CC BY
22
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • N02 • 2012
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 611.018.54:612.11.111
Т. А. Богомаз, Л. Б. Пиотровский, М. А. Думпис, И. Г. Щербак, Л. В. Галебская
ФУЛЛЕРЕНОЛ В СИСТЕМЕ «СЫВОРОТКА КРОВИ - ЭРИТРОЦИТ»
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Бакминстер-фуллерен (С60) представляет собой сферическую молекулу-наночастицу, на основе которой синтезировано уже множество соединений. Особенно перспективными для применения в медицине и биологии являются водорастворимые производные С60. К таким веществам относятся фуллеренолы, представляющие собой продукты полигидроксилирования фуллеренов - С60(ОН)х. Растворимость фуллеренола С60(ОН)24 в воде достигает 44 мг/мл, ее можно повысить с помощью детергента, например, ди-метилсульфоксида [7]. При внутривенном введении С60(ОН)24 разносится с кровью во все органы, кроме мозга. В литературе описаны разнообразные эффекты этого препарата, а именно: антиоксидантное, цитопротекторное действие, противораковая и антимикробная активность, им-муномодулирующий эффект [4, 7].
Перспективность использования фуллеренолов в качестве медицинских препаратов требует исследования их взаимодействия с компонентами крови. Система комплемента представляет собой совокупность белков плазмы крови и биологических жидкостей, осуществляющих иммунный лизис чужеродных и собственных трансформированных клеток [1, 2]. Ранее нами было выявлено инги-бирующее действие фуллеренола на гемолитическую активность комплемента человека [5]. Целью настоящей работы является выяснение вопроса о точке приложения действия фулеренола. Торможение фулеренолом комп-лементзависимого гемолиза возможно как при его взаимодействии с компонентами комплемента, так и в результате его цитопротекторного действия. Для решения этого вопроса мы исследовали зависимость ингибирующего действия фуллеренола от концентрации клеток-мишеней для действия комплемента.
С60(ОН)24-26 (средняя молекулярная масса -1145 Ба) в ве-роналовом буфере (рН 7,2).
Источником активности комплемента являлась сыворотка крови практически здоровых доноров. В качестве инициаторов и мишеней для действия комплемента использовали эритроциты кролика. Эритроциты кролика инициируют активацию комплемента одновременно по классическому (КПК) и альтернативному (АПК) путям. Как нами было установлено ранее, фуллеренол ингиби-ровал как АПК, так и КПК [5]. В настоящей работе было исследовано воздействие фуллеренола на активацию комплемента по АПК. Эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и помещали в изотонический вероналовый буфер (рН 7,2). Стандартная взвесь содержала 18 млн клеток на 1 мл буфера. В термостатированной (37 о С) кювете спектрофотометра готовили инкубационную смесь, содержащую 0,1 мл сыворотки крови, 0,4 мл 10 мМ ЭГТАД88 мМ раствор фуллеренола (0,02-0,1 мл) и вероналовый буфер до объема 0,7 мл. После прогревания в течение 3 минут в инкубационную смесь добавляли 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов кролика. Показатели активности комплемента определяли кинетическим способом, регистрируя лизис клеток по убыли оптической плотности при 800 нм [2]. Оценку влияния фуллеренола на комплемент производили, используя величину лаг4, т. е. время (в секундах) от внесения эритроцитов до начала гемолиза, который проявляется в снижении эк-стинкции.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Средние относительные величины лаг-периода комп-лементзависимого лизиса эритроцитов кролика по АПК при разных количествах клеток-мишеней приведены в таблице.
Полученные результаты показывают, что С60(ОН)24-26 существенно и зависимо от концентрации удлиняет лаг-период гемолиза. Это свидетельствует об угнетении системы комплемента по АПК. В течение лаг-периода происходят следующие события: сорбция антител на чужеродных эритроцитах, гидролиз внутренней тиоэфирной связи в компоненте С3, протеолитический каскад АПК, сборка и внедрение в эритроцитарную мембрану комплекса мембранной атаки. Только после этих событий наблюдается собственно лизис клетки. И данных, приведенных в таблице
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Полигидроксилирование фуллерена С60 проводили по методике [6]. Полученный препарат содержал 24-26 гид-роксильных групп - С60(ОН)24-26. Эксперименты проводили in vitro, используя раствор полученного препарата
Средние относительные величины лаг-1 (% к контролю) комплементзависимого гемолиза по АП (альтернативному пути активации комплемента) в присутствии разных концентраций фуллеренола и при различных концентрациях эритроцитов (п=3)
Количество эритроцитов (мл) Контроль М±ш (с) Средняя относительная величина (М±ш) лаг-t при различных концентрациях фуллеренола (мкМ)
22 44 66
0,02 102±14 135±33 363±135 457±21
0,04 98±11 129±31 326±92 475±156
0,06 95±15 159±49 338±77 794±498
0,08 113±23 111±17 362±205 583±376
0,10 117±29 136±12 517±95 541±23
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
видно, что абсолютные величины лагЧ по АПК не зависят от концентрации эритроцитов. Ингибирующее действие фуллеренола также не изменялось при повышении количества эритроцитов в инкубационной смеси. Из получен-
ных результатов можно сделать вывод о том, что фуллере-нол в системе «сыворотка крови - эритроцит» проявляет свое защитное действие от активированного комплемента не на мембране эритроцитов, а в жидкой фазе.
© Коллектив авторов, 2012 г.
УДК 612.014:577.7
И. Л. Соловцова, Е. А. Воробьев, И. А. Курпас, М. А. Соловьева
УЧАСТИЕ НЕКОТОРЫХ АПОП-ТОТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В РАДАХЛОРИН-ИНИЦИИРО-ВАННОМ ФОТОГЕМОЛИЗЕ
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени
академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Фотодинамическое воздействие на эритроцит исходно связывают с генерацией синглетного кислорода, который в силу высокой химической активности участвует в цепных свободно-радикальных реакциях, окисляя аминокислоты в белках, вызывая перекисное окисление липи-дов и т. д. Установлено, что мембранные эффекты при фотодинамическом воздействии более выражены, чем цитозольные.
Несмотря на отсутствие у эритроцитов ядра и митохондрий, существует мнение, что при окислительном стрессе гибель клеток происходит с участием механизмов типичных для апоптоза, а именно - происходит сжатие клеток, «вспучивание» мембраны, нарушение фос-фатидилсериновой ассиметрии мембран. Апоптотичес-кое уменьшение обьема эритроцитов является следствием повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, последующей активацией Са2+- зависимых калиевых каналов, приводящей к выходу из клеток катионов калия и анионов хлора совместно с водой.
Целью данной работы являлось оценить роль апопто-тических механизмов в фотоиндуцированном гемолизе.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовалась плазма крови здоровых доноров в возрасте 18-25 лет. Забор крови производился из локтевой вены в изотонический раствор цитрата натрия. Цитратную кровь центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об./мин, плазму отделяли декантацией.
Осажденные эритроциты выдерживали в реактиве Олс-вера при 4 оС в течение суток с целью их стабилизации.
Перед экспериментом эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором, готовили стандартную
взвесь, оптическая плотность (при 800 нм) которой после разведения в 8 раз равнялась 0,560±0,020. Эта величина находится в диапазоне линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов и соответствует 12,0±0,4 млн клеток/мл.
В работе использовался фотосенсибилизатор радах-лорин (РХ) производства фирмы ООО «РАДА-ФАРМА».
Регистрацию фотолизиса сенсибилизированных РХ эритроцитов проводили следующим образом. Стандартную взвесь эритроцитов, объемом 0,1 мл, доводили до объема 0,8 мл буферным раствором, содержащим РХ. Инкубационную смесь подвергали негемолизирующему облучению красным светодиодом с длиной волны 658 нм (мощность на выходе -12 мВт). Динамику лизиса эритроцитов регистрировали с помощью спектрофотометра при 800 нм с автоматической пятисекундной регистрацией светорассеяния в прямом потоке. Показателем скорости гемолиза являлась величина 1/Т50, где Т50 - время, необходимое для лизиса половины эритроцитов в инкубационной смеси. Для изучения влияния на фотогемолиз различных факторов в стандартную взвесь эритроцитов добавляли следующие препараты: избирательный хе-латор ионов кальция ЭГТА (Sigma) (10 мМ), 10 %-й раствор CaCl2, малоспецифический блокатор Ca2+- каналов L-типа Дилтиазем («Ланнахер», Австрия) в сублитической концентрации 0,625 мг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Этап облучения взвеси эритроцитов в присутствии РХ, предшествующий гемолизу, как было подтверждено микроскопическими исследованиями, всегда приводил к изменению морфоформы клеток и превращению их в эхиноциты. Время, необходимое для этих изменений, зависило от дозы облучения и было индивидуально для эритроцитов разных доноров. Далее происходила агломерация клеток, вследствие чего оптическая плотность инкубационной смеси повышалась на0,05-0,08 единицы.
Подобные превращения эритроцитов, по литературным данным, происходят под действием кальциевых ионо-форов, при помещении клеток в гипертоническую среду, после двухсуточного глюкозного голодания. Однако во всех перечисленных случаях это требовало гораздо большего времени, чем под воздействием светового луча в присутствии фотосенсибилизатора. Очевидно, сказывалась огромная реакционная способность образующихся активных форм кислорода и высокая скорость свобод-норадикальных процессов. Особенно чувствительна к по-
