CC BY
31
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2014 УДК 615.033
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МАНИПУЛЯЦИЯХ
Е.Н. Якушева, А.В. Щулькин, И.В. Черных, Д.С. Титов Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
В исследовании на кроликах изучена функциональная активность гликопро-теина-Р на уровне целостного организма при экспериментальных манипуляциях -проведении «ложной» операции и введении дистиллированной воды. Активность гликопротеина-Р оценивали по анализу фармакокинетики его маркерного субстрата - фексофенадина. Установлено, что исследуемые манипуляции существенно не влияют на функционирование гликопротеина-Р в исследуемые сроки.
Ключевые слова: гликопротеин-Р, «ложная» операция, фексофенадин.
Гликопротеин-Р (Р^) - это мембранный белок-транспортер, который за счет гидролиза АТФ выбрасывает во внеклеточное пространство широкий спектр химически разнородных субстратов, в том числе большое число лекарственных средств и эндогенных веществ (биобио-тиков) [5]. Функциональная активность Р^ может значительно варьировать в зависимости от генетических особенностей, приема некоторых лекарственных веществ, а также гормонального фона [2]. При этом повышенная активность Р^ может привести к неэффективности фармакотерапии в связи со снижением абсорбции лекарственного средства в желудочно-кишечном тракте и интенсификацией его экскреции почками или печенью. С другой стороны, угнетение его функционирования может служить причиной относительной передозировки веществом-субстратом Р^ [2].
Поэтому для прогнозирования развития нежелательных межлекарственных взаимодействий опосредованных Р^ целесообразно исследование влияния новых и уже широко используемых лекарственных препаратов на активность данного белка-транспортера, а также изучение его
функционирования при экспериментальных патологических состояниях.
Поскольку введение лекарственных препаратов и проведение хирургических вмешательств, которые часто используются для моделирования экспериментальных патологических состояний, могут самостоятельно оказать влияние на функционирование Р^, для объективизации проводимых исследований актуально исследование влияния данных экспериментальных манипуляций на его активность.
Цель исследования - изучить функциональную активность Р^ при экспериментальных манипуляциях, используемых в качестве контроля - проведении «ложной» операции и введении дистиллированной воды.
Материалы и методы
Работа выполнена на 13 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла, массой 3500-4300 г. Все животные были разделены на 2 группы: 1-я группа - исследование функциональной активности Pgp на 7-й и 14-й дни после проведения «ложной» операции (п=5); 2-я группа - изучение функциональной активности Pgp после курсового 14 дневного введения дистиллированной воды в дозе 5 мл/кролик (п=8).
Функциональную активность Pgp оценивали по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина. Для этого кроликам внутрижелудочно вводили фексофенадин в дозе 67,5 мг/кг массы [1] с последующим анализом его фармакокине-тики. Пробы крови отбирали в объеме 5 мл из краевой вены уха кролика в гепарини-зированные пробирки через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 часа после введения препарата, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, полученную плазму хранили при -29°С до анализа. Содержание фексофена-дина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Стайер» (Россия) с ультрафиолетовым детектором и обра-щено-фазовой колонке «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование осуществляли по методу Раменской Г.В. с соавт. в собственной модификации [4]. Анализ выполняли при длине волны 220 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Фармако-кинетические параметры рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0.
«Ложную операцию» проводили после наркотизации животных с помощью внутримышечного введения препарата рометар (ксилазина гидрохлорид) в дозе 4,0-6,0 мг/кг массы с последующим (через 20 минут) внутримышечным введением препарата золетил-50 в дозе 5-10 мг/кг массы [3]. Для премедикации использовали подкожное введение 0,1% раствора атропина в дозе 0,01 мл/кг.
Животным сбривали шерсть в области шеи и передней брюшной стенки, вскрывали кожу, подкожно-жировую клетчатку, мышечный слой, выделяли щитовидную железу и яичники. После чего операционные поля послойно ушивали.
Для выведения из состояния наркоза животным однократно внутримышечно вводили 10% раствор сульфокамфокаина в дозе 0,1 мл/кг массы. В течение 5 суток после операции проводили обезболивание внутримышечным введением 50 % раствора метамизола натрия (анальгин) в суточной дозе 500 мг/кролик/сутки. Для профилактики инфекционных осложне-
ний животным внутримышечно вводили ампициллин в дозе 30 мг/кг массы через день в течение 6 дней.
Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математико-статистической обработке с использованием офисного пакета «Microsoft Office XP» и программы Statistica 8.0. Характер распределения данных оценивали по критерию Ша-пиро-Уилка. Наличие достоверных различий в 1 группе животных определяли по критерию Ньюмена-Кейлса после проведения дисперсионного анализа повторных измерений (тест ANOVA - для показателей, имеющих нормальное распределение, критерий Фридмана - для показателей, распределение которых отличалось от нормального), во 2 группе - с помощью критерия Стьюдента повторных измерений (при нормальном распределении данных) или критерия Вилкок-сона (при распределении данных отличном от нормального). Для данных, имеющих нормальное распределение, рассчитывали среднее арифметическое значение (Mean) и стандартное отклонение (SD). Для данных, имеющих распределение отличное от нормального, рассчитывали медиану (Median), верхний и нижний квартили (lq; uq).
Результаты и их обсуждение
В проведенном исследовании изучено влияние экспериментальных манипуляций - проведения «ложной» операции и курсового введения дистиллированной воды, которые широко используются в качестве контроля, на функциональную активность Pgp.
Сравнение фармакокинетики фек-софенадина - маркерного субстрата Pgp до «ложной» операции, а также на 7-й и 14-й сутки послеоперационного периода показало отсутствие статистически значимых различий между изучаемыми группами, что служит доказательством сохранения функциональной активности белка-транспортера на исходном уровне (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования хирургических вмешательств для моделирования экспериментальных патологических состояний при изучении особенностей функционирования Pgp.
Таблица 1
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина после «ложной операции»
Изучаемые параметры Исходные значения n=5 Значения на 7-й день после «ложной операции» n=5 Значения на 14-й день после «ложной операции» n=5
Cmax, НГ/МЛ 172,0 (95,7; 356,9) 139,3 (138,1; 173,4) 253,0 (164,7; 256,2)
Тmax, ч 3,0 (2,0; 3,0) 3,0 (2,0; 5,0) 3,0 (3,0; 5,0)
T/, ч 3,8±2,3 5,9±4,8 16,7±15,2
AUC0-t , (нг/мл)хч 746,4 (360,7; 1302,4) 1141,4 (627,7; 1224,9) 1750,7 (1634,6; 1793,3)
AUG)-« , (нг/мл)хч 939,1 (543,4; 1341,1) 1201,2 (665,9; 1530,5) 2817,7 (1676,5; 3190,9)
Cl, л/ч 396,7±408,9 294,8±211,4 102,4±61,6
Cmax/AUCo-t, 1/4 0,21±0,11 0,20±0,10 0,08±0,05
MRT, ч 7,3±2,2 10,4±5,8 25,3±21,1
14-дневное внутрижелудочное введение кроликам дистиллированной воды не приводило к статистически достоверному изменению значений основных параметров фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата Pgp, что свидетельствует об отсутствии влияния
Обращает на себя внимание выраженный разброс персональных значений фармакокинетических параметров фексо-фенадина в обеих группах эксперимента, что свидетельствует об индивидуальных особенностях функционирования Pgp. Однако данный факт не уменьшает значимости полученных результатов в связи с применением для анализа статистических критериев для связанных выборок.
Выводы
1. «Ложная» операция не приводит к изменению функциональной активности Pgp, определяемой по фармакокине-
примененной манипуляции на функциональную активность данного белка-транспортера (табл. 2). Установленные данные позволяют использовать курсовое введение животным лекарственных средств для оценки их влияния на функциональную активность Pgp.
тике его маркерного субстрата - фексофенадина.
2. 14-дневное внутрижелудочное введение кроликам дистиллированной воды не вызывает изменения функционирования Pgp.
Литература 1. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: дис. канд. мед. наук / С.В. Колхир; ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. -М., 2007. - 21 с.
Таблица 2
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина после 14-дневного введения дистиллированной воды
Изучаемые параметры Исходные значения, n=8 Значения после 14 дней введения дистиллированной воды n=8
Cmax, НГ/мЛ 325,6±190,2 368,5±299,7
Тmax, ч 4,0 (3,0; 5,0) 2,5 (1,5; 3,5)
T/, ч 12,4±13,3 4,6±3,8
AUCo-t , (нг/мл)хч 2545,6±1110,99 1644,6±1590,9
AUC0-« , (нг/мл)хч 3725,3±2177,5 1899,6±1954,4
Cl, л/ч 85,6±52,6 263,1±196,0
Cmax/AUCo-t, 1/ч 0,11±0,06 0,25±0,13
MRT, ч 19,7±18,3 8,9±4,3
2. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализованной медицины: руководство для врачей / В.Г. Кукес [и др.]. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 304 с.
3. Разина А.В. Оптимизация метода общей анестезии на кроликах / А.В. Разина, А.И. Фролова, М.А. Сергеев // Акт. вопр. ветеринарии и биол. - 2010. - №1. - C. 32-35.
4. Якушева Е.Н. Влияние финастерида на функциональную активность гли-копротеина-Р в эксперименте / Е.Н. Якушева, И.В. Черных // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. -2012. - №4. - С. 46-50.
5. The structure and functions of P-glycoprotein / Y. Li [et al.] // Curr. Med. Chem. - 2010. - Vol. 17, №8. -P. 786-800.
Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-97522 р_центр_а
FUNCTIONAL ACTIVITY OF P-GLYCOPROTEIN DURING EXPERIMENTAL MANIPULATIONS
E.N. Yakusheva, A. V. Shulkin, I. V. Chernykh, D.S. Titov
In a study on rabbits the effect of experimental manipulations (false surgery and distilled water administration) on functional P-glycoprotein activity was studied. P-glycoprotein activity was assessed by pharmacokinetic analysis of its marker substrate - fexofenadine. Found that manipulations applied do not lead to modulation of Pgp activity at all stages of the research period.
Keywords: P-glycoprotein, false surgery, fexofenadine.
Якушева Е.Н.- д-р. мед. наук, доц., зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. E-mail: e.yakusheva@rzgmu.ru
Щулькин А.В. к.м.н., асс. каф кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. E-mail: alekseyshulkin@rambler.ru
Черных И.В. асс. кафедры общей химии с курсом биоорганической и органической химии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. E-mail: Ivchernykh88@mail.ru
Титов Д.С. очный аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. E-mail: I3762@yandex.ru
