CC BY
86
УДК 537.311.33
С. С. Остахов (к.х.н., с.н.с. )1, В. В. Плечев (д .мед.н., проф., зав. каф.)2, В. М. Юнусов (к.мед.н., доц., хирург)3, Р. И. Ижбульдин (д.мед.н., проф., зав. отд.)3, М. В. Султанбаев (асп.)1, А. Н. Кислицын (врач-хирург)3, Г.Х.Куппеева (врач-лаборант)3
Фотолюминесценция как метод изучения взаимодействия гепарина с деэндотелизированной поверхностью артерии
1 Институт органической химии УНЦ РАН, лаборатория химической физики 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; e-mail: ostahov@anrb.ru 2Башкирский государственный медицинский университет, кафедра госпитальной хирургии, г. Уфа, ул. Ленина ,3; тел. (347) 2553966 3Республиканский кардиологический диспансер, отделение сосудистой хирургии 450106, г.Уфа. ул. Ст. Кувыкина, 96; тел 8(347) 2553957, факс 8(347)2556471, e-mail: rkd@ufacom.ru
S. S. Ostakhov 1, V. V. Plechev 2, V. M. Yunusov 3, R. I. Izhbuldin 3, M. V. Sultanbaev 1, A. N. Kislitsyn 3, G. Kh. Kuppeeva 3
Photoluminescence as a method of studying of interaction heparine
with deendotelizated artery surface
1 Institute of Organic Chemistry of the USC of the RAS 71, Oktyabrya pr., 450054, Ufa, Russia; e-mail: ostahov@anrb.ru
2 Bashkir State Medical University
3, Lenina st., Ufa, Russia; ph. (347) 2553966
3 Republican Cardiological Clinic
96, St. Kuvykina st., 450106, Ufa, Russia; ph. 8(347)2553957, fax 8(347)2556471, e-mail: rkd@ufacom.ru
Спектрально-люминесцентным методом исследована сорбция препарата гепарин (Hep) тканью аорты. Изучено тушение флюоресценции (ФЛ) триптофана (Trp) гепарином и определена константа Штерна-Фольмера (К = 19 ± 2 М-1), отражающая устойчивость его комплексов с аминокислотой. Установлены основные закономерности сорбции гепарина тканью аорты с эндотелием и без эндотелия в стационарном режиме и при интенсивном перемешивании раствора Hep, имитирующим циркуляцию крови. Изучены антикоагулянтные свойства комплекса гепарин-ароматические аминокислоты. Подтверждена его высокая антикоагулянтная активность.
Ключевые слова: антикоагулянтные свойства; гепарин; сорбция; триптофан; тушение; флюоресценция.
By the spectral-luminescence method investigated the sorption of the drug heparin (Hep) aortic tissue. The quenching of fluorescence (FL) tryptophan (Trp) by heparin is studied and the Stern-Volmer constant (K=19±2 M-1), reflecting the stability of its complexes with amino acid is determined. The main regularities of the sorption of heparin with the endothelium of aortic tissue and without endothelium in a stationary mode, and with vigorous stirring of the solution Hep, simulating blood circulation are establieshed. The anticoagulant properties of the complex heparin— aromatic amino acids are studied. Its high anticoagulant activity is confirmed.
Key words: heparin; tryptophan; fluorescence; adsorption; quenching; anticoagulant properties.
Вопрос профилактики тромботических осложнений в коронарной хирургии остается и в настоящее время актуальным. Процедура эн-дартерэктомии из венечных артерий сопряжена с высоким риском тромбоза зоны реконст-
Дата поступления 05.09.12
рукции в раннем послеоперационном периоде, что сопровождается высоким риском инфаркта миокарда и летального исхода.
Гепарин (Hep) 1 — природный гексозами-ногликан (рис. 1), является антикоагулянтом прямого действия. Он широко применяется в клинической практике для профилактики и те-
рапии тромбоэмболических заболеваний, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения, а также для предотвращения свертывания крови при лабораторных исследованиях 2.
ФЛ белков являются входящие в их состав ароматические аминокислоты (рис.2) — триптофан (Тгр), тирозин (Туг) и фенилаланин (РЬе) 3. Однако то обстоятельство, что квантовый выход люминесценции Тгр намного выше такового для Туг и РЬе, обычно приводит к преобладанию полосы излучения триптофана (рис. 3, спектр 1) в суммарном спектре ФЛ клетки. Действительно, как можно видеть из рис. 3, спектр ФЛ ткани аорты (спектр 2) удовлетворительно коррелирует со спектром люминесценции триптофана.
Рис. 1. Формула гепарина
В настоящей работе рассмотрены возможности метода тушения собственной флюоресценции (ФЛ) белка при исследовании процессов сорбции гепарина тканью аорты, а также изучены антикоагулянтные свойства гепарина в комплексах с ароматическими аминокислотами — триптофаном (Trp), тирозином (Туг) и фенилаланином (Phe)).
Материалы и методы исследования
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре «Specord M-40», скорректированные спектры ФЛ — на спектрофлюори-метре «СМ-2203». Флюоресценцию образцов ткани аорты регистрировали по углом 45o, кинетические измерения проводили в максимуме ФЛ триптофана (Trp) (340 нм), перемешивание растворов осуществляли с помощью магнитной мешалки. Триптофан (99.5 %) фирмы «Aldrich», гепарин натрия (состав: активное вещество: гепарин — 5000 МЕ;. вспомогательные вещества: спирт бензиловый, натрия хлорид, вода для инъекций — до 1 мл (ОАО-Синтез, Россия), использовали без предварительной очистки.
Изучение антикоагулянтной активности модифицированного гепарина проводили на автоматическом коагулометре «Act plus» Medtronic (США) путем определения АВС (активированного времени свертывания). Исследование проводили на картриджах HR-ACT с реагентом: 12% каолин, 0.005 М CaCl2, Hepes-буфер, Sodium azide.
Обсуждение результатов
При изучении взаимодействия субстрата с белками большую популярность приобрели методы тушения их собственной люминесценции 3'4. Ответственными за ультрафиолетовую
Рис. 2. Структурные формулы Trp, Tyr и Phe.
Рис. 3. Спектры ФЛ: 1 — Trp, 2 — ткань аорты (Лвозб. = 225 нм, физ. раствор, 300 К)
Общеизвестно, что квантовый выход ФЛ Trp зависит от свойств окружения хромофора 3, и спектрально-люминесцентные исследования могут служить основой для разработки методов слежения за взаимодействием белковых молекул ткани с различными субстратами.
С целью определения возможности применения метода собственной люминесценции белка в исследовании сорбции гепарина сосудистой тканью было изучено влияние антикоагулянта Hep на ФЛ триптофана. Фотовозбуждение Trp проводили на длине волны света (А возб.) 290 нм, где Hep оптически прозрачен (рис. 4).
£20 £40 £60 £30 300 320
Х,НМ
Рис. 4. Спектр поглощения: 1 — Trp, 2 — Hep (физраствор, 300 К).
Добавление гепарина приводит к тушению ФЛ Trp (рис. 5, спектры 1), что позволяет использовать метод собственной люминесценции белка в исследовании процессов сорбции антикоагулянта сосудистой тканью.
Аотн.ед. [Htp] х КГ М lJl-\
0 2 4 6 S 10
350 400 450
X, нм
Рис. 5. Спектры ФЛ Trp от концентрации Hep (стрелкой указан рост концентрации Hep) — (1). Зависимость интенсивности ФЛ Trp от концентрации Hep в координатах уравнения Штерна-Фольме-ра — (2). ([Trp] = 10-5 М, Я возб. = 290 нм, физраствор, 300 K).
Тушение ФЛ Trp гепарином описывается уравнением Штерна-Фольмера 5:
Io/I - 1 = К [Hep] (1)
где К — константа тушения Штерна-Фольмера;
I0, I — интенсивности ФЛ Trp в отсутствие и присутствии тушителя-гепарина;
[Hep] — концентрация тушителя, рассчитанная для дисахаридного звена гепарина.
Константа Штерна-Фольмера, определенная из зависимости интенсивности ФЛ Trp от концентрации Hep (рис. 4, зависимость 2), равна K = 19 ± 2 М-1 и при статическом механизме тушения отражает устойчивость комплекса Trp Hep 6.
Гепарин вследствие наличия отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп (рис. 1), представляет собой сильный природный полианион и склонен к образованию комплексов со многими белковыми соединениями поликатионной природы. Можно предположить, что тушение ФЛ диполярного цвиттер-иона Trp гепарином осуществляется не только по динамическому, но и по статическому механизму в результате образования не-люминесцирующего комплекса [Trp Hep]. Ранее тушение ФЛ Trp, протекающее по статическому механизму обратимого фотоиндуци-рованного переноса электрона, мы наблюдали в комплексах триптофана с Eu(III) 7 и уранил-ионом 8, что позволило оценить их константы устойчивости. Таким образом, при рассмотрении процессов сорбции гепарина сосудистой тканью нельзя не учитывать возможность наличия его необратимой хемосорбции белками.
Предлагаемый флюоресцентный метод изучения сорбции Hep в биологической ткани основан на том факте, что молекулы тушителя, дезактивирующие возбужденные состояния Trp, по мере диффузии во внутренние части ткани будут приводить к уменьшению интенсивности ее собственной люминесценции. Практически безинерционность метода позволяет производить кинетическую регистрацию этих изменений.
Измерения проводили на образцах ткани аорты с эндотелием и без эндотелия, как в статических условиях, так и при интенсивном перемешивании, имитирующем циркуляцию крови. Образец помещали в раствор препарата Hep в кварцевой кювете и наблюдали собственную ФЛ ткани аорты под углом 45o. Изменения интенсивности ФЛ ткани аорты от времени, обусловленные сорбцией Hep, записывали в максимуме излучения ФЛ Trp (А.изл.) при 340 нм.
На рис. 6 приведена кинетическая зависимость интенсивности ФЛ образца, отражающая процесс сорбции гепарина тканью аорты с эндотелием при интенсивном перемешивании (зависимость 1) и в статических условиях (зависимость 2).
t, мин.
Рис. 6. Зависимость интенсивности ФЛ ткани аорты с эндотелием от времени в растворе Hep:
1 — с перемешиванием; 2 — без перемешивания (А возб. = 225 нм, Л.изл. = 340 нм, 300К).
t, мин.
Рис. 7. Зависимость интенсивности ФЛ ткани аорты от времени в растворе Hep: 1 — сосуд без эндотелия; 2 — сосуд с эндотелием (Хвозб. = 225 нм, Х.изл.= 340 нм, без перемешивания, 300 К).
В статических условиях сорбция Hep сосудом протекает более эффективно, приводя к снижению его собственной ФЛ приблизительно на 90% в течение 200 мин, в то время как при перемешивании за тот же промежуток времени наблюдается 60% падение интенсивности люминесценции. Вероятно, эти различия обусловлены тем, что при перемешивании сорбированный на поверхности сосуда Hep вымывается в раствор. Представляло интерес исследование влияния эндотелия сосуда на сорбцию им препарата гепарина. На рис. 7 приведены зависимости интенсивности ФЛ ткани аорты без эндотелия (зависимость 1) и с эндотелием (зависимость 2) от времени в растворе Hep без
перемешивания. Как и следовало ожидать, на начальном этапе (~ 40 мин) более эффективно идет сорбция Hep сосудом без эндотелия, вследствие отсутствия препятствия им диффузии гепарина в образец. При более длительном контакте фаз кинетика сорбции гепарина сосудом, вне зависимости от наличия эндотелия, становится практически идентичной.
На рис. 8 приведены спектры ФЛ ткани аорты в физрастворе и Hep в различные моменты времени. Из сравнения спектров 1 и 2 перевод образца из физ. раствора (спектр 1) в раствор Hep приводит к резкому тушению ФЛ ткани аорты (спектр 2), что отражает быстрый процесс адсорбции препарата на поверхности ткани аорты.
Таким образом, полученные результаты однозначно свидетельствуют о наличии сорбции гепарина тканью артериальной стенки. Несмотря на то, что данные, полученные на различных образцах ткани, индивидуальны, основные тенденции сорбции гепарина тканью аорты с учетом статистического разброса сохраняются и демонстрируют перспективность метода собственной фотолюминесценции белка при изучении взаимодействия с субстратом на границе раздела белок—растворитель.
I. ИТН.СД,
300 350 400 450 500 нм
Рис. 8. Спектры ФЛ: 1 — сосуд в физ р-ре до сорбции, 2 — сосуд в гепарине в конце, 3 — сосуд в физ р-ре в начале десорбции 4 — сосуд в физ р-ре в конце десорбции. (Лгх = 228 нм) (с перемешиванием).
Взаимодействие гепарина с аминокислотами белков деэндотелизированной поверхности артериальной стенки диктует необходимость изучения его биологической активности. С этой целью мы получили комплексы гепарина с тремя вышеуказанными ароматическими аминокислотами (так называемый «модифицированный» гепарин). Подбор концентраций
Значения АВС в исследуемых образцах гепарина
Таблица 1
Показатели АВС (АСТ), с Серия 1 (n 2) АВС (АСТ), с Серия 2 (n 2) АВС (АСТ), с Серия 3 (n 2)
Нативная кровь (контроль) 150 173 159
Кровь со стандартным гепарином (контроль) 927 999 816
Кровь+гепарин-триптофан 953 963 999
Кровь+гепарин-фенилаланин 734 809 833
Кровь+гепарин-тирозин 824 769 816
проводили методом фотолюминесцентного титрования. К растворам вышеуказанных аминокислот (10-5 М) добавляли гепарин до полного исчезновения фотолюминесценции аминокислот. Отсутствие ФЛ означало, что все аминокислоты связаны в нелюминесцирующий комплекс с гепарином. Таким образом было приготовлено по 5 мл каждой разновидности гепарина с концентрацией его в физиологическом растворе равной 50 мг/мл, что полностью соответствует концентрации гепарина, изготовленного в условиях фармацевтического производства. Также изучению подвергся, так называемый, «тест-гепарин» — матрица гепарина, подготовленная для связи с аминокислотами путем различных физических воздействий.
Экспериментальное изучение антикоагу-лянтных свойств «модифицированного» гепарина проводили в лабораторных условиях. Объектом изучения являлась нативная (неге-паринизированная) кровь пациентов, к которой добавляли исследуемые образцы гепарина. Одна серия опытов проводилась с одним и тем же образцом крови. Для презентативности опыта и исключения возможной инактивации гепарина на этапах его модификации, мы провели изучение антикоагулянтных свойств исследуемых образцов по следующей схеме:
1. Изучение АВС контрольной нативной крови.
2. Изучение АВС крови с добавлением расчетной дозы стандартного (заводского) гепарина.
3. Изучение АВС крови с добавлением расчетной дозы «тест-гепарина» (матрицы).
4. Изучение АВС крови с добавлением расчетной дозы «модифицированного» гепарина.
Во всех образцах регистрировалось АВС дольше 600 с, что свидетельствовало о высокой антикоагулянтной активности комплекса гепарин-аминокислота. Результаты исследований представлены в табл. 1. Эта серия опытов подтверждает тот факт, что гепарин, сорбиру-
ясь на деэндотелизированной поверхности артериальной стенки не теряет своей антикоа-гулянтной активности и оказывает выраженный местный атромбогенный эффект.
Таким образом, метод собственной фотолюминесценции белка при изучении взаимодействия с субстратом на границе раздела белок—растворитель перспективен.
Одним из многих возможных механизмов взаимосвязи гепарина со структурами сосудистой стенки является его донорно-акцепторное взаимодействие с аминокислотами белков де-эндотелизированной поверхности артерии.
Гепарин, связанный с белковыми структурами артериальной стенки, не теряет своей ан-тикоагулянтной активности, чем обеспечивает эффективную местную профилактику ранних тромбозов зоны артериальной реконструкции.
Литература
1. Алиев A. M., Алекперов А. Ф. // Фармация. №6.- С.47.
2. Демченко А. П. Люминесценция и динамика структуры белков.- Киев: Наук. Думка, 1988. 189 с.
3. Казаков В. П., Остахов С. С., Осина И. О., Алябьев А. С., Гайнетдинова С. Г., Ахмадеева Г. Х. // Радиохимия. 2006.- T.48.- С.399.
4. Казаков В. П., Остахов С. С., Фаррахова Г. Г. // Химия высоких энергий.- 2008.- Т.42.-С. 325.
5. Кобяков В. В., Овсепян А. М., Фролова Н. А., Панов В. П. // Химико-фармацевтический журнал. 1978.- Т.12, №7.- С. 130.
6. Крылов В. Б., Устюжанина Н. Е.,Нифанть-ев Н. Э. // Биоорганическая химия.- 2011.-Т.17.- С.745.
7. Лакович Дж. Основы флюоресцентной спектроскопии: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 496 с. (Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy; New York: Plenum Press, 1983).
8. Малер Г., Кордес Ю.Основы биологической химии: Пер. с англ.- М.: Мир, 1970.- 270 с. (Mahler H. R. and Cordes E. H. Basic Biological Chemistry; New York: Harper & Row., Inc., 1968)
