CC BY
17
УДК 617.741 - 004.1 - 092.4/. 9
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА КУЛЬТУРУ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ХРУСТАЛИКА КРОЛИКА
Ю.А. Белый, A.B. Терещенко, М.В. Федотова, П.Л. Володин, М.А. Плахотний, * H.A. Онищенко, * М.Е. Крашенинников, * М.К. Хохлова
Калужский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росздрава»
*НИИ Трансплантологии и Искусственных Органов, Москва
Помутнение задней капсулы (фиброз, вторичная катаракта) является одной из актуальных проблем в офтальмохирургии. Несмотря на внедрение современных энергетических методов хирургии катаракты, частота ее развития составляет от 10 до 50% у взрослых [2,7] и до 93,2% у больных детского возраста [1].
Развитие вторичной катаракты обусловлено послеоперационной пролиферацией и распространением по поверхности задней капсулы сохранившегося субкапсулярного эпителия, клеток крови, пигмента и клеточного инфильтрата [4,5,11].
Одним из перспективных методов профилактики вторичной катаракты является интраоперационное применение фармакологических средств для очистки капсульного мешка [3,9,10,12]. Однако фармацевтические методы профилактики помутнения задней капсулы не нашли должного применения в клинике из-за недостаточной эффективности, невозможности применения точной дозировки, токсичности и других побочных отрицательных эффектов. В отдельных публикациях отмечается перспективность применения фотодинамической терапии для профилактики вторичной катаракты в эксперименте [6,8,10]. Однако эта проблема до настоящего времени остается недостаточно изученной.
Целью нашей работы явилось исследование влияния фото динамического воздействия на культуру эпителиальных клеток хрусталика в эксперименте.
Материалы и методы. Эпителиальные клетки хрусталика получали следующим образом: капсулу хрусталика и кортикальные массы механически выделяли из энуклеированных глаз кроликов породы Шиншиллы и измельчали до мелких кусочков размером 1мм3 с последующей обработкой трипсином. Затем культуру клеток отмывали и выращивали в чашках при температуре 37°С, 5% С02, 95% влажности в С02 инкубаторе в течение 6 недель. В качестве ростовой среды использовали DMEM/Ham's F-12 (Sigma, USA), содержащий 20% фе-тальной сыворотки коров (HyClone, USA), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (Sigma, USA), 0,4 мкМ инсулина и 50 мкг/мл гентамицина. Среду заменяли каждые 4 дня. При достижении 75% монослоя (6-я неделя культивирования) клетки тканевой культуры из расчета 1:3 были пересеяны на свежую культу-
ральнуго поверхность. Морфология клеток соответствовала эпителиальному типу (черепаховый ланцырь) с видимым присутствием фибробластоподобрых клеток.
Для проведения эксперимента клетки были рассеяны в лунки 96-луночного культурального планшета в шахматном порядке через 1 лунку в концентрациях 7x10 и 14x103 клеток/лунку в 100 мкл культуральной среды. Через 2 суток среду отмыли физраствором, и в лунки внесли по 100 мкл раствора фотосенсибилизатора "Фотолон" (РУПП "Белмедпрепараты", г. Минск, Беларусь) в концентрациях 0,01, 0,05, 0,1 мг/мл, инкубировали в темноте в течение 10 минут при температуре 37°С, 5%С02, 95% влажности в С02 инкубаторе (опытная группа). Облучение культуры клеток проводили с помощью световода с торической линзой (0 2мм) через отверстие в черном светонепроницаемом трафарете, соответствующее диаметру лунки, лазером "Ламеда" (ООО «ЭММИ», Москва), с длиной волны 662 нм. Облучение проводили с плотностью энергии 5,10, 20, 30, 40, 50 Дж/см . Мощность выходного лазерного излучения измеряли на приборе ИМ-2 («Полупроводниковые приборы», С-Петербург). В качестве контроля использовали культуру клеток в двух исходных концентрациях - 7х103 и 14х103, которую облучали теми же параметрами лазерного излучения, но без добавления фотосенсибилизатора (контроль 1), культуру без лазерного облучения с добавлением фотосенсибилизатора (контроль 2) и интактную культуру клеток (контроль 3). Оценку цитотоксического действия различных концентраций фотосенсибилизатора и доз лазерного излучения осуществляли путем измерения митохондриального дыхания живых клеток в культуре по методу, разработанному Т. Mosmann, 1983, А. Monks, 1988. Лунки с клетками 3 раза отмывали от реагента физраствором и вносили ростовую среду, культивировали 1 неделю и выявляли живые клетки по активности митохондриального дыхания.
Результаты и обсуждение. В результате проведенного нами исследования было установлено, что оптическая плотность, характеризующая количество живых клеток в культуре, в контроле 1 и контроле 2 статистически не отличалась от количества интактных клеток в контроле 3. Во всех группах отмечалось выпадение кристаллов при обработке МТТ, свидетельствующие о наличие митохондриального дыхания. Эта закономерность сохранялась как при использовании концентрации клеток 7x103, так и при концентрации 14x103. Следовательно, изолированное воздействие различных концентраций фотосенсибилизатора и параметров лазерного излучения не вызывало цитотоксического воздействия.
В опытных группах, при сочетанном воздействии различных концентраций фотосенсибилизатора и доз лазерного излучения, отмечался фотодинамический эффект. Микроскопически все клетки в концентрациях 7x103 и 14x103 клеток/лунку оставались неизмененными, однако в течение всего периода культивирования отсутствовали митохондриальное дыхание (отсутствие выпавших кристаллов при обработке МТТ) и митотическое деление. На основании чего можно предположить, что клетки находятся в апоптозе. Отсутствие лизиса клеток снижает вероятность активного воспаления в глазу, стимулирующего пролиферацию и образование фиброза задней капсулы.
Обращает внимание тот факт, что в выбранном диапазоне концентраций фотосенсибилизатора и параметров лазерного излучения наблюдался одинаковый и максимально выраженный цитофототоксический эффект. Эти результаты позволили нам придти к заключению, что для достижения цитофототоксиче-ского эффекта, позволяющего ввести клетки в апоптотическое состояние, достаточно минимальной концентрации фотосенсибилизатора (0,01 мг/мл) и минимальной дозы лазерного излучения (5Дж/см2). Выводы
1. При культивировании тканевой культуры хрусталика в условиях in vitro образуется смешанная культура, участвующая в образовании помутнения задней капсулы, состоящая из эпителиальных и фибробластоподобных клеток.
2. На культуре клеток хрусталика отработаны минимальные параметры доз фотосенсибилизатора и плотности энергии лазерного излучения, позволяющих ввести клетки в апоптоз. Отсутствие лизиса погибших клеток снижает вероятность активного воспаления в глазу, стимулирующего пролиферацию и образование фиброза задней капсулы.
3. Проведенные исследования, показавшие эффективность фотодинамической терапии с препаратом «Фотолон» на культуре клеток хрусталика, позволяют нам перейти к изучению возможностей данного метода для профилактики помутнения задней капсулы на экспериментальных животных.
Литература
]. Зубарева Л.Н. Интраокулярная коррекция в хирургии катаракты у детей: Автореф. дис.... д.м.н. -М., 1993. - 50 с.
2. Иошин Н.Э., Егорова Э.В., Толчинская А.И. и др. Внутрикапсульное кольцо в профилактике осложненной хирургии катаракты // Вопросы офтальмологии. - Красноярск, 2001. - С. - 111.
3. Краснов М.М., Двали М.Л., Полунин Г.С. и др. // Вест, офтальмол. - 1990. -Т. 106. -№5. С.-8-12.
4. Малюгин Б.Э. Медико-технологическая система хирургической реабилитации пациентов с катарактой на основе ультразвуковой факоэмульсификации и имплантации интраокулярной линзы. Автореф. дис.... д.м.н. - М., 2002. - 48 с.
5. Многотомное руководство по глазным болезням. Т. 1, кн. 1. История офтальмологии, анатомия и физиология органа зрения, оптическая система глаза и рефракция / Ред. А.И. Богословский и др. - М., 1962. - С. 174.
6. Kang SW, Kang SJ, Kim HO, Nam ES, Lee JH, Koh HJ. Photodynamic therapy using verteporfin-induced minimal change nephrotic syndrome // Am J Ophthalmol. 2002 Dec; 134(6): 907-8.
7. Koppelhof JP, Vressen CF. The pathology of after cataract // Acta Ophthalmol. - 1992. - Suppl. - P. 13-24.
8. Melendez RF, Kumar N, Maswadi SM, Zaslow K, Glickmank RD. Photodynamic actions of indocyanine green and trypan blue on human lens epithelial cells in vitro // Am J Ophthalmol. 2005 Jul; 140(1): 132-4.
9. Nishi O. Nishi К, Mano C. Et al. The inhibition of lens epitelial cell migration by a discontinuous capsula bend created by a band-shaped circular loop or a capsula-banding ring // Ophthalmic Surg Lazerz 1998; 29; 119-125.
10. Vargas LG, Escobar-Gomez M, Apple DJ, Hoddinott DS, Schmidbauer JM. Pharmacologic prevention of posterior capsule opacification: in vitro effects of preservative-free lidocaine 1% on lens epithelial cells // J Cataract Refract Surg 2003 Aug; 29(8): 1585-92.
11. Von Salmann L. The lens epithelium in the pathogenesis of cataract; the XIII Edward Jackson Memorial lecture // Am J Ophthalmol. 1957 Aug; 44(2): 59-70.
12. Xie L, Sun J, Yao Z. Heparin drug delivery system for prevention of posterior capsular opacification in rabbit eyes // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2003 Apr;241(4):309-13.
