Фотоабляция биологических тканей Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

НОВЫЕ МЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ

УДК 535.36+535.34+519.245

В. Е. Привалов, А. Ю. Сетейкин1

ФОТОАБЛЯЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ

ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет 1 Амурский государственный университет, г. Благовещенск

Простой и удобный источник УФ излучения стал доступен после создания экси-мерных лазеров в 1970 г. [1,2]. Эксимерный лазер — газовый импульсный лазер, генерирующий излучение света различной длины волн в ультрафиолетовой (УФ) области спектра (аргон-фтор—193 нм; криптон-фтор — 248 нм; ксенон-фтор — 308 нм), не вызывает существенного нагревания ткани роговицы. Именно коротковолновое излучение эксимерного лазера нашло применение в рефракционной хирургии. Термин «экси-мер» происходит от английского словосочетания «exited dimmer» (возбужденные димеры). Исследование взаимодействия УФ лазерных импульсов с твердыми органическими материалами, такими как органические полимеры и биологические ткани, привело к открытию в 1982 г. феномена «абляционного фоторазложения» [3]. Оно заключается в разложении органических твердых тел фотонами и выбросе фрагментов (этих тел) при сверхзвуковых скоростях. В результате получается «вытравленный» фрагмент, геометрия которого определяется световым пучком.

В физической литературе термином «абляция» (от лат. «ablatio» —отнятие, устранение) обозначают совокупность сложных физико-химических процессов, результатом которых является удаление (унос) вещества с поверхности или из объема твердого тела. Подавляющее большинство исследователей под лазерной абляцией подразумевает процесс разрушения твердого вещества, аналогичный испарению или сублимации, обычно осложненный наличием конденсированной фазы в продуктах разрушения [4,5]. Анализ литературы по лазерной абляции позволяет выделить три отличительные черты этого процесса: 1) абляция непосредственно связана с поглощением лазерной энергии в материале; 2) абляция может, в принципе, протекать в вакууме или инертной среде; 3) результатом лазерной абляции является формирование парогазового облака продуктов абляции [4].

Целью настоящего обзора является систематизация основных результатов в исследованиях по фотоабляции. В частности, рассматриваются два вопроса: механизмы фотоабляции и модель фотоабляции. Оба эти вопроса важны для различных практических применений фотоабляции в медицине.

Физико-химические механизмы фотоабляции. Роговая оболочка поглощает излучение ультрафиолетовой части спектра с длиной волны менее 0,28 мкм за счет аминокислот, нуклеиновых кислот и глюкозамингликанов (хроматофоров) и инфракрасное

© В. Е. Привалов, А. Ю. Сетейкин, 2010

излучение с длиной волны 1,5 мкм и более за счет воды. Таким образом, излучения этих длин волн могут быть использованы для лечения или повреждения роговой оболочки. На рис. 1 показано поперечное сечение роговицы, подвергнутое действию ЛгЕ эксимер-ного лазера. Удаление ткани происходит без термических повреждений, в отличие от коагуляции и испарения. Это может служить доказательством того, что ткань была очень точно «вытравлена». Этот вид УФ свето-индуцированной абляции называется фотоабляцией.

Рис. 1. Фотоабляция тканей роговицы, полученная с помощью ЛгР эк-симерного лазера (длительность импульса —14 нс, плотность энергии 180 мДж/см , длина полосы— 100 мкм) [3]

Фотоабляция впервые была обнаружена Впшуавап И,., Маупе-Вап1юп V. (1982) [3]. Они идентифицировали этот эффект как абляционное фоторазложение, означающее что материал разлагается под действием высокоинтенсивного лазерного излучения. Типичные пороговые значения плотности мощности для этого типа взаимодействия: 107--108 Вт/см2 для наносекундных лазерных импульсов. Глубина абляции, т. е. глубина удаления материала за один импульс, определяется энергией импульса вплоть до определенного предела насыщения. Геометрия образца при абляции определяется пространственными характеристиками лазерного пучка. Основное преимущество этого вида абляции заключается в точности травления процесса, как показано на рис. 1, отличной предсказуемости и невозможности термического повреждения соседних тканей.

Первые исследования абляционного фоторазложения были выполнены на полиметил-метакрилате (ПММ), полимиде, тефлоне и других синтетических органических полимерах. После этого фотоабляции стали подвергаться биологические ткани. В настоящее время фотоабляция — один из наиболее успешных методов в рефрактивной корнеальной хирургии, при которой преломляющая способность роговицы изменяется при миопии, гиперметропии или астигматизме. Для простоты ограничимся объяснениями, данными в работе [6] для случая синтетических полимерных мишеней. В силу их однородности, легко объяснить их поведение при определенных экспериментальных условиях. Таким образом, экспериментальные данные по процессу абляции являются очень надежными и теоретическое моделирование упрощено. Тем не менее, как известно, большинство теорий применяется для неоднородных тканей.

Органические полимеры состоят из больших молекул, включающих более чем 103

атомов, в основном углерода, водорода, кислорода и азота. Более мелкие молекулярные соединения, содержащие порядка 50 атомов, называются мономерами. Они повторяются несколько раз вдоль отчетливо выраженной оси, образуя полимерную цепочку. На рис. 2, а-б показаны основные химические структуры наиболее популярных полимеров ПММ и полимида.

а

сн3 сн3 сн3 сн3

III!

-с — сн2—с — сн2-с — сн2 — с - сн2 —

СО СО СО СО

1111 ОСН3 ОСН3 ОСН3 осн3

о о

II II

II II

о о

Рис. 2. (а) Химическая структура четырех мономеров ПММ. (б) Химическая структура одного мономера полимида

Для ПММ временная динамика фотоабляции была промоделирована Garrison B. J., Srinivasan R. (1985) [6] с использованием уравнений движения Ньютона. Полимер описывается аморфными мономерными звеньями, связанными благодаря сильным силам притяжения. Взаимодействие с лазерным излучением моделировалось с учетом каждого мономерного звена, подвергшегося возбуждению непосредственно при притяжении и отталкивании. Этот процесс связан с изменением объема, занимаемого каждым мономерным звеном, что приводит к переносу импульса, и, таким образом, приводит к абляции. Для простоты рассмотрим гранецентрированный кубический кристаллический массив, с плотностью 1,22 г/см3, массой мономера 100 а.е.м и периодом решетки 0,81 нм. Главные силы притяжения между мономерными звеньями, связывающие их — это две углерод-углеродные связи вдоль цепи. Прочность такой C==C связи приблизительно 3,6 эВ. (см. табл. 1). Сила отталкивания пропорциональна 1/r12, где r—расстояние между двумя мономерами. Исходя из этих предположений, был смоделирован процесс абляции, показанный на рис. 3.

Характер связей в органических полимерах в основном ковалентный. Для того чтобы получить физическое объяснение процесса, рассмотрим два атома А и В, связанных общим электроном. Соответствующая диаграмма энергетических уровней основного и нескольких возбужденных состояний показана на рис. 4. Согласно макромолекулярной структуре, каждый электронный уровень может быть разбит на множество колебательных уровней. Поглощение фотона может вызвать переход двух атомов в возбужденное состояние (AB)*. Обычно возбуждение происходит согласно принципа Франка—

Тип связи Энергия диссоциации (эВ)

о о 7,1

с=с 6,4

о—н 4,8

к—н 4,1

о о 3,6

с—с 3,6

э—н 3,5

С—N 3,0

с—э 2,7

Рис. 3. Компьютерное моделирование фотоабляции, показывающее движение мономеров ПММ с течением времени [6]

Кондона. Это означает, что радиальное расстояние между двумя ядрами атомов А и В не изменяется в процессе возбуждения, поскольку масса электрона очень мала. Таким образом, предпочтительными являются переходы, показанные вертикальной линией на диаграмме энергетических уровней (рис. 4). Вероятность такого перехода возрастает, если максимум соответствующих функций Шредингера в начальном и конечном состоянии совпадает при одинаковом радиальном расстоянии.

Плотность энергии (мДж/смг)

Рис. 4. Диаграмма энергетических уровней при фотоабляции

Если поглощается фотон УФ излучения, то при этом прирост энергии обычно становится выше доступной в электронном состоянии, превышающей энергию связи. В этом случае два атома А и В могут диссоциировать при последующем колебании. Таким образом, фотоабляцию можно рассматривать как двухшаговый процесс:

• возбуждение:ЛБ + Ьи ^ (ЛБ)* ,

• диссоциация:(ЛБ)* ^ Л + Б + Ект

Энергия диссоциации некоторых химических связей представлена в табл.1. Кроме того, в табл. 2 даны длина волны и соответствующие энергии фотонов некоторых лазерных систем. Сравнивая эти таблицы, можно увидеть, что только излучение УФ лазеров, особенно эксимерных, обеспечивают энергию, необходимую для диссоциации таких связей. Следовательно, механизм взаимодействия при фотоабляции ограничивается применением УФ-света.

Таблица 2. Длина волны и энергия фотонов некоторых лазерных систем

Тип лазера Длина волны (нм) Энергия фотонов (эВ)

А1Р 193 6,4

К1Р 248 5,0

Ш:УЬР (4со) 263 4,7

ХеС1 308 4,0

ХеР 351 3,5

Аргоновый 514 2,4

Ш:УЬР (2со) 526,5 2,4

Не-N6 633 2,0

Полупроводниковый 800 1,6

Ш:УЬР 1053 1,2

Ш:УАС, 1064 1,2

Но:УАС, 2120 0,6

РпУАС, 2940 0,4

С02 10000 0,1

Извлеченные фотопродукты эксимерной лазерной абляции были проанализированы в нескольких исследованиях [3,8]. Обычно, это смесь простых атомов (С, N Н, О), молекул (С2, СМ, СН, СО) и стабильных фрагментов (ММЛ — мономеры, НСМ, бензол). Было обнаружено, что композиция продуктов зависит от длины волны излучения. Впшуавап И. и др. (1986) [9] обнаружили, что излучение с длиной волны 248 нм генерирует фрагменты с большим молекулярным весом, чем излучение с длиной волны 193 нм. Таким образом, соответствующая поверхность травления при длине волны 248 нм, более грубая и менее предсказуемая, чем на длине волны 193 нм.

Кроме того, было обнаружено, какое пороговое значение интенсивности должно быть приложено, чтобы достичь фотоабляции. Выше этой интенсивности четко выраженная глубина абляции зависит от коэффициента поглощения и интенсивности падающего излучения. В то же время был слышен звук и наблюдалась видимая флуоресценция в месте влияния. Если интенсивность падающего излучения небольшая, так что глубина абляции меньше, чем соответствующая оптическая длина поглощения, последующие импульсы попадают частично в облучаемую ткань, а также в ткани, расположенные под ней. Следовательно, интересны только первые несколько импульсов. После этого получают линейное соотношение между числом применяемых импульсов и полной глубиной травления. На практике глубину травления усредняют за несколько импульсов и называют глубиной абляции за импульс. Это значение, воспроизводимое с неопределенностью около 10% для большинства материалов, и является важной величиной, когда в расчет принимаются все неоднородности внутри ткани. Физические принципы фотоабляции видны из приведенной ниже схемы:

Поглощение УФ-фотонов с высокой энергией Переход в возбужденное состояние

Можно сделать вывод, что фотоабляция — это процесс, ограничивающийся применением УФ света. Однако он не ограничивается применением только эксимерных лазеров, поскольку генерация высших гармоник других типов лазеров также порождает УФ излучение. Например, как показано Niemz М.Н. и др. (1994) [10], 4-ая гармоника твердотельного лазера также вызывает фотоабляцию. На рис. 5, а-б и рис. 6, а-б показан образец ткани роговицы, который был подвергнут действию второй и четвертой гармоник М(4:УЬЕ лазера. В обоих случаях длительность импульса составляла 30 пс. Высшие гармоники были достигнуты применением двух кристаллов ББО (БаБ2О4). Энергия импульсов была примерно 150 мкДж для зеленого и 20 мкДж для УФ-излу-чения. Лазерный луч сканировал поверхность образца, размером 1 х 1 мм2. Можно увидеть четкие места действия сфокусированного лазерного луча второй гармоники и четкий удаленный однородный слой при действии четвертой гармоники. Последний

Рис. 5. (а) Ткань роговицы под действием второй (справа) и четвертой (слева) гармоник Nd:YLF лазера (длительность импульса— 30 пс). (б) Увеличенный фрагмент границы с соседними зонами [10]

пример доказывает фотоабляцию, другие примеры относятся к плазмо-индуцирован-ной абляции.

Модель фотоабляции. Для того чтобы создать модель, которая описывает зависимость глубины абляции от интенсивности падающего излучения, большинство групп [3, 6, 11-14] основывались на предположении достоверности закона Бугера—Ламберта

Рис. 6. (а) Ткань роговицы под действием второй и четвертой (слева) гармоник Nd:YLF лазера (слева). Увеличенный фрагмент области взаимодействия при действии излучения второй гармоники (справа). (б) Ткань роговицы, под действием второй (справа) и четвертой (слева) гармоник Nd:YLF лазера (слева). Увеличенный фрагмент области взаимодействия при действии излучения четвертой гармоники (справа) [10]

для поглощения света:

I(г) = 1о ехр(—а)

(1)

где г — глубина проникновения излучения, 1о — интенсивность падающего излучения, а — коэффициент поглощения ткани. Для того чтобы оценить уменьшение интенсивности, продифференцируем (1) по г, получим:

Фотоабляция произойдет только, если левая часть выражения (2) не станет ниже определенного порогового значения а.1рь:

где а.1рь — пороговая интенсивность фотоабляции. Это условие говорит о том, что определенное количество энергии должно поглощаться в единице объема за единицу времени для того, чтобы возникла фотоабляция. Пороговая интенсивность 1рь определяется минимальным количеством связей, которые нужно разрушить, чтобы получить расщепление. Таким образом, получаем:

Это простая модель хорошо описывает фотоабляцию, за исключением пороговых значений 1рь в начале фотоабляции и 1р1 в начале образования плазмы. Кривая абляции в логарифмическом масштабе для роговицы кролика показана на рис. 6. Обычно глубина абляции за импульс выражается через плотность энергии падающего излучения Ео, где Ео = 1от, где т — длительность импульса. Логарифмическая зависимость, т. е. центральная и линейная часть на рис. 6 дают хорошее согласие с теоретическими предположениями, основанными на (3). Эта часть кривой абляции наблюдается для большинства видов тканей. Однако пороговое значение 1рь меняется не так резко, как следует из выражения (3), т. е. наклон кривой достигает нуля при пересечении оси абсцисс. Этот результат наиболее вероятно следует из неоднородности размеров фрагмента. Порог абляции определяется средним значением <1рь>, в зависимости от размеров фрагмента, подвергающегося лазерному воздействию. Представим, что такой фрагмент был связан несколькими молекулами до начала абляции. Как только достигается определенное соотношение между диссоциирующими молекулами, фрагмент отрывается. Поскольку большие фрагменты имеют маленькую поверхность по сравнению с их объемом, пороговое значение !рь уменьшается с увеличением размеров фрагментов абляции. Следовательно, усредняя размеры различных фрагментов, приходим к гладкому наклону кривой к оси абсцисс.

Выше второго порогового значения 1р (порога образования плазмы) наступает насыщение, как показано на рис. 6. Этот эффект происходит, благодаря широко известному явлению, называемому плазменным экранированием. Как только плазма возбуждается с высокой плотностью мощности, это приводит к образованию сильных электри-

(2)

а1 (г) > а1рН,

1о ехр(-аг) > 1рН. Глубина абляции й, т. е. глубина, при которой I(г) = 1р^:

а 1рН а

(3)

ческих полей, большая часть лазерного излучения поглощается плазмой, что вызывает нагрев и появление дополнительных тепловых эффектов. Вся избыточная энергия переходит в тепло, что препятствует дальнейшему увеличению глубины абляции. Следовательно, кривая абляции достигает насыщения при высоких плотностях энергии. Коэффициент поглощения ар индуцированной плазмы значительно выше коэффициента поглощения ткани а. Следовательно, выражения (1)—(3) могут применяться.

В 80-х годах возник вопрос о том, что фотоабляция основывается на фотохимических и фототепловых процессах. Эта дискуссия вызвала большие споры. Andrew J. E. и др. (1983) [13], Brannon J. H. и др. (1985) [8] утверждали, что фотоабляция объясняется исключительно тепловыми эффектами, а Garrison B. J. и Srinivasan R. (1985) [6] приписывали фотоабляцию к фотохимическим эффектам. В настоящее время общепринято считать, что фотоабляция или абляционное фоторазложение имеет свои собственные механизмы взаимодействия, отличные от чисто фотохимических и тепловых процессов. Тем не менее, из-за диссоциации молекул в процессе фотоабляции химические переходы имеют место, что оправдывает заблуждения по поводу термина «фотохимическая абляция». Но что касается исторической последовательности, термин «фотохимический» был введен для взаимодействия длительных импульсов с фотосенсибилизаторами [15]. И только абляция, вызванная УФ фотонами, может считаться фотоабляцией.

Для того чтобы отличить фотоабляцию (абляционное фоторазрушение) от теплового взаимодействия, тщательно рассмотрим диаграмму энергетических уровней (рис. 4). В случае фотоабляции энергии единственного УФ фотона достаточно для диссоциации связей в молекуле AB. При тепловом взаимодействии ситуация совершенно противоположная. Энергии фотона недостаточно, чтобы перевести молекулу в состояние отталкивания. Молекула переходит только в колебательное состояние в пределах основного уровня или в низшее электронное состояние, включая любое из колебательных состояний. Посредством безизлучательной релаксации поглощенная энергия затем рассеивается в тепло, и молекула возвращается в основное состояние. Следовательно, критический параметр для различия этих двух механизмов — это энергия фотона или длина волны.

Только, если hv > 3, 6 эВ, или Л < 350 нм, достаточно единственного фотона, для диссоциации C—C связей. Конечно, несколько фотонов с энергией hv < 3, 5 эВ могут поглотиться. Затем энергия этих фотонов добавляется к общей энергии, что также может привести к состоянию диссоциации. Тем не менее, в течение некоторого времени, необходимого для такого многофотонного поглощения, другие участки ткани становятся колебательно возбужденными, что приводит к глобальному увеличению температуры и заметным термическим эффектам (обычно испарение или плавление). Если этот эффект связан с абляцией, то он называется термодеструкцией (термическим разложением) и отличается от чистого абляционного фоторазрушения. Эти утверждения справедливы, если используются ультракороткие импульсы, с длительностью импульса короче 100 пс и энергией, достаточной для возникновения локализованной микроплазмы. Даже лазерное излучение видимого и ИК диапазонов может происходить без тепловых эффектов [16].

В действительности, чистая фотоабляция наблюдалась только на длине волны 193 нм (ArF эксимерный лазер). Большие длины волн обычно связаны более или менее с тепловыми составляющими. Sutcliffe E., Srinivasan R. (1986) [17] постулировали, что тепловая составляющая излучения XeCl эксимерного лазера на длине волны 308 нм составляет 100% от падающего на ПММ излучения. На рис. 7 приведены тепловые составляющие трех эксимерных лазеров. Очевидно, что каждый лазер вызывает теп-

ловые эффекты при низких плотностях энергии. В случаях ЛгЕ и КгЕ лазеров наклон кривой сильно уменьшается выше определенного порогового значения, т. е. порога фотоабляции. С другой стороны, излучение ХеС1 лазера остается термически активным даже при высоких плотностях энергии.

Рис. 7. Кривая абляции роговицы кролика после действия эксимерным ЛгР лазером (длительность импульса—14 нс) [15]

Данные, представленные на рис. 7, верны только для ПММ. Они не могут быть обобщены для биологических тканей, так как характеристики поглощения ПММ и биологических тканей различны. Однако они утверждают о том, что значения тепловой составляющей возрастают с увеличением длины волны. Следовательно, излучение ЛгЕ лазера является наиболее приемлемым для получения фотоабляции. Излучение ХеС1 лазера может использоваться для тепловой деструкции, хотя в этом случае также применяются лазеры непрерывного действия. КгЕ лазеры применимы как для фотоабляции, так и для тепловой деструкции, но они менее полезны в медицинских приложениях.

Таким образом, УФ лазерная абляция органических материалов вызывает интерес с точки зрения изучения физических и химических процессов, происходящих при лазерном воздействии. Принципы лазерной абляции обеспечивают развитие и совершенствование методов лечения различных заболеваний с использованием лазерных источников УФ диапазона. Использование эксимерных лазеров представляет эффективную терапевтическую альтернативу традиционным методам фототерапии при псориазе и ряде других кожных заболеваний. Основные его преимущества перед другими видами светолечения: возможность применения высокоинтенсивного, высококонцентрированного лазерного излучения локально и прицельно на определенные очаги поражения, исключая воздействие на здоровые кожные покровы. В результате происходит снижение кумулятивной дозы на всю поверхность тела, т. е. снижается риск развития ближайших и отдаленных побочных эффектов; становится возможным облучение очагов поражения в более интенсивном режиме, что ведет к уменьшению количества лечебных процедур, необходимых для достижения клинического эффекта.

Радиальное расстояние

Рис. 8. Тепловые составляющие УФ излучения трех различных эксимерных лазеров (ArF — длина волны193 нм, KrF — длина волны 248 нм, XeCl — длина волны 308 нм) при действии на ПММ [17]

Литература

1. Елецкий А. В. Эксимерные лазеры // Успехи физических наук. 1978. Т. 125, вып. 2. С. 279-314.

2. Эксимерные лазеры / Под ред. Ч. Роудза. М.: Мир, 1981. 287 с.

3. Srinivasan R., Mayne-Banton V. Self-developing photoetching of poly (ethylene terephtha-late) films by far-ultraviolet excimer laser radiation // Appl. Phys. Lett. 1982. Vol. 41. P. 576-578.

4. Анисимов С. И., Лукьянчук. Б. С. Избранные задачи теории лазерной абляции // Успехи физ. наук. 2002. Т. 172, вып. 3. С. 301-333.

5. Булгаков А. В., Булгакова Н. М. Тепловая модель импульсной лазерной абляции в условиях образования и нагрева плазмы, поглощающей излучение // Квантовая электроника. 1999. Вып. 27, №5. С. 154-158.

6. Garrison B. J., Srinivasan R. Laser ablation of organic polymers: microscopic models for photochemical and thermal processes // J. Appl. Phys. 1985. Vol. 57. P. 2909-2914.

7. Pauling L. Die Natur der chemischen Bindung. 1962, Verlag Chemie, Weinheim.

8. Brannon J.H., Lamkard J.R., Baise A.I. et al. Excimer laser etching of polyimide // J. Appl. Phys. 1985. Vol. 58, P. 2036-2043.

9. Srinivasan R., Braren B., Dreyfus R. W. et al. Mechanism of the ultraviolet laser ablation of polymethyl methacrylate at 193 and 248 nm: laser-induced fluorescence analysis, chemical analysis, and doping studies // J. Opt. Soc. Am. 1986. Vol. B3. P. 785-791.

10. Niemz M. H., Loesel F. H., Fischer M. et al. Surface ablation of corneal tissue using UV, green and IR picosecond laser pulses // Proc. SPIE. 1994. Vol. 2079. P. 131-139.

11. Сидорова О. П., Пушкарева А. Е. Моделирование процессов абляции твердых тканей зуба // Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики. 2008. №55. С. 95-103.

12. Кулешова Д. В., Лощенов В. Б., Шевчик С. А. и др. Экспериментальное и теоретическое исследование лазерной гипертермии биологической ткани // Альманах клинической медицины. 2006. № 12. С. 25-28.

13. Andrew J. E., Dyer P. E., Forster D., Key P. H. Direct etching of polymeric materials using a XeCl laser // Appl. Phys. Lett. 1983. Vol. 43, P. 717-719.

14. Deutsch T. F., Geis M. W. Self-developing UV photoresist using excimer laser exposure // J. Appl. Phys. 1983. Vol. 54. P. 7201-7204.

15. Fantes F. E., Waring G. O. Effect of excimer laser radiant exposure on uniformity of ablated corneal surface // Lasers Surg. Med. 1989. Vol. 9. P. 533-542.

16. Латыев С. М., Егоров А. Г., Волчков В. А. Идентификация биологических тканей оптическими методами // Известия высших учебных заведений. Приборостроение. 2007. Т. 50. № 4. С. 63-67.

17. Sutcliffe E., Srinivasan R. Dynamics of UV laser ablation of organic polymer surfaces // J. Appl. Phys. 1986. Vol. 60. P. 3315-3322.

Статья поступила в редакцию 22 января 2010 г.