tuberculosis (МБТ) и ци-токинами, отводится основная роль в формировании иммунного ответа при туберкулезной инфекции.
Именно система фагоцитов, включающая мононуклеары периферической крови, дендритные клетки и тканевые макрофаги (Мф), обеспечивает полноценность презентации антигенов МБТ CD4+ и CD8+ Т-клеткам, инициацию иммунного ответа, активацию лимфоцитов, продукцию провоспалительных цитокинов, активных форм кислорода, азота и простагландинов, чем определяет исход инфицирования макроорганизма и развитие инфекции.
В работах последнего времени в Мф больных туберкулезом выявлены дефекты путей внутриклеточной передачи сигналов активации транскрипции (Stat 1 и АР-I) при стимуляции клеток интерфероном гамма (ИФН-у), которые обусловливают нарушение ответа Мф на регуляторные цитокины, в том числе недостаточность продукции NO и, как следствие, неполноценность микобактери-цидности Мф [9]. Показано также, что в органах мышей с «нокаутированным» геном Stat 4, селективно активируемым Ил-12, формируются гораздо большие, чем у «диких» мышей, гранулемы с массивной лейкоцитарной инфильтрацией и резким снижением уровня экспрессии индуцибельной NO-синтетазы (iNOS), ИФН-у и ИФН-р [12].
Мф, наряду с фибробластами, относятся и к ключевым клеткам разрешения воспале-
биология и экспериментальная медицина
ния. цитокины, продуцируемые Мф в очагах тканевой деструкции (ФНО-а, Ш-Щ Ил-6, Ил-18 и ТРФ-р), влияют на рост и дифферен-цировку фибробластов, синтез компонентов соединительнотканного матрикса и деградацию коллагена [8, 11], обеспечивая тем самым процессы инволюции туберкулеза.
Наиболее полно, как и все характеристики иммунитета при туберкулезе, функциональное состояние мононуклеарно-макро-фагальной системы исследовано при туберкулезе легких. При внелегочном туберкулезе дисфункции фагоцитирующих клеток зарегистрированы только при некоторых локализациях инфекции, вне связи с распространенностью и стадией развития процесса и лишь по отдельным показателям, отражающим активность полиморфноядерных лейкоцитов.
Цель работы — оценка бактерицидного потенциала эффекторов неспецифической реактивности — нейтрофильных грану-лоцитов и активности фагоцитарных реакций перитонеальных макрофагов в ходе развития костно-суставного туберкулеза у кроликов.
Материал и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на 17 кроликах-самцах породы «шиншилла». Костно-суставной туберкулез моделировали по оригинальной методике туберкулезного остита на 14 кроликах. С этой целью в подготовленный троакаром канал в дистальном эпиметафизе бедра внедряли гемостатическую губку, содержащую жидкую культуру M. tuberculosis Erdman в дозе 1х106 клеток, фиксировали фрагментом бедренной кости из участка, расположенного проксимальнее места инокуляции инфекта. Область заражения изолировали от мягких тканей цементной пломбой при тщательном гемостазе. Рану послойно наглухо
ушивали кетгутом. Для обеспечения анальге-зирующего, миорелаксирующего и седатив-ного эффектов использовали 2% раствор Ро-метара (Xylazinum) внутримышечно в объеме 1,0—1,5 мл. Контролем служили интактные (незараженные, неоперированные) кролики (n=3). Выведение кроликов из опыта осуществлялось с соблюдением Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований, предусматривающих гуманное отношение к животным.
Активность фагоцитов изучали через 1, 2 и 3 месяца после заражения в сравнении с интактными кроликами, параллельно с рентгенологической оценкой очага и гистологическим исследованием костной ткани.
Активность кислородзависимых антибактериальных систем нейтрофильных грану-лоцитов (Нф) периферической крови кроликов определяли по их способности к восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ-тест) на 96-луночных платах («Costar»). Результаты реакции оценивали на ИФА Elx808 (BIO-TEK) при длине волны 640 нм и выражали в единицах экстинкции.
Фагоцитоз исследовали в культуре пери-тонеальных Мф (1х106 клеток), полученных из лаважа брюшной полости кроликов, на пластиковых одноразовых чашках Петри (d=40 mm) в отношении клеточной взвеси дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae (1 х 107 клеток), опсонизированных сывороткой мышей. По полученным данным вычисляли: фагоцитарную активность Мф — процент Мф, вовлеченных в фагоцитоз; фагоцитарное число — среднее количество дрожжевых клеток, поглощенных одним макрофагом; показатель завершенности фагоцитоза — количество дрожжевых клеток, переваренных макрофагами за 1,5 часа культивирования; индекс завершенности фагоцитоза — отношение фагоцитарного числа за 1 час культивирования к фагоцитарному числу за 2,5 часа культивирования.
для гистологического изучения участок кости, включающий очаг поражения, фиксировали в 10% формалине, декальцинировали трилоном Б и заливали в целлоидин-парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
В бактериологических исследованиях производили дозированный посев гомогена-та ткани легких на плотную яичную среду левенштейна — йенсена с оценкой массивности роста МБТ через 3 недели инкубации (+37°С).
Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента — Фишера.
Результаты и их обсуждение
Бактериологическое исследование посевов гомогенатов легких зараженных кроликов ни на одном из сроков обследования не обнаружило роста M. tuberculosis Erdman, что свидетельствует о локальном характере туберкулезного поражения коленного сустава и отсутствии генерализации специфического процесса.
через 1 месяц после инфицирования в медиальном мыщелке рентгенологически четко визуализировался костный очаг диаметром около 2 мм, отмечались незначительная периостальная реакция в области заражения и явления остеопороза. При этом подвижность в области коленного сустава была ограничена незначительно и воспалительные изменения макроскопически выражены слабо. Гистологическое исследование выявило небольшой некротический очаг в костном мозге эпиметафиза бедренной кости, резорбцию остеокластами близлежащих костных балок и их секвестрацию.
через 2 месяца после заражения на рентгенограмме зарегистрировано увеличение размеров очага до 6 мм, нарастание явлений периостита в области заражения и увеличение локального остеопороза. При анализе
гистологических срезов бедренной кости обнаружено разрушение кортикального слоя и хряща, лимфоидная инфильтрация на границе некротического очага, атрофия и секвестрация костных балок. В субсиновиальном слое рыхлая соединительная ткань замещалась плотной фиброзной. Параллельно отмечены и признаки репаративных процессов в костной ткани: пролиферация остеобластов на поверхности костных балок и молодая остеоидная ткань с рыхлыми фиброзными структурами рядом с очагом поражения.
Через 3 месяца после заражения инфильтрация мягких тканей в области вмешательства стала значительной, появились выбухание кости, ограничение подвижности в суставе и сгибательная контрактура. Рентгенологически наблюдались распространение очага из медиального мыщелка на метафиз и выраженные явления репаративного остео-пороза с наличием единичных мощных костных балок, расположенных по осям нагрузки. Периостальная реакция распространялась до дистальных отделов диафиза. Гистологически в дистальном эпиметафизе бедренной кости определялся крупный очаг творожистого некроза, окруженный слоем грануляционной ткани. Рядом с очагом отмечены участки молодой и созревающей остеоидной ткани с волокнистыми структурами, богатой капиллярами и новообразованными костными балками. В ближайшем к ним участке кости выявлен еще один признак репарации костной ткани — частоколы из остеобластов по наружному краю кортикального слоя.
Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно говорить о преобладании в первые 2 месяца после заражения в очагах специфического поражения костной ткани элементов альтеративного воспаления, а через 3 месяца — выраженного экссудативно-некротического процесса с начальными проявлениями продуктивной реакции и отчет-
ливым фиброзированием синовиальной оболочки.
Исследование состояния фагоцитов кроликов начато через 1 месяц после заражения M. tuberculosis Erdman после заживления операционной раны и стихания реактивного воспаления в ней, когда в кости уже имелся очаг специфического поражения с преобладанием альтерации.
Анализ фагоцитоза перитонеальных Мф зараженных кроликов показал, что через 1 и 2 месяца после заражения отмечалась тенденция к его угнетению (рис. 1).
Рис. 1. Фагоцитарная активность (а) и показатель завершенности фагоцитоза (б) перитонеальных макрофагов кроликов, зараженных 1*106M. tuberculosis Erdman, в ходе развития костно-суставного туберкулеза. По оси абсцисс — срок после заражения (в месяцах). * — достоверность различий по сравнению с интактной группой
Так, через 1 месяц после инфицирования фагоцитарное число стало в 1,6 раза меньше, чем у интактных кроликов, индекс завершенности фагоцитоза — в 1,2 раза.
Полученные результаты, по-видимому, отражают развивающееся при прогрессиро-вании инфекции подавление функциональной активности Мф, которое сменяет активацию фагоцитов на ранних стадиях туберкулеза [13].
Достоверная ингибиция фагоцитарных показателей в данном исследовании зарегистрирована через 3 месяца после заражения как в отношении поглотительной, так и переваривающей способности Мф. Фагоцитарная активность снизилась при этом в 1,8 раза (до 41,3% против 72,7% у интактных мышей; р<0,05), фагоцитарное число — в 1,5 раза (до 4,04 против 6,01 дрожжевых клеток). Переваривающая функция Мф была угнетена еще более значительно. Так, показатель завершенности фагоцитоза уменьшился в 5,7 раза (до 53,7 против 305,3 дрожжевых клеток; р<0,05), а индекс завершенности фагоцитоза — в 2 раза (до 1,53 усл. ед. против 3,05 усл. ед.; р<0,05).
Необходимо подчеркнуть более позднее подавление фагоцитоза Мф при костно-сус-тавном туберкулезе у кроликов по сравнению с теми же показателями при генерализованном туберкулезе у мышей (с 26-го дня после заражения), опубликованными нами ранее [3]. Вероятнее всего, задержка ингиби-ции Мф при туберкулезе кости в первые 2 месяца после инфицирования связана с очаговым характером инфекции.
Выявленное при экспериментальном остите отчетливое угнетение поглотительной и переваривающей функций перитонеальных Мф можно отнести к проявлениям вторичного иммунодефицита, отмеченного у 90% больных при различных локализациях вне-легочного туберкулеза. Оно зафиксировано именно на фоне распространенного некротического компонента специфического вос-
паления в костной ткани. Аналогичные данные получены у больных туберкулезным спондилитом. В этом случае, как и при любом воспалительном процессе с превалированием экссудативно-некротического компонента над продуктивным, отмечается значительное угнетение бактерицидной активности Мф [1].
Параллельно оценке эффективности фагоцитоза Мф нами исследовалась активность кислородзависимых антибактериальных систем полиморфно-ядерных лейкоцитов (ней-трофильных гранулоцитов) как эффекторов врожденного иммунитета, обеспечивающих неспецифический протективный ответ на ранних фазах инфекции [2, 10]. При этом учитывалось, что антимикробная и цитоли-тическая функция лейкоцитов обусловлена активацией кислородзависимого метаболизма и генерации при этом биоцидных окси-дантов, ведущую роль среди которых играют активные радикалы кислорода.
Анализ полученных результатов показал, что на всех исследованных сроках развития экспериментального костно-суставного туберкулеза наблюдалось снижение суперок-сидпродуцирующей активности нейтрофи-лов (рис. 2).
Рис. 2. Спонтанная продукция супероксидных радикалов нейтрофильными гранулоцитами кроликов, зараженных 1*106 M. tuberculosis Erdman, в ходе развития костно-суставного туберкулеза. * — достоверность различий по сравнению с интактной группой
При этом если через 1 месяц после заражения спонтанная продукция супероксида нейтрофилами имела лишь тенденцию к снижению, то через 2 месяца ингибиция показателя стала достоверной. Супероксидпро-дуцирующая активность нейтрофилов у зараженных кроликов снизилась до 0,26± ±0,05 усл. ед. (57,4%) против 0,46±0,05 усл. ед. в интактном контроле (р<0,02). Через 3 месяца после инфицирования спонтанная реакция восстановления НСТ составила 0,31± ±0,20 усл. ед. и оставалась на достоверно более низком уровне (67,5%), чем в интактной группе (р<0,01).
Функциональная несостоятельность ней-трофильных гранулоцитов, развивающаяся при прогрессировании туберкулеза, по данным Е. Ф. Чернушенко с соавторами [7] и Т. Е. Кисиной с соавторами [4], обусловлена, скорее всего, переключением иммунного ответа на ТЬ2-реакцию. Среди прочих дисфункций протективного ответа это сопровождается, как показано на экспериментальной модели «реакции трансплантат против хозяина» (РТПХ), угнетением активности кислородзависимых антибактериальных систем нейтрофильных гранулоцитов [6]. Ингибиция супероксидпродуцирующей активности нейтрофилов крови зарегистрирована и при некоторых экстрапульмональ-ных туберкулезных поражениях [5].
Выводы
Таким образом, на модели туберкулезного остита у кроликов, вызванного M. tuberculosis Erdman, установлено, что развитие специфического воспалительного процесса влечет за собой изменение функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов и перитонеальных макрофагов: подавление спонтанной супероксидпродуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов, развивающееся через 2 месяца после инфи-
цирования; угнетение поглотительной и в большей степени переваривающей функции перитонеальных макрофагов через 3 месяца после заражения.
Согласно полученным нами данным, динамика состояния фагоцитов отражала структурные изменения в эпиметафизе бедренной кости: преобладание в первые 2 месяца после заражения в очагах специфического поражения костной ткани элементов альте-ративного воспаления, а через 3 месяца — выраженного экссудативно-некротического процесса с начальными проявлениями продуктивной реакции и отчетливым фибрози-рованием синовиальной оболочки.
Оценка активности фагоцитирующих клеток при костно-суставном туберкулезе позволит не только определить степень этих нарушений, но и избрать путь их иммуно-коррекции.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Иммунный статус больных активным туберкулезным спондилитом/В. Н. Гусева, В. М. Иванов, Е. И. Потапенко и др.//Про-блемы туберкулеза и болезней легких.— 2003.— № 6.— С. 25—28.
2. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения/В. Н. Кокряков.— СПб.: Наука, 1999.
3. Коррекция функциональной активности макрофагов дипептидом бестимом при экспериментальном туберкулезе/Н. В. За-болотных, Т. И. Виноградова, В. Г. Конусо-ва//Медицинская иммунология.— 2003.— Т. 5.— № 5—6.— С. 591—598.
4. Нарушения специфического иммунного ответа у больных туберкулезом легких/ Т. Е. Кисина, И. С. Фрейдлин, Б. Е. Кно-ринг и др.//Медицинская иммунология.— 2006.— Т. 8.— № 2—3.— С. 270—271.
5. Платова Л. Ф. Состояние иммунной системы при туберкулезных увеитах и анализ иммуномодулирующих эффектов
полиоксидония: автореф. дис. ... канд. мед. наук/Л. Ф. Платова.— Пермь, 2002.— 22 с.
6. Роль активных форм кислорода в Th1/ ТЪ2-поляризации иммунного ответа/ В. О. Ткачев, О. М. Пермиков, Н Н Вольский и др.//Медицинская иммунология.— 2007.— Т. 9.— № 2—3.— С. 165—166.
7. Частота нарушений функциональной активности фагоцитирующих клеток при впервые выявленном туберкулезе легких/
E. Ф. Чернушенко, Л. П. Кадан, И. Ф. Ильинская и др.//Медицинская иммунология.—
2002.— Т. 4.— № 2.— С. 266.
8. IL-18 downregulates collagen, production in human dermal fibroblasts via the ERK pathway/H.J. Kim, S. B. Song, J. M. Choi et al.// J. Invest. Dermatol.— 2010.— Vol. 130.— № 3.— P. 706—715.
9. Impaired activation of Stat1 and c-Jun as a possible defect in macrophages of patients with active tuberculosis/H. Esquivel-Solis,
F. Quinones-Falconi, A. Zarain-Herzberg et al.//Clin. Exp. Immunol.— 2009.— Vol. 158.— № 1.— P. 45—54.
10. Phenotypic modulation in Mycobacterium tuberculosis infected neutrophil during tuberculosis/S. Pokkali, P. Rajavelu, R. Sud-hakar et al.//Indian. J. Med. Res.— 2009.— Vol. 130.— № 2.— P. 185—192.
11. Role of Wnt-5A in interleukin-1p-induced matrix metalloproteinase expression in rabbit temporomandibular joint condylar chondrocytes/X. Ge, X. Ma, J. Meng et al.// Arthritis Rheum.— 2009.— Vol. 60.— № 9.— P. 2714—2722.
12. Sugawara I. Relative importance of STAT4 in murine tuberculosis/I. Sugawara, H Yamada, S. Mizuno//J. Med. Microbiol.—
2003.— Vol. 52.— № 1.— P. 29—34.
13. The role of prostaglandin E2 in the immuno-pathogenesis of experimental pulmonary tuberculosis/M. J. Rangel, G. I. Estrada, G. De La Luz et al.//Immunol.— 2002.— Vol. 106.— № 2.— P. 257—266.
N. V. Zabolotnykh, T. I. Vinogradova, S. N. Vasilyeva, A. S. Kaftyrev
FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHILE LEUKOCYTES AND PERITONEAL MACROPHAGES IN EXPERIMENTAL TUBERCULOSIS OF BONES AND JOINTS
The state of oxygen-dependent antibacterial systems of neutrophilic granulocytes and phagocytic activity of peritoneal macrophages was studied in process of development of bone and joint tuberculosis on the model of tuberculous osteitis in rabbits infected with M. tuberculosis Erdman. Suppression of spontaneous superoxide-producing activity of rabbits' neutrophilic granulocytes developing in 2 months after the infection against the background of alternative inflammation in the foci of specific bone tissue inflammation was demonstrated. Three months after the infec-
tion, suppression of intake and digestive function of peritoneal macrophages was detected. It was associated with specific lesion of bone tissue, marked necrotic component and massive fibrous changes in synovial membrane. The established disturbance of functional phagocytic activity substantiates inclusion of immunocorrecting preparation into complex therapy of tuberculosis of bones and joints.
Keywords: experimental tuberculosis of bones and joints, macrophages, neutrophilic granulocytes, phagocytosis, free oxygen radicals.
Контактная информация: Заболотных Наталья Вячеславовна, доктор мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории патоморфологии и экспериментального туберкулеза Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии, 191036, г. Санкт-Петербург,Лиговский пр., 2—4, тел. 8 (812) 579-25-84
Материал поступил в редакцию 16.02.2010
