Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов и состояние гемостаза у больных острым деструктивным панкреатитом

Савченко А.А.; Борисов А.Г.; Здзитовецкий Д.Э.; Кудрявцев Игорь Владимирович; Медведев А.Ю.; Гвоздев И.И.; Мошев А.В.

Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ОрЫгЫНаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbW Meditsinskaya Immunologiya 2018, Т. 20, № 4, стр. 551-560 F ^ ,, 1 . . 2018, Vol. 20, No 4, pp. 551-560

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ И СОСТОЯНИЕ ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ДЕСТРУКТИВНЫМ ПАНКРЕАТИТОМ

Савченко А.А.1' 2, Борисов А.Г.1, 2, Здзитовецкий Д.Э.2, Кудрявцев И.В.3' 4, Медведев А.Ю.5, Гвоздев И.И.1, Мошев А.В.1

1ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр „Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук"», обособленное подразделение «НИИмедицинских проблем Севера», г. Красноярск, Россия

2 ФГБОУВО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения РФ, г. Красноярск, Россия

3 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия

4 ГБОУВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия

5 КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича», г. Красноярск, Россия

Резюме. Целью исследования явилось изучение взаимосвязи между показателями функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и гемостаза у больных острым деструктивным панкреатитом (ОДП). Обследовано 33 больных ОДП. В качестве контроля обследовано 35 здоровых людей аналогичного возрастного диапазона. Уровень фагоцитоза нейтрофилов определяли методом проточной цитометрии с помощью FITC-меченого стафилококкового белка А. Подсчитывали процент флуоресцирующих нейтрофилов (определяли как фагоцитарный индекс) и средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число). Состояние респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов исследовали с помощью хемилюминесцентного анализа. У всех обследованных также исследовали состояние коагуляционного и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Обнаружено, что у больных ОДП при понижении количества фагоцитирующих нейтрофилов в крови наблюдается снижение интенсивности респираторного взрыва в клетках. Причем спонтанный и индуцированный синтез первичных активных форм кислорода (АФК) в нейтрофилах при ОДП реализуется быстрее, чем у здоровых людей, но интенсивность его значительно ниже. Максимум уровня спонтанного и индуцированного синтеза вторичных АФК в нейтрофилах больных значительно выше, чем у здоровых людей, но быстрый его спад в целом характеризует недостаточность респираторного взрыва в клетках. Снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и особенности кинетики синтеза первичных и вторичных АФК может определяться действием поступивших в кровоток ферментов поджелудочной железы и, соответственно, нарушением функциональной активности нейтрофильных грану-лоцитов. Со стороны гемостаза у больных ОДП обнаружены нарушения только в коагуляционном звене, которые определяются повышением содержания фибриногена, растворимых фибрин-моно-

Адрес для переписки:

Кудрявцев Игорь Владимирович

ФГБНУ «Институт экспериментальной медициныI»

197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика

Павлова, 12.

Тел.: 8(812) 234-68-68.

Факс: 8 (812) 234-94-89.

E-mail: igorek1981@yandex.ru

Образец цитирования:

А.А. Савченко, А.Г. Борисов, Д.Э. Здзитовецкий,

И.В. Кудрявцев, А.Ю. Медведев, И.И. Гвоздев,

А.В. Мошев «Функциональная активность нейтрофильных

гранулоцитов и состояние гемостаза у больных острым

деструктивным панкреатитом» // Медицинская

иммунология, 2018. Т. 20, № 4. С. 551-560.

doi: 10.15789/1563-0625-2018-4-551-560

Address for correspondence:

Kudryavtsev Igor V.

Institute of Experimental Medicine

197376, Russian Federation, St. Petersburg,

Acad. Pavlov str., 12.

Phone: 7(812) 234-68-68.

Fax: 7 (812) 234-94-89.

E-mail: igorek1981@yandex.ru

For citation:

A.A. Savchenko, A.G. Borisov, D.E. Zdzitovetskiy, I.V. Kudryavtsev, A.Yu. Medvedev, I.I. Gvozdev, A.V. Moshev "Functional activity of neutrophils and hemostasispattern in patients with acute destructive pancreatitis", Medical Immunology (Russia)/ Meditsinskaya Immunologiya, 2018, Vol. 20, no. 4, pp. 551-560. doi: 10.15789/1563-0625-2018-4-551-560

DOI: 10.15789/1563-0625-2018-4-551-560

мерных комплексов и Д-димера в плазме крови при снижении уровня антитромбина III. Подобное изменение содержания показателей коагуляционного звена гемостаза характерно для воспалительных процессов и свидетельствует об активации коагуляционного каскада и о риске возникновения септических осложнений. У больных ОДП значительно увеличивается количество корреляционных связей между показателями функциональной активности нейтрофилов и параметрами гемостаза. Выявленные взаимосвязи при ОДП отражают сонаправленность изменений функциональной активности нейтрофилов (по показателям фагоцитоза и респираторного взрыва) и свертывающей системы крови (по показателям коагуляционного и сосудисто-тромбоцитарного звена). Изменение функциональной активности нейтрофилов и состояния гемостаза при ОДП, а также особенности взаимосвязи их показателей между собой характеризуют патогенез заболевания и определяют механизмы развития осложнений.

Ключевые слова: острый панкреатит, нейтрофилы, гемостаз, функциональная активность, фагоцитоз, респираторный взрыв

FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHILS AND HEMOSTASIS PATTERN IN PATIENTS WITH ACUTE DESTRUCTIVE PANCREATITIS

Savchenko A.A.a b, Borisov A.G.a b, Zdzitovetskiy D.E.b, Kudryavtsev I.V.c d, Medvedev A.Yu.e, Gvozdev I.I.a, Moshev A.V.a

a Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk, Russian Federation

b Krasnoyarsk State V.F. Voino-Yasenetsky Medical University, Krasnoyarsk, Russian Federation c Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation

d First St. Petersburg State I.P. Pavlov Medical University, Department о/Immunology, St. Petersburg, Russian Federation е Krasnoyarsk Inter-District N.S. Karpovich Clinical Hospital for Emergent Medical Care, Krasnoyarsk, Russian Federation

Abstract. The aim of present study was to investigate relationships between indicators of functional activity of neutrophilic granulocytes, and hemostasis parameters in patients with acute destructive pancreatitis (ADP). The study included thirty-three patients with ADP. 35 healthy persons were examined as a control group. The phagocytosis level in neutrophils was determined by flow cytometry using FITC-labeled staphylococcal protein A. We have calculated the percentage of fluorescent neutrophils as phagocytic index, and average cell fluorescence assumed phagocytic number. The intensity of respiratory burst observed in neutrophil samples was evaluated using chemiluminescence assay. All the persons under study were also tested for blood coagulation and vascular-platelet hemostasis. It was found that the ADP patients with decreased number of phagocytic neutrophils in the blood showed a decrease in respiratory burst intensity in the neutrophils. Moreover, spontaneous and induced synthesis of the primary reactive oxygen species (ROS) in neutrophils of ADP patients proceeded faster than in healthy people, but its intensity was much lower. The maximal level of spontaneous and induced synthesis of secondary ROS in neutrophils of patients was significantly higher than in healthy individuals, but its rapid may be generally characterized by insufficient respiratory burst in these patients. A reduced neutrophil phagocytic activity and kinetic characteristics of primary and secondary ROS synthesis may be attributed to the effects produced by pancreatic enzymes entering blood flow which may alter functional activity of the blood neutrophils. Concerning hemostasis in patients with ADP, some disturbances were found only in the coagulation link which seem to depend on increase in fibrinogen, soluble fibrin monomer complexes and D-dimer in blood plasma, along with reduced antithrombin III levels. Such a change in blood coagulation indexes is typical to inflammatory processes and presumes activation of the coagulation cascade and higher risk of septic complications. In patients with ADP, we have found a significantly increased number of correlations between indicators of functional activity of neutrophils and hemostasis parameters. This analysis revealed a relationship by the patients with ADP reflect some unidirectional changes in functional activity of neutrophils (as phagocytosis and respiratory burst), and blood coagulation parameters (as blood clotting and vascular/ platelet links). The changes in functional activity of neutrophils and the state of hemostasis in the ADP

patients, as well as correlations between their alterations are omvolved into the pathogenesis of this disorder, and determine potential mechanisms for evolving complications.

Keywords: acute pancreatitis, neutrophils, hemostasis, functional activity, phagocytosis, respiratory burst

Исследование выполнено при финансовой поддержке Краевого государственного автономного учреждения «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности».

Введение

Острый деструктивный панкреатит (ОДП) в настоящее время остается одной из проблемных областей неотложной абдоминальной хирургии. Несмотря на применение в лечении ОДП современных детоксикационных технологий, разработку новых методов хирургических вмешательств, совершенствование медикаментозной терапии, данная патология характеризуется высокой летальностью: от 15 до 40% при стерильном панкреонекрозе и до 80% при инфицированном панкреонекрозе с гнойно-септическими осложнениями [2, 8, 21].

Согласно ферментативной теории развития острого панкреатита, некротические процессы, эндотоксикоз, полиорганную недостаточность связывают с резкой нефизиологической активацией пищеварительных ферментов в поджелудочной железе с последующим поражением ее тканей этими ферментами и их поступлением в кровоток [15, 17]. Системное повреждение сосудистого эндотелия при ОДП ведет к активации свертывающей системы, что в свою очередь требует запуска механизмов распознавания поврежденных клеток и удаления активированных факторов свертывания из кровотока, в которых ключевую роль играют клетки врожденного иммунитета. Нарушения в системе гемостаза и иммунной системе, находясь в прямой зависимости от глубины патоморфологических изменений в поджелудочной железе, взаимно отягощают друг друга и являют пример срыва межсистемной регуляции [14, 21]. Однако особенности функционирования нейтрофильных гранулоцитов как основных клеток врожденного иммунитета при ОДП до сих пор не изучены.

В связи с этим целью исследования явилось изучение взаимосвязи между показателями функциональной активности нейтрофильных грану-лоцитов и гемостаза у больных ОДП.

Материалы и методы

Под наблюдением находилось 33 больных ОДП (19 мужчин и 14 женщин) средней и тяжелой степени тяжести, проходивших лечение в отделениях хирургии и отделении реанимации

и интенсивной терапии КБУЗ «КМКБСМП имени Н.С. Карповича» г. Красноярска. Средний возраст больных составил 46,8±6,4 года. Из исследования были исключены больные с ОДП легкой степени и те, у которых ОДП явился осложнением травмы брюшной полости, в том числе и послеоперационный. Исходную степень тяжести состояния больных определяли по шкале SAPS II [13]. Для оценки тяжести ОДП и прогноза развития заболевания применяли шкалу критериев первичной экспресс-оценки тяжести острого панкреатита Санкт-Петербургского НИИ скорой помощи имени И.И. Джанелидзе [1]. Наличие и степень выраженности полиорганной недостаточности исходно и в динамике определяли по шкале SOFA [20]. При оценке степени тяжести синдрома системной воспалительной реакции придерживались критериев ACCP/SCCM [7]. В качестве контроля обследовано 35 здоровых людей аналогичного возрастного диапазона.

Уровень фагоцитоза нейтрофильных грану-лоцитов определяли методом проточной цито-метрии с помощью FITC-меченого (fluorescein isothiocyanate) стафилококкового белка А [3]. Конъюгацию выполняли следующим образом: к стафилококковому белку А (разведен в би-карбонатном буфере, рН = 9,0) добавляли FITC (предварительно растворяли в ДМСО до концентрации 1 мкг/мл), инкубировали в темноте в течение 1 часа, трижды отмывали и по стандарту мутности доводили концентрацию белка до 1 млн/мл. К 100 мкл гепаринизированной крови добавляли 10 мкл FITC-меченого белка А и инкубировали 30 минут при температуре 37 °С. Лизис эритроцитов проводили по безотмывочной технологии с использованием реагента VersaLyse (Beckman Coulter, США). Для гашения адгезиро-ванного на поверхности нейтрофилов FITC-ме-ченого белка А к суспензии клеток добавляли раствор трипанового синего (0,2 мг/мл). Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC-500 (Beckman Coulter, США). В каждой пробе анализировали не менее 50000 нейтрофилов. Подсчитывали процент флуоресцирующих нейтрофилов (определяли как фагоцитарный индекс — ФИ) и средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число — ФЧ).

Состояние респираторного взрыва нейтро-фильных гранулоцитов исследовали с помощью хемилюминесцентного анализа [5]. В качестве индикаторов хемилюминесценции использовали

люминол и люцигенин. Оценка спонтанной и зи-мозан-индуцированной хемилюминесценции осуществлялась в течение 90 минут на 36-каналь-ном хемилюминесцентном анализаторе «БЛМ-3607» (Россия). Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Tmax), максимальное значение интенсивности (Imax), а также площадь под кривой (S) хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, оценивали отношением площади индуцированной хемилюминесценции ^инд.) к площади спонтанной ^спонт.) и определяли как индекс активации ^инд.^спонт.).

У всех обследованных на анализаторе STA-COMPACT (Швейцария) исследовались следующие показатели коагуляционного гемостаза: протромбиновый индекс (ПТИ), содержание фибриногена, активированное частичное тром-бопластиновое время (АЧТВ), уровень Д-димера, растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), антитромбина III (АТ III). На агрего-метре LA230-2 БИОЛА (Россия) изучались показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза: спонтанная агрегация тромбоцитов (САТ) и индуцированная, с применением в качестве индукторов аденозин-дифосфата (АДФ) в дозах 0,1 мкМ и 5 мкМ и адреналина в дозе 10 мкг/мл.

Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильно-го размаха в виде 1 и 3 квартилей (Q025 и Q0 75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент ранговой корреляции по Спирмену. Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007).

Результаты

Исследование функциональной активности нейтрофилов позволило установить, что у больных ОДП снижен ФИ нейтрофилов относительно контрольных значений (табл. 1). При исследовании интенсивности люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов обнаружено, что у пациентов с ОДП снижено время выхода

на максимум и площадь под кривой спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции. При исследовании интенсивности люми-нол-зависимой хемилюминесценции выявлено, что у больных ОДП повышается максимум интенсивности и снижается площадь под кривой спонтанной и зимозан-индуцированной хеми-люминесценции.

Изучение состояния коагуляционного и со-судисто-тромбоцитарного гемостаза позволило установить, что у больных ОДП снижена величина ПТИ и концентрация антитромбина III, но при повышении содержания фибриногена, РФМК и Д-димера, а также при увеличении ТВ (табл. 2).

С помощью корреляционного анализа обнаружено, что у лиц контрольной группы время выхода на максимум спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов положительно взаимосвязан с АЧТВ (г = 0,66, р = 0,039), тогда как время выхода на максимум индуцированной люминесценции данного типа уже отрицательно коррелирует с уровнем адре-налин-индуцированной агрегацией тромбоцитов (г = -0,64, р = 0,044). Взаимосвязь между индексом активации люминол-зависимой хемилюми-несценции нейтрофилов и содержанием РФМК у лиц данной группы также является отрицательной (г = -0,72, р = 0,019).

У больных ОДП ФИ нейтрофилов отрицательно взаимосвязан с уровнем Д-димера в сыворотке крови (г = -0,54, р = 0,033). У данных пациентов площадь под кривой спонтанной и зи-мозан-индуцированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов положительно коррелирует с уровнем фибриногена (г = 0,54, р = 0,030 и г = 0,52, р = 0,040 соответственно), РФМК (г = 0,54, р = 0,030 и г = 0,59, р = 0,016 соответственно) и Д-димера (г = 0,68, р = 0,005 и г = 0,67, р = 0,006 соответственно). Взаимосвязь между максимумом интенсивности индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов и уровнем адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов также является положительной (г = 0,70, р = 0,003). Максимум интенсивности зимозан-индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов положительно взаимосвязан с уровнями АДФ- (при 5 мкМ) и адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов (г = 0,52, р = 0,033 и г = 0,57, р = 0,022 соответственно). Площадь под кривой индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов у больных ОДП отрицательно коррелирует с уровнем антитромбина III (г = -0,48, р = 0,045) и положительно — с содержанием РФМК (г = 0,51, р = 0,033).

ТАБЛИЦА 1. ФАГОЦИТОЗ И ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ ОДП, Ме (Q0,25-Q0,75) TABLE 1. PHAGOCYTIC ACTIVITY AND LUCIGENIN-DEPENDENT CHEMILUMINESCENCE (LDCL) OF PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHILS (Ne) FROM PATIENTS WITH ACUTE DESTRUCTIVE PANCREATITIS (ADP), Ме (Q0,25-Q0,75)

Показатели Indicatros Контроль Healthy control n = 35 ОДП Patients with ADP n = 33 P

Фагоцитоз Phagocytic activity of neutrophils

ФИ нейтрофилов, % Ne index of phagocytosis, % 54,6 (21,9-89,8) 23,7 (14,9-32,1) < 0,001

ФЧ нейтрофилов Ne phagocytic number 57,5 (23,8-114,0) 51,4 (45,1-55,5)

Спонтанная люцигенин-зависимая хемилюминесценция Spontaneous LDCL activity of neutrophils

Tmax, сек. Tmax, sec 2093 (1425-2881) 1537 (1123-2297) 0,048

Imax, о.е. x 103 7,74 (2,61-16,54) 5,35 (3,61-9,11)

S, о.е. x сек. x 105 S, о.е. x sec x 105 15,16 (3,95-41,11) 0,44 (0,34-0,86) < 0,001

Зимозан-индуцированная люцигенин-зависимая хемилюминесценция Zymosan-induced LDCL activity of neutrophils

Tmax, сек. Tmax, sec 1738 (1389-2331) 1311 (1031-1431) 0,006

Imax, о.е. x 103 14,14 (7,59-28,96) 12,69 (9,11-26,19)

S, о.е. x сек. x 105 S, о.е. x sec. x 105 25,16 (10,70-64,61) 1,02 (0,75-1,32) < 0,001

Sинд./Sспонт. Sind/Ssp 1,77 (1,17-3,11) 2,38 (1,74-4,08)

Спонтанная люминол-зависимая хемилюминесценция Spontaneous LDCL activity of neutrophils

Tmax, сек. Tmax, sec 969 (567-1559) 1344 (733-2315)

Imax, о.е. x 103 10,83 (4,06-30,88) 51,99 (30,22-104,28) < 0,001

S, о.е. x сек. x 105 S, о.е. x sec. x 105 14,91 (4,49-50,94) 4,99 (1,62-9,22) < 0,001

Зимозан-индуцированная люминол-зависимая хемилюминесценция Zymosan-induced LDCL activity of neutrophils

Tmax, сек. Tmax, sec 1072 (796-1459) 964 (766-1619)

Imax, о.е. x 103 21,25 (7,55-62,59) 132,05 (96,59-143,14) < 0,001

S, о.е. x сек. x 105 S, о.е. x sec. x 105 24,34 (9,21-84,16) 11,20 (6,61-21,10) 0,007

Sинд./Sспонт. Sind/Ssp 1,89 (1,34-2,87) 2,50 (1,52-5,20)

Примечание. Tmax - время выхода на максимум; Imax - максимальное увеличение интенсивности; S - площадь под кривой люминесценции; винд./ вспонт. - соотношение между индуцированной зимозаном и спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции.

Note. Tmax, time to maximum; Imax, maximum intensity value, reflecting the maximum reactive oxygen species level synthesis; S, the area under the curve, describing total synthesis of reactive oxygen species during 90 min. LDCL, lucigenin-dependent chemiluminescence; Sind/Ssp, the ration between zymosan-induced and spontaneous LDCL.

ТАБЛИЦА 2. ПОКАЗАТЕЛИ КОАГУЛЯЦИОННОГО И СОСУДИСТО-ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ ОДП,

Ме (Q0,25-Q0,75)

TABLE 2. INDICATORS OF COAGULATION AND VASCULAR-PLATELET HEMOSTASIS FROM PATIENTS WITH ACUTE DESTRUCTIVE PANCREATITIS (ADP), Ме (Q0,25-Q0,75)

Показатели Indicators Контроль Healthy control n = 57 ОДП Patients with ADP n = 33 P

ПТИ, % Prothrombin index, % 101 (94-113) 89 (82-96) < 0,001

Фибриноген, г/л Fibrinogen, g/L 2,81 (2,36-3,31) 3,84 (2,97-5,03) < 0,001

РФМК, мг % SFMC, mg % 7(5-9) 22 (10-26) < 0,001

Антитромбин III, % Antithrombin III, % 98 (89-103) 88 (73-102) 0,021

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ТВ, сек. TT, sec 15,3 (14,2-16,6) 21,6 (19,8-24,1) < 0,001

АЧТВ, сек. APTT, sec 33,5 (29,4-35,8) 30,4 (27,9-33,9)

Д-димер, нг/мл D-dimer level, ng/ml 220 (168-220) 936 (566-1420) < 0,001

Тромбоциты, 109/л Platelets, 109/L 217,5 (187,0-242,1) 201,5 (152,5-285,0)

АТ с АДФ 5 мкМ, % SPA + ADP 5|M, % 42,2 (27,6-52,8) 44,2 (31,8-57,7)

АТ с АДФ 0,1 мкМ, усл. ед. SPA + ADP 0,1 |M, o.e. 1,7 (1,5-2,3) 2,1 (1,6-2,5)

АТ с адреналином 10 мкг/мл, % SPA + Adrenaline 10 mkg/mL, % 36,9 (21,2-47,9) 44,2 (22,5-62,1)

Примечание. ПТИ - протромбиновый индекс; РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы; ТВ - тромбиновое время; АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время; АТ - агрегация тромбоцитов; АДФ - аденозиндифосфат.

Note. SFMC, soluble fibrin monomer complex; TT, thrombin time; APTT, activated partial thromboplastin time; SPA, spontaneous platelet aggregation; ADP, adenosine diphosphate.

Обсуждение

Иммунопатогенез ОДП на сегодняшний день во многом рассматривается с позиций системного воспалительного ответа, важную роль в котором осуществляют нейтрофильные гранулоциты [16, 19, 23]. Однако воздействие активированных ферментов поджелудочной железы, поступивших в кровоток, должно модулировать функциональную активность нейтрофилов. Нами обнаружено, что у больных ОДП в 2,3 раза снижен процент фагоцитирующих нейтрофилов периферической крови в сравнении с выявленным у здоровых людей.

Респираторный взрыв, опосредуя процессы фагоцитоза и киллинга, является важным механизмом, лежащим в основе реактивности фагоцитирующих клеток [4, 9, 12]. Уровень синтеза

первичных и вторичных форм кислорода при респираторном взрыве нейтрофилов мы исследовали с помощью двух хемилюминесцентных индикаторов: люцигенина и люминола. Люцигенин окисляется и люминесцирует только под влиянием супероксид-радикала, который определяется как первичная активная форма кислорода (АФК) и синтезируется в системе NADPH-оксидазы [4, 5]. Люцигенин не проходит через мембрану клеток и связывается с супероксид-радикалом только во внеклеточном пространстве. Соответственно, исследование люцигенин-зависимой хемилюми-несценции клеток позволяет охарактеризовать состояние активности NADPH-оксидазы и уровень выделения супероксид-радикала для реализации механизма внешнего киллинга у больных ОДП. Обнаружено, что при ОДП при снижении

спонтанного и индуцированного уровней синтеза супероксид-радикала уменьшается время выхода на максимум. Время выхода на максимум характеризует скорость развития респираторного взрыва в случае регуляторного (спонтанной хемилюминесценции) или антигенного воздействия (при зимозан-индуцированной хемилюминесценции) на клетку [4, 5]. Снижение времени выхода на максимум спонтанной люцигенин-за-висимой хемилюминесценции при РП характеризует высокую чувствительность нейтрофилов к воздействию.

Цитотоксическая активность нейтрофильных гранулоцитов определяется уровнем продукции как первичных, так и вторичных АФК (ги-дроксильный радикал, перекись водорода и др.). В формировании пула вторичных форм кислорода в нейтрофилах принимают участие такие ферменты, как супероксиддисмутаза, каталаза, миелопероксидаза и др. [4, 5, 18]. Люминол способен вступать в хемилюминесцентную реакцию и с первичными, и с вторичными АФК, проникать внутрь клеток и вступать в реакцию в фа-голизосомах. Установлено, что у больных ОДП значительно повышается максимум интенсивности спонтанного и зимозан-индуцированно-го синтеза вторичных АФК, но при снижении площади под кривыми хемилюминесценции. Подобная кинетика синтеза вторичных АФК является оригинальной и определяется быстрым спадом хемилюминесцентной реакции после достижения максимума. Необходимо отметить, что при высокой интенсивности респираторного взрыва в нейтрофилах повышается и максимум интенсивности и площадь под кривой хемилю-минесцентной реакции [4]. Особенность кинетики синтеза вторичных АФК в нейтрофильных гранулоцитах больных ОДП, возможно, связана с быстрым расходованием метаболических ресурсов, когда способность клеток к генерации респираторного взрыва высокой интенсивности приводит к истощению метаболических резервов и, соответственно, быстрому спаду хемилюми-несцентной кривой.

При исследовании гемостаза у больных ОДП обнаружены изменения только в коагуляцион-ном звене. У обследованных пациентов обнаружено повышение содержания фибриногена, характерное для воспалительных заболеваниях [6, 10]. Повышение количества РФМК и Д-димера при снижении величины ПТИ характеризует активацию коагуляционного каскада у больных ОДП. При этом понижение уровня антитромбина III в плазме крови свидетельствует о риске возникновения тромбоза и развития ассоциированного с ДВС-синдромом сепсиса [11, 22].

Проанализирована корреляционная зависимость между показателями функциональной активности нейтрофилов и параметрами коагу-ляционного и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у здоровых людей и больных ОДП. Установлено, что у здоровых людей с показателями гемостаза взаимосвязаны только параметры синтеза вторичных АФК нейтрофилами (люминол-зависимая хемилюминесценция). При этом выявляется положительная корреляционная связь между временем выхода на максимум спонтанного синтеза АФК и АЧТВ — показателя, характеризующего эффективность «внутреннего» и общего пути свертывания, тогда как с индексом активации нейтрофилов и временем выхода на максимум индуцированного синтеза вторичных АФК отрицательно взаимосвязаны, соответственно, количество РФМК в плазме и уровень адрена-лин-индуцированной агрегации.

У больных ОДП обнаружены взаимосвязи показателей гемостаза с параметрами фагоцитоза, а также уровнями синтеза и первичных и вторичных АФК нейтрофилами. Так, между ФИ нейтрофилов обследованных пациентов и содержанием Д-димера выявляется отрицательная взаимосвязь, характеризующая ингибирование фагоцитарной активности при активации процессов фибринолиза. Кинетические показатели активности NADPH-оксидазы нейтрофильных гранулоцитов у больных ОДП только положительно взаимосвязаны с уровнями содержания фибриногена, РФМК, Д-димера и адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Кинетические показатели синтеза вторичных АФК отрицательно взаимосвязаны с количеством антитромбина III и положительно — с уровнями РФМК и АДФ- и адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Данная система корреляционных связей характеризует сонаправлен-ность процессов дыхательного взрыва нейтрофи-лов (по уровню синтеза первичных и вторичных АФК) и изменение активности свертывающей системы крови (по показателям коагуляционно-го и сосудисто-тромбоцитарного звена).

Таким образом, у больных ОДП при понижении количества фагоцитирующих нейтрофилов в крови наблюдается снижение интенсивности респираторного взрыва в клетках. Причем спонтанный и индуцированный синтез первичных АФК в нейтрофилах при ОДП реализуется быстрее, чем у здоровых людей, но интенсивность его значительно ниже. Максимум уровня спонтанного и индуцированного синтеза вторичных АФК в нейтрофилах больных значительно выше, чем у здоровых людей, но быстрый его спад в целом характеризует недостаточность респираторного взрыва в клетках. Снижение фагоци-

тарной активности нейтрофилов и особенности кинетики синтеза первичных и вторичных АФК может определяться действием поступивших в кровоток ферментов поджелудочной железы и, соответственно, нарушением функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов. Со стороны гемостаза у больных ОДП обнаружены нарушения только в коагуляционном звене, которые определяются повышением содержания фибриногена, РФМК и Д-димера в плазме крови при снижении уровня антитромбина III. Подобное изменение содержания показателей коагуляционного звена гемостаза характерно для воспалительных процессов и свидетельствует об активации коагуляционного каскада и о риске возникновения септических осложнений. У боль-

ных ОДП значительно увеличивается количество корреляционных связей между показателями функциональной активности нейтрофилов и параметрами гемостаза. Выявленные взаимосвязи при ОДП отражают сонаправленность изменений функциональной активности нейтрофилов (по показателям фагоцитоза и респираторного взрыва) и свертывающей системы крови (по показателям коагуляционного и сосудисто-тромбо-цитарного звена). Изменение функциональной активности нейтрофилов и состояния гемостаза при ОДП, а также особенности взаимосвязи их показателей между собой характеризуют патогенез заболевания и определяют механизмы развития осложнений.

Список литературы / References

1. Багненко С.Ф., Толстой А. Д., Краснорогов В.Б., Курыгин А. А., Гринев М.В., Лапшин В.Н., Гольцов В.Р. Острый панкреатит (Протоколы диагностики и лечение) // Анналы хирургической гепатологии, 2006. Т. 11, № 1. С. 60-66. [Bagnenko S.F., Tolstoy A.D., Krasnorogov V.B., Kurygin A.A., Grinev M.V., Lapshin V.N., Goltsov V.R. Acute pancreatitis (diagnostic protocols and treatment). Annaly khirurgicheskoy gepatologii = Annals of Surgical Hepatology, 2006, Vol. 11, no. 1, pp. 60-66. (In Russ.)]

2. Дарвин В.В., Онищенко С.В., Краснов Е.А., Васильев В.В., Лысак М.М., Климова Н.В. Острый деструктивный панкреатит: современное хирургическое лечение // Анналы хирургической гепатологии, 2014. Т. 19, № 4. С. 76-82. [Darvin V.V., Onishhenko S.V., Krasnov E.A., Vasilyev V.V., Lysak M.M., Klimova N.V. Acute destructive pancreatitis: current surgical treatment. Annaly khirurgicheskoy gepatologii = Annals of Surgical Hepatology, 2014, Vol. 19, no. 4, pp. 76-82. (In Russ.)]

3. Мазуров Д.В., Пинегин Б.В. Применение проточной цитометрии для оценки поглотительной и бактерицидной функций гранулоцитов и моноцитов периферической крови // Аллергия, астма и клиническая иммунология, 1999. № 9. С. 154-156. [Mazurov D.V., Pinegin B.V. Application of flow cytometry for evaluating the absorbency and the antibacterial functions of granulocytes and monocytes of peripheral blood. Allergiya, astma i klinicheskaya immunologiya = Allergy, Asthma and Clinical Immunology, 1999, no. 9, pp. 154-156. (In Russ.)]

4. Савченко А.А., Здзитовецкий Д.Э., Борисов А.Г., Лузан Н.А. Хемилюминесцентная активность ней-трофильных гранулоцитов и уровни концентрации цитокинов у больных распространенным гнойным перитонитом // Цитокины и воспаление, 2013. Т. 12, № 1-2. С. 115-119. [Savchenko A.A., Zdzitovetskiy D.E., Borisov A.G., Luzan N.A. Neutrophil chemiluminescent activity and cytokine concentration levels in patients with extensive purulent peritonitis. Tsitokiny i vospalenie = Cytokines and Inflammation, 2013, Vol. 12, no. 1-2, pp. 115-119. (In Russ.)]

5. Шкапова Е.А., Куртасова Л.М., Савченко А.А. Показатели люцигенин- и люминол-зависимой хеми-люминесценции нейтрофилов крови у больных раком почки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010. Т. 149, № 2. С. 201-203. [Shkapova E.A., Kurtasova L.M., Savchenko A.A. The indicate^ of the lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence of blood neutrophils by the patients with kidney cancer. Byulleten eksperimentaVnoy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Vol. 149, no. 2, pp. 201-203. (In Russ.)]

6. Andreassen S.M., Berg L.C., Nielsen S.S., Kristensen A.T., Jacobsen S. mRNA expression of genes involved in inflammation and haemostasis in equine fibroblast-like synoviocytes following exposure to lipopolysaccharide, fibrinogen and thrombin. BMC Vet. Res., 2015, Vol. 11, p. 141.

7. Bone R.S., Balk R.A., Cerra F.B., Dellinger R.P., Fein A.M., Knaus W.A., Schein R.M., Sibbald W.J. American college of Chest Physicians. Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Definitions for sepsis and organ failure and guide lines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit. Care Med., 1992, Vol. 20, no. 6, pp. 864-874.

8. Dick J.F. 3rd, Gardner T.B., Merrens E.J. Acute pancreatitis: New developments and strategies for the hospitalist. J. Hosp. Med., 2016, Vol. 11, no. 10, pp. 724-729.

9. El-Benna J., Hurtado-Nedelec M., Marzaioli V., Marie J.C., Gougerot-Pocidalo M.A., Dang P.M. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunol. Rev., 2016, Vol. 273, no. 1, pp. 180-193.

10. Hoppe B. Fibrinogen and factor XIII at the intersection of coagulation, fibrinolysis and inflammation. Thromb. Haemost., 2014, Vol. 112, no. 4, pp. 649-658.

11. Iba T., Gando S., Saitoh D., Wada H., Di Nisio M., Thachil J. Antithrombin supplementation and risk of bleeding in patients with sepsis-associated disseminated intravascular coagulation. Thromb. Res., 2016, Vol. 145, pp. 46-50.

12. Kovacs I., Horvath M., Kovacs T., Somogyi K., Tretter L., Geiszt M., Petheo G.L. Comparison of proton channel, phagocyte oxidase, and respiratory burst levels between human eosinophil and neutrophil granulocytes. Free Radic. Res., 2014, Vol. 48, no. 10, pp. 1190-1199.

13. le Gall J.-R., Lemeshow S., Saulnier F. A new Simplified Acute Physiology Score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study. JAMA, 1993, Vol. 270, pp. 2957-2963.

14. Lisman T., Porte R.J. Activation and regulation of hemostasis in acute liver failure and acute pancreatitis. Semin. Thromb. Hemost., 2010, Vol. 36, no. 4, pp. 437-443.

15. Maheshwari R., Subramanian R.M. Severe acute pancreatitis and necrotizing pancreatitis. Crit. Care Clin., 2016, Vol. 32, no. 2, pp. 279-290.

16. Okamura D., Starr M.E., Lee E.Y., Stromberg A.J., Evers B.M., Saito H. Age-dependent vulnerability to experimental acute pancreatitis is associated with increased systemic inflammation and thrombosis. Aging Cell, 2012, Vol. 11, no. 5, pp. 760-769.

17. Singh P., Garg P.K. Pathophysiological mechanisms in acute pancreatitis: Current understanding. Indian J. Gastroenterol., 2016, Vol. 35, no. 3, pp. 153-166.

18. Trujillo M. Analysis of the immunity-related oxidative bursts by a luminol-based assay. Methods Mol. Biol., 2016, Vol. 1398, pp. 323-329.

19. van Bijnen S.T., Wouters D., van Mierlo G.J., Muus P., Zeerleder S. Neutrophil activation and nucleosomes as markers of systemic inflammation in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: effects of eculizumab. J. Thromb. Haemost., 2015, Vol. 13, no. 11, pp. 2004-2011.

20. Vincent J.L., Moreno R., Takala J., Willatts S., De Mendonca A., Bruining H., Reinhart C.K., Suter P.M., Thijs L.G. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med., 1996, Vol. 22, no. 7, pp. 707-710.

21. Vinokurov M.M., Saveliev V.V., Gogolev N.M., Yalynskya T.V. Immunomodulation and treatment of acute destructive pancreatitis in a multidisciplinary surgical hospital. Wiad. Lek., 2015, Vol. 68, no. 4, pp. 582-586.

22. Yasuda N., Goto K., Ohchi Y., Abe T., Koga H., Kitano T. The efficacy and safety of antithrombin and recombinant human thrombomodulin combination therapy in patients with severe sepsis and disseminated intravascular coagulation. J. Crit. Care., 2016, Vol. 36, pp. 29-34.

23. Zonneveld R., Molema G., Plotz F.B. Measurement of functional and morphodynamic neutrophil pheno-types in systemic inflammation and sepsis. Crit. Care., 2016, Vol. 20, p. 235.

Авторы:

Савченко А.А. — д.м.н., профессор, руководитель лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии ФГБНУ«Федеральный исследовательский центр „Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук"», обособленное подразделение «НИИмедицинских проблем Севера»; заведующий кафедрой физиологии ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения РФ, г. Красноярск, Россия

Борисов А.Г. — к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр „Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук"», обособленное подразделение «НИИмедицинских проблем Севера»; доцент кафедры инфекционных болезней ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения РФ, г. Красноярск, Россия

Authors:

Savchenko A.A., PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Molecular and Cellular Physiology and Pathology, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical Problems of the North; Head, Department of Physiology, Krasnoyarsk State V.F. Voino-Yasenetsky Medical University, Krasnoyarsk, Russian Federation

Borisov A.G., PhD (Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Molecular and Cellular Physiology and Pathology, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical Problems of the North; Assistant Professor, Department of Infections, Krasnoyarsk State V.F. Voino-Yasenetsky Medical University, Krasnoyarsk, Russian Federation

Здзитовецкий Д.Э. — д.м.н., заведующий кафедрой хирургических болезней им. проф. Ю.М. Лубенского ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения РФ, г. Красноярск, Россия

Кудрявцев И.В. — к.б.н., старший научный сотрудник ФГБНУ«Институт экспериментальной медицины»; ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, кафедра иммунологии, Санкт-Петербург, Россия

Медведев А.Ю. — врач КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича», г. Красноярск, Россия

Гвоздев И.И. — младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр „Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук"», обособленное подразделение «НИИмедицинских проблем Севера», г. Красноярск, Россия

Мошев А.В. — младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр „Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук"», обособленное подразделение «НИИмедицинских проблем Севера», г. Красноярск, Россия

Поступила 15.11.2017 Принята к печати 28.11.2017

Zdzitovetskiy D.E., PhD, MD (Medicine), Head, Yu.M. Lubensky Department of Surgical Diseases, Krasnoyarsk State V.F. Voino-Yasenetsky Medical University, Krasnoyarsk, Russian Federation

Kudryavtsev I.V., PhD (Biology) Senior Research Associate, Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation; First St. Petersburg State I.P. Pavlov Medical University, Department of Immunology, St. Petersburg, Russian Federation

Medvedev A.Yu., Doctor Clin. Med., Krasnoyarsk InterDistrict N.S. Karpovich Clinical Hospital for Emergent Medical Care, Krasnoyarsk, Russian Federation

Gvozdev I.I., Junior Research Associate, Laboratory of Molecular and Cellular Physiology and Pathology, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk, Russian Federation

Moshev A.V., Junior Research Associate, Laboratory of Molecular and Cellular Physiology and Pathology, Krasnoyarsk Research Center, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyark, Russian Federation

Received 15.11.2017 Accepted 28.11.2017

FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHILS AND HEMOSTASIS PATTERN IN PATIENTS WITH ACUTE DESTRUCTIVE PANCREATITIS

Текст научной работы на тему «Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов и состояние гемостаза у больных острым деструктивным панкреатитом»