CC BY
75
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫМ-1 КРЫС... 47
УДК 616-006.3.04-092:615.849.19 Ю. С. Осипчук, В.В. Дрожжина ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫ М-1 КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА БОРХЛОРИН ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ЛИОФИЛИЗАТ ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздрава России, Обнинск Контактная информация Осипчук Юлия Сергеевна, научный сотрудник лаборатории экспериментальной и фотодинамической терапии адрес: 249031, Калужская обл., Обнинск, ул. Курчатова, д. 18., кв. 54; тел. (48439)9-70-29 e-mail: [email protected] Статья поступила 18.07.2013, принята к печати 01.11.2013. Резюме Исследование проведено на крысах-опухоленосителях саркомы М-1 с использованием нового фотосенсибилизатора борхлорин липосомальный лиофилизат. Целью исследования было изучение возможности эффективного использования липосомального фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии опухолей и исследование динамики накопления его в опухоли и здоровой ткани. Эффективность терапии оценивали: по коэффициенту абсолютного прироста опухоли, по торможению роста опухоли, по проценту животных с полной регрессией опухоли, по проценту животных с рецидивом опухоли и проценту излеченных животных. Контролем служили крысы-опухоленосители без какого-либо воздействия. Показано, что эффективность фотодинамической терапии с использованием борхлорина липосомального лиофилизата зависит от дозы фотосенсибилизатора и параметров лазерного излучения. Ключевые слова: опухоль, фотосенсибилизатор, лазер, динамика накопления.
J.S. Osipchuk, V.V. Drozhzhina PHOTODYNAMIC THERAPY OF SARCOMA М-1 OF RATS WITH USE OF A NEW PHOTOSENSITIZER BORONATED CHLORINE LYOPHILIZED LIPOSOME FSBI «Medical radiological centre of science», Obninsk Abstract Research is spent on rats with sarcoma М-1 with use of a new photosensitizer boronated chlorine lyophilized liposome. Studying of possibility of an effective use liposomal a photosensitizer for photodynamic therapy of tumors and research of dynamics of its accumulation in a tumor and a healthy tissue was a research objective. Efficiency of therapy estimated: on factor of a pure gain of a tumor, on tumor growth inhibition, on percent of animals with full regress of a tumor, on percent of relapses of a tumor and to percent of the cured animals. As the control rats-opuholenositeli without any influence served. It is shown, that efficiency of photodynamic therapy with use boronated chlorine lyophilized liposome depends on a dose of a photosensitizer and parameters of laser radiation. Key words: tumour, photosensitizer, laser, dynamics of accumulation. Введение В Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН был синтезирован В настоящее время ФДТ занимает одно из препарат борированный хлорин (Патент №2406726 ведущих мест в локальном лечении поверхностных от 20 декабря 2010 года) [7]. В Первый МГМУ им. опухолевых заболеваний [1; 8-10]. ФС обладают И.М. Сеченова на кафедре фармацевтической тех-большим терапевтическим потенциалом, но дейст- нологии и фармакологии была разработана и синте-вие многих из них сопряжено с побочными эффек- зирована новая лекарственная форма «Борхлорин тами. Прогресс ФДТ опухолей связан с созданием липосомальный лиофилизат». эффективных ФС, обеспечивающих достаточный Цели данной работы - изучить динамику терапевтический эффект при минимальном повре- накопления борхлорина липосомального лиофили-ждении окружающих здоровых тканей и отсутст- зата в опухоли и здоровой ткани; определить ми-вии общетоксического действия. В течение послед- нимальную дозу ФС для достижения противоопу-него десятилетия в ФДТ злокачественных новооб- холевого эффекта после ФДТ при плотности энер-разований большой интерес в качестве ФС вызы- гии 150 Дж/см2 и плотности мощности лазерного вают производные ряда хлорофилла [4-6; 11]. В излучения 0,25 Вт/см2; определить процент изле-настоящее время ведутся активные работы по соз- ченных животных после ФДТ. Данные параметры данию структуризированных (липосомальных) лазерного излучения были выбраны, исходя из ра-форм ФС с расширенным спектром возможностей нее проведенных нами исследований различных [2]. Липосомальные формы ФС проявляют на поря- ФС, в том числе - и ФС хлоринового ряда (фотоди-док большую световую токсичность при отсутст- тазин, фотолон, радахлорин, борированный хло-вии темновой токсичности. Они обладают повы- рин). При данных параметрах лазерного излучения шенной селективностью накопления и увеличивают отмечены высокая противоопухолевая эффектив-эффективность ФДТ, их возможно лиофилизиро- ность и малое воздействии на здоровые ткани, что вать и хранить при пониженной температуре. выражалось в более быстром заживлении язвенной
№ 4/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
48 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА...
поверхности кожи и подтверждено морфологиче- тры опухолевой и здоровой тканей. Первое измере-скими исследованиями. При использовании лазер- ние проводили до введения препарата (0 ч), а затем ного воздействия с плотностью энергии 150 Дж/см2 через 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 ч и до полно-некроз окружающих опухолевые узлы нормальных го выведения из тканей животного. тканей менее выражен. При этом отмечается более Для суждения о селективности накопления ФС интенсивный процесс элиминации и организации в опухоли по отношению к здоровой ткани рассчиты-зон некроза и восстановление поврежденной нор- вали индекс контрастности (опухоль/здоровая ткань). мальной ткани [3] . Остаточную фототоксичность препарата изучали по времени полного выведения препарата Материалы и методы из исследуемых тканей. Исследования были проведены на 45 беспо- Изучение параметров родных крысах. В качестве экспериментальной мо- максимально эффективной дозы ФС дели опухоли использовали саркому М-1 крыс. Но- В опыте было 4 группы животных. ФДТ вообразование перевивали под кожу в область бед- проводили с одинаковыми параметрами ла2зерного ра в виде кусочков опухоли донора. В опыт крыс излучения (плотность энергии 150 Дж/см2, плот-брали на 7 - 9 день, когда пальпируемая опухоль ность мощности 0,25 Вт/см ): достигала в диаметре 0,7-1,0 см. Шерстный покров 1 группа. Доза ФС 0,75 мг/кг; выстригали и депилировали. В качестве ФС ис- 2 группа. Доза ФС 1,25 мг/кг; пользовали новый мембраноактивный фотосенси- 3 группа. Доза ФС 2,5 мг/кг; билизатор на основе борированного хлорина е6 для 4 группа. Доза ФС 5,0 мг/кг. фотодинамической терапии опухолей - лекарст- Через 3,5 ч после внутрибрюшинного введе-венная форма «Борхлорин липосомальный лиофи- ния ФС опухоль облучали лазером. лизат» для приготовления раствора для инъекций Контроль. Крысы-опухоленосители без како-1,0 мг (рис. 1). Препарат представляет собой сухую го-либо воздействия. пористую массу молочно-зеленого цвета. Непо- Животные при облучении находились под об-средственно перед введением препарат растворяли щим тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно 2,5 в 4 мл воды для инъекций и интенсивно встряхива- % раствор в объеме 0,2 мл/100г массы животного). ли в течение 1 мин до образования дисперсии мо- Источником лазерного излучения служил лочно-зеленого цвета. полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус- 2» производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» ^ (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662 ± I 1 1 нм. Диаметр светового пятна составлял 1,5 см. Объём опухоли измеряли: до проведения ФДТ (У0), 1 I_/ \ на 3; 7; 10; 14 и 21 сутки от начала лечения. На- У-ЫН N ( блюдение за животными проводили до 50 суток ^ Ь после ФДТ. Эффективность ФДТ оценивали, следуя ре_/ || 1 \_ комендации Фармкомитета по предклинической 0 апробации препаратов: Т \ ^=0 Н 1. По коэффициенту абсолютного прироста ^ _/ Н|.| Н ^в Н ® опухоли (К). Для этого сначала вычис-X М ляли объёмы опухолей по формуле: 0 Ме Ме ХШ У = \П * ^ *ё2 * а3> где Н-В^ф/^в-Н 6 ^^ <4 а2 ,а3, - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли, | 1 Н V - объем опухоли в см3. Н Коэффициент абсолютного прироста опухо-Рис. 1. Липосомальная форма борированного хлорина. ли (К) рассчитываем по формуле: к V - V Исследование динамики накопления ФС к = > где в опухоли и здоровой ткани крыс у0 Для изучения динамики накопления препа- V0 - объем опухоли до воздействия, рат борхлорин липосомальный лиофилизат вводили vt - объем опухоли на определенный срок наблюдения. крысам с саркомой М-1 внутрибрюшинно в дозе 5,0 мг/кг. Уровень накопления фотосенсибилизатора 2. По торможению роста опухоли (ТРО %). оценивали по интенсивности флуоресценции. Из- ТРО вычисляли по формуле: мерение уровня накопления ФС в опухолевой и у — у здоровой тканях изучали с помощью спектрофлуо- ТРО = к 0 * 100% где ресцентного метода на комплексе ЛЭСА-01- Ук «Биоспек» (Россия). Датчики подводили к коже над „ _ .. 4 ' " V - средний объем опухоли в контрольной группе опухолью и в трех точках под прямым углом к объ- 7 ^ „ ^ екту (центр, периферия 1 и периферия 2). Накопле- ^ - средний объем опухоли в опытной группе. ние в здоровой ткани определяли на здоровой ткани бедра с опухолью (контроль 1) и на ^отавою- 3. По,пр°центу в группе(С шл-ложенном бедре (контроль 2). Перед измерением ши^ссви (Ш>%о) ощгжыш (К = -шерстный покрров депилировали. Врремя экспозиции 1'00)' За полную регрессию опйхоли мы составляло 1-2 секунды. В различные сроки после щжшшалш отсутствие видимой и паль-введения ФС у каждого животного измеряли спек- пируемой опухоли.
№ 4/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫМ-1 КРЫС..
49
4. По проценту излеченных животных. Для этого крысы были оставлены до 50 дней после ФДТ для наблюдения за рецидивами опухоли и до полного заживления язвенной поверхности кожи. Статистическую обработку результатов исследований проводили в компьютерной программе «^аЙБЙса» непараметрическими методами для независимых групп (описательная статистика, метод и теста Манна-Уитни).
Результаты и обсуждение
Исследование динамики накопления ФС в опухоли и здоровой ткани Из данных, представленных на рис. 2 видно, что в течение 4 ч после внутрибрюшинного введения борхлорина липосомального лиофилизата в дозе 5,0 мг/кг происходит постепенное увеличение уровня накопления его как в опухоли, так и в здоровой ткани. Максимальный уровень накопления ФС в опухоли наблюдался через 3,0-4,0 ч после введения ФС и держался на этом уровне в течение 48 ч (интенсивность флюоресценции в эти сроки в опухолевой ткани от 4,7 до 5,0 у.е.). Затем интенсивность флюоресценции снижается и на 10 сутки практически равна исходной величине - интенсивности флюоресценции до введения ФС. Что касается индекса контрастности, то самый высокий, 1,25, мы наблюдали через 3,5 ч. Практически полное выведение ФС из опухолевой и здоровых тканей животного наблюдалось через 240 ч (10 суток).
Таким образом, оптимальное время проведения лазерного облучения после введения ФС наступает через 3,5 ч - т.е. в это время мы имеем высокое накопление ФС в опухолевой ткани и. Заметной селективности накопления препарата в опухолевой ткани мы не получили на протяжении всего срока исследования. Введенная доза препарата 5,0 мг/кг оказалась высокой (не терапевтической дозой) для крыс с саркомой М-1, но даже при такой дозе он практически полностью выводится из организма через 10 суток.
Изучение параметров максимально эффективной дозы ФС Через 3,5 ч после внутрибрюшинного введения препарата в дозах 0,75; 1,25; 2,5 и 5,0 мг/кг проводили ФДТ. Результаты исследований показали, что при дозах ФС 2,5 и 5,0 мг/кг и одинаковых параметрах лазерного излучения (плотность энергии 150 Дж/см2 и плотность мощности 0,25 Вт/см2), достигался максимальный эффект ФДТ, выраженный в полной регрессии опухоли у 100 % животных в группе по всем срокам исследования (табл. 1). У большинства животных на месте облучения лазером на 3 сутки наблюдался отек и различной плотности корочки, под которыми шло образование грануляций. К 7 суткам у всех животных наблюдались корки разной степени выраженности. К 25-48 суткам у 100 % животных язвы заживали (табл. 2), на их месте признаков опухоли визуально не обнаруживалось, т. е. доля излеченных особей составляла 100 %. Степень повреждения ткани в области облучения зависела от дозы ФС. При дозе 5,0 мг/кг язвы были более выраженными и заживали дольше (39,0±2,4), чем при дозе 2,5 мг/кг (35,6±1,8). При дозе 1,25 мг/кг язвы были менее выраженными и заживали еще быстрее (33,4±1,9), но на 32 сутки после ФДТ у одной крысы (10 %) наблюдался рецидив опухоли и процент излеченных животных на 50 сутки после ФДТ был 90 %. При дозе ФС 0,75 мг/кг на 21 сутки исследования у 2 животных (14,3 %) наблюдался рецидив опухоли. ТРО на 21 сутки исследования было значительным по сравнению с контролем и составило 94,0 % при 85,7 % ПР опухоли. Эти животные (12 крыс) без видимой и пальпируемой опухоли были оставлены до полного заживления язв и излечения. Но при дальнейшем наблюдении еще у 2 крыс (14,3 %) наблюдался рецидив опухоли (на 24 и 34 сутки после ФДТ). Заживление язв у оставшихся 10 крыс при данной дозе ФС было более быстрым (30,4±1,6) и достоверно отличалось от срока заживления язв у крыс с дозой ФС 5,0 мг/кг (р < 0,010) и с дозой ФС 2,5 мг/кг (р < 0,030). Но максимально эффективного противоопухолевого результата при данной дозе мы не получили, процент излеченных животных составил 71,4 % и у 28,6 % животных наблюдался рецидив опухоли.
Индекс контрастности
1,4
1,2 -1 -0,8 0,6 -0,4 0,2
0
О 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 3,5 4 ч ч ч ч ч ч ч
24 48 96 120 144 168 192 240 чччччччч
0 0,5 ч 1,0 ч 1,5 ч 2,0 ч 3,0 ч 3,5 ч 4,0 ч
24 ч 48 ч 96 ч 120 ч 144 ч 168 ч 192 ч 240 ч
I Опухолевая ткань
□ Здоровая ткань
6
5
4
3
Ш 2
0
Рис. 2. Уровень накопления и индекс контрастности борхлорина липосомального лиофилизата в опухолевой и здоровой тканях крыс и скорость выведения ФС из тканей после внутрибрюшинного введения в дозе 5,0 мг/кг массы животного.
50
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА.
Как показали результаты исследований, минимально эффективная доза ФС 2,5 мг/кг (при плотности энергии лазерного излучения 150 Дж/см2 и плотности мощности 0,25 Вт/см2). При данной дозе достигался эффект полной регрессии опухоли и полное излечение у 100 % животных. Реакция кожных покровов в области лазерного облучения была менее выражена, и наблюдалось более быстрое восстановление тканей, чем при дозе ФС 5,0 мг/кг.
Выводы
1. Оптимальное время проведения лазерного облучения после внутрибрюшинного введения борхлорина липосомального лиофилизата наступает через 3,5 ч, когда индекс контрастности достигает своего максимального значения.
2. Время полного выведения препарата из организма (остаточная фототоксичность) при дозе ФС 5,0 мг/кг составило 10 суток.
3. Противоопухолевый эффект после ФДТ получен при всех исследуемых дозах ФС (0,75; 1,25; 2,5; 5,0 мг/кг).
4. Минимальная доза ФС, приводящая к полной регрессии саркомы М-1 и полному излечению у 100 % животных после ФДТ при внутрибрюшинном введении - 2,5 мг/кг, при плотность энергии лазерного излучения 150 Д2ж/см2 и плотность мощности 0,25 Вт/см .
5. Наиболее выраженный терапевтический эффект был получен при дозе ФС 2,5 мг/кг, при плотности энергии лазерного излучения 150 Дж/см2 и плотности мощности 0,25 Вт/см2. Реакция кожных покровов в области лазерного облучения была менее выражена, и наблюдалось более быстрое восстановление тканей, чем при дозе ФС 5,0 мг/кг.
Таблица 1
Динамика роста саркомы М-1 крыс после ФДТ с борхлорином липосомальным лиофилизатом в разных дозах и при
№ группы Доза препарата и n животных в группе, n 1. V; 2. К; 3. ТРО %; 4. ПР% Сроки заживления язв после ФДТ (сут.) и % излеченных животных
Время исследования после ФДТ
3 сут. 7 сут. 10 сут. 14 сут. 21 сут.
1. 0,75 мг/кг n - 14 Полная регрессия опухоли у 100 % крыс 1,184±0,130 -0,19 ± 0,57 94,0 % 85,7 % 30,4±1,6 71,4 %*
2. 1,25 мг/кг n - 10 Полная регрессия опухоли у 100 % крыс 33,4±1,9 90 %**
3. 2,5 мг/кг n - 8 Полная регрессия опухоли у 100 % крыс 35,6±1,8 100 %
4. 5,0 мг/кг n - 8 Полная регрессия опухоли у 100 % крыс 39,0±2,4 100 %
Контроль (V, K) n - 11 1,217±0,076 1,28 ± 0,23 4,025±0,238 6,97 ± 1,25 6,839 0,602 12,82±2,41 11,116±1,377 20,36±3,65 28,013 ±3,665 52,54±10,56 -
*у 4 крыс с дозой фотосенсибилизатора 0,75 мг/кг - рецидив опухоли; ** у 1 крысы с дозой фотосенсибилизатора 1,25 мг/кг - рецидив опухоли. V - объём опухоли ; К - Коэффициент абсолютного прироста опухоли; ТРО % - торможение роста опухоли; ПР% - процент полной регрессии
Таблица 2
Сроки заживления (сутки) кожных язв после ФДТ при различных дозах ФС __
Доза препарата 0,75 мг/кг 1,25 мг/кг 2,5 мг/кг 5,0 мг/кг
n животных 14 10 8 8
Сроки заживления, сутки 30,4 ± 1,6 33,4 ± 1,9 35,6 ± 1,8 39,0 ± 2,4
Литература
1. Гаркуша Н.Ф., Гончарова Н.Ю. Характеристика саркомы М-1 крыс // Науч. докл. высшая школа биол. науки. - 1990.-№5. - С. 154-60.
2. Зорина Т.Е., Янковский И.В., Кравченко И.Е. и др. Липосомальные формы фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и характеристики их накопления в клетках. elib. bsu. bv^itstream/123456789/16974/Шорина Т...
3. Каплан М.А., Ольшевская В.А., Кучин А.В. и др. Новые отечественные борсодержащие фотосенсибилизаторы для противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, №1. - С. 16
4. Каплан М.А., Никитина Р.Г., Ольшевская В.А. и др. Изучение биологического действия многофункциональных комплексов коньюгатов борированных хлоринов // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. - 2010. - Вып. 15. - С. 138-42.
5. Никитина Р.Г., Ольшевская В.А., Штиль А.А. и др. Эффективность ФДТ экспериментальной опухоли М-1 с новым фотосенсибилизатором // Российский биотерапевтический журнал. - Материалы X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». - 2011. - Т.10, №1. - С. 41.
6. Ольшевская В.А., Савченко А.Н., Зайцев А.В. и др. Производные 13(1)-N-{2-[N- (клозо-монокарбадодекабора-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3) диметилового эфира хлорина е6. Утвержденный патент 2010 год.
7. Романко Ю.С., Цыб А.Ф., Каплан М.А., Попучиев В.В. Зависимость противоопухолевой эффективности фотодинамической терапии от плотности световой энергии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. -Т. 139, №4. - С. 456-61.
8. ЦыбА.Ф., КапланМ.А., РоманкоЮ.С., ПопучиевВ.В. Фотодинамическая терапия // Мед. информ. агентство. - 2009. - С. 193.
9. Каплан М.А., Никитина Р.Г., Малыгина А.И. Экспериментальная разработка путей оптимизации фотодинамической терапии // Лазерная и фотодинамическая терапия. Тез. докл. междунар. конф. - Обнинск. -1999. - С. 17-8.
10. Цыб А.Ф., Каплан М.А. Экспериментальные аспекты фотодинамической терапии. - Калуга: Издательство Н.Ф. Бочка-ревой, 2010. - 204 с.
11. Чан Тхи Хай Иен, Г.В. Раменская, Н.А. Оборотова. Фотосенсибилизаторы хлоринового ряда в фотодинамической терапии опухолей // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 4. - С. 99-105.
