CC BY
31
УДК 613.287:637.128:637.112
Кухтин М. Д., д. вет. н., ст. н. с. (kuchtyn@yandex.ru),
Тернотлъсъкий нащоналъный техтчныйутеерсытет ш. I. Пулюя Перкш Ю. Б., к. вет. н., ст. н. с.
Тернотлъсъка державна сыъсъкогосподарсъка дослгдна станщя Incmumymy xopMie та сыъсъкого господарства Подыля НААН Крушельницька Н. В., м. н. с. © Державный науково-дослгдный контрольный тстытут ветеринарных npenapamie та кормовых добавок
ФОРМУВАННЯ М1КРОБНИХ БЮПЛ1ВОК НА АБЮГЕННИХ ПОВЕРХНЯХ ЗА PI3HOI П0ЧАТК0В01 К1ЛБКОСТ1 БАКТЕР1Й
Встановлено, що пры вгдмгнтй чыстот1 саштарного стану доыъного устаткування до 500 КУО/см3 змыву протягом часу мгж выкорыстанням обладнання (8 год.) мтрооргашзмы, ят выдыет з молока зб1рного та доыъного обладнання, формуютъ бюпл1вкы нызъког щыъност1 i лыше бактерп Pseudomonas aeruginosa формуютъ б1опл1вкы середнъогщыъност1.
Ключов1 слова: мжробт бюплгвкы, формування, саштарный стан, доглънеустаткування.
Вступ. Одним ¿з ключових завдань саштарп молока е розробка заход1в i технологш для одержання молока незбираного з мммальним вмктом м1крооргашзм1в. Це пов'язано перш за все i3 тим, що проблема мшробного обшяння молока сирого сьогодш виходить на перший план через взаемозв'язок цього показника з якютю та безпечшстю готово! молочно! продукцп. Кшькюний вм1ст бактерш у молощ сирому свщчить про ririeHi4Hi умови його одержання та ефектившсть проведено! первинно! обробки (фшьтрування, охолодження, збер1гання, транспортування).
Найбшьш важливим джерелом мжробного обаяния молока незбираного е до!льне устаткування та молочний швентар [1]. Результати останшх наукових дослщжень вказують, що мжрооргашзми виживають на технолопчному устаткуванш завдяки надзвичайно важливш властивост1 - здатност1 формувати бюпл1вки [2, 3]. Мткробна бюпл1вка - це жива сукупшсть одного або декшькох вид1в чи род1в бактерш, яка постшно оновлюеться, прикршлена до бюгенно! чи абюгенно! поверхш та оточена полюахаридним матриксом [4]. Матрикс - це сум1ш екзополюахарцщв, бшюв, нукле!нових кислот та шших неоргашчних речовин, який захищае бактерп вщ фактор1в навколишнього середовища [5]. Таким чином, здатшсть бактерш до формування бюпл1вки на поверхш до!льного устаткування е важливою умовою !х виживання i вщповщно джерелом надходження у молоко.
М1кробш бюпл1вки, яю утворюються на поверхнях до!льного устаткування, негативно впливають на яюсть сировини i безпеку готово!
© Кухтин М. Д., Першй Ю. Б., Крушельницька Н. В.,2013
377
продукци, зокрема продуктов харчування, оскшьки, в склад! бюпл!вки кр1м сапрофите! мжрофлори можуть бути патогенш мжрооргашзми [6].
1нтенсивнють формування бюпл1вок мшрооргашзмами залежить вщ велико! кшькосп змшних чинниюв, особливо таких, як рщ та вид мжрооргашзму (не Bci мшрооргашзми мають однакову здатшсть до адгезп), ф!зичш i xiMinHi властивост! поверхш (макро- i мжроструктура, електростатичшсть, гщрофшьшсть чи гщрофобшсть матер1алу), еколопчш фактори (осмотичшсть, рН середовища, температура, парщальний тиск кисню, наявшсть антибактер1альних речовин i т.д.), а також вщ початково! кшькост! м1крооргашзм1в на поверхш об'екту [7, 8].
Метою роботи було вивчити здатшсть бактерш формувати 61опл1вки на абюгенних поверхнях в залежност1 в1д р1зно! початково! !х к1лькост1.
Матер1али та методи досл1джень. Експериментальн1 досл1дження проводили в лаборатор1ях Терноп1льсько! державно! сшьськогосподарсько! досл1дно! станц1! 1нституту корм1в та сшьського господарства Под1лля НААН i господарствах Терноп1льсько! област1.
У дослщах використано бактер1! род1в Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Escherichia, Enterococcus, Alcaligenes i Flaobacterium, як1 вид1ленн1 з дошьного устаткування та молока сирого. Мжробюлопчш досл1дження молока та змив1в ¿з до!льного устаткування проводили у вщповщност1 з загальноприйнятими вимогами [9, 10].
Для визначення здатност1 м!кроорган1зм1в формувати бюпл1вки у стерильн1 одноразов! пластиков! чашки Петр! д!аметром 5 см (загальна площа 20 см3) вносили 5 см3 м'ясопептонного бульйону з додаванням 0,5 % розчину глюкози та 1 см3 добово! тест-культури м!кроорган!зм!в ¿з р!зною початковою кшькктю бактер!й. Розведення тест-культури проводили з врахуванням ветеринарно-г!г!ен!чних норматив!в сан!тарного стану дошьного устаткування та молочного швентаря для одержання як!сного та безпечного молока. Вм!ст до 1 тис. бактерш у 1 см3 завис! тест-культури вщповщав чистот! до!льного устаткування до 500 колошеутворюючих одиниць (КУО) в 1 см3 змиву з обладнання (добрий сан!тарний стан), що необх!дно для одержання молока екстра гатунку. Вм!ст до 10 тис. тест-культури у 1 см3 вщповщав нормативу до 5 тис. КУО/см3 змиву (задовшьний саштарний стан) та до 100 тис. i бшьше -в!дпов!дае чистот! устаткування до 50 тис. КУО/см3 змиву, що вважаеться як незадовшьний сан!тарний стан обладнання для одержання молока. 1нкубащю культур проводили за температури 30 °С. Досл!дження щ!льност! сформованих бюпл!вок проводили через певн! пром!жки часу, враховуючи кратн!сть до!ння на молочних фермах i час м!ж використанням до!льного устаткування, зокрема через 4-5, 7-9 та 24 год. Шсля шкубацп, чашки триразово в!дмивали вщ планктонних (неприкр!плених) м!кроорган!зм!в стерильним фосфатним буфером, висушували та ф!ксували утвореш б!опл!вки 96° етиловим спиртом протягом 10 хв. Пот!м фарбували розчином метиленового синього протягом 10 хв. Знову промивали фосфатним буфером, висушували та фарбували розчином фуксину протягом 2 хв. Пкля триразового промивання фосфатним буфером оц!нювали утворен! бюпл!вки в!зуально та п!д м!кроскопом [11]. У чашки Петр!
378
перед шкубащею вносили стерильш скляш пластинки розм1ром 1x2 см для подальших мжроскошчних дослщжень сформованих бюпл1вок.
Для визначення щшьност1 утворених бюпл1вок дослщження проводили аналопчно, але вирощеш бюпл1вки фарбували розчином 0,1 % кристал1чного фюлетового протягом 10 хв.. Пот1м у чашки Петр1 додавали 3 см3 96° етилового спирту \ добре Тх промивали. Вим1рювали оптичну густину промивного розчину спирту спектрофотометрично за довжини хвил1 570 нМ [11]. За оптичноТ густини промивного розчину з чашок Петр1 до 0,5 од. щшьнють сформованих бюпл1вок вважали низькою, вщ 0,5 до 1,0 од. - середньою та за густини розчину бшьше 1,0 од. щшьнють сформовано!'бюпл1вки вважали високою.
Результата дослщжень. Результати дослщжень формування мжробних бюпл1вок на бюгенних поверхнях за р1зноТ початковоТ кшькост1 бактерш наведено на рисунку та в таблищ.
Рис. Формування бюпл1вок бактер1ямн E. coli на абюгенних поверхнях за вм1сту тест-культурн в 1 см3 1 тис. та 10 тис. КУО
Як видно з табл., за початковоТ кшькост1 тест-культур до 1 тис. в 1 см3, що вщповщае чистой доТльного устаткування до 500 КУО/см3 змиву, yci мжрооргашзми, яю видшяли i3 зб1рного молока та доТльного устаткування, через 4 год. формували бюпл1вки низькоТ щшьность Здатнють до формування середньоТ щшьност1 бюпл1вок за даний час проявляли лише культури Pseudomonas aeruginosa за вмюту Тх у 1 см3 завис1 82 тис., що вщповщае вмюту бактерш в 1 см3 завис1 з устаткування 41 тис. i е показником незадовшьного санггарного стану устаткування.
Через 8 год. за початковоТ кшькост1 тест-культур до 1 тис./см3, що вщповщае доброму санггарному стану доТльного устаткування (до 500 КУО/см3), здатнють до формування середньоТ щшьност1 бюпл1вки виявляли у P. aeruginosa, яка була видшена з доТльного устаткування, Bei mrni бактери формували бюпл1вки низькоТ щшьность Протягом даного часу здатнють формувати середньоТ щшьност1 бюпл1вки спостер1гали у S. aureus i E. coli за
379
вм1сту ix у 1 см3 завиЫ вщповщно 5,8 тис. та 14,2 тис., що вщповщае чистой дошьного устаткування до 5 тис. та до 10 тис. КУО/см3 змиву. Через 24 год. дослщження yci MiKpoopraHi3MH, якi були видшеш з 3ÖipHoro молока та дошьного устаткування здатш формувати бioплiвки середньо! та високо! щiльнocтi.
Отже, даш дocлiджeння вказують, що навт за добро! мжробюлопчно! чистоти дошьного устаткування на ньому виявляються TaKi бактери як Pseudomonas aeruginosa, якi за 8 год. здатш утворювати 6ionniBKH середньо! щiльнocтi. При нeзaдoвiльнoмy саштарному CTaHi практично вся мiкpoфлopa, яка залишаеться на устаткуванш, через 8-24 год. утворюе бioплiвки середньо! i високо! щiльнocтi.
Таблиця
Формування мжробннх бшпл1вок на абшгенннх поверхнях за pi3Ho'i початково*! кшькост1 м1крооргашзм1в, як-i вндшенш з молока сирого та
до'шьного устаткування, M±m, n=225
Роди, види бактерш Початкова шль-шсть тест-культури в 1см3 завиа, КУО Щшьшсть утворено! бюпл1вки через певний пром1жок часу, од
4 год. 8 год. 24 год.
Micrococcus spp. 820±60 0,12±0,01 0,24±0,02 0,52±0,01
9400±520 0,21±0,03 0,24±0,01 0,82±0,02
87000±2100 0,28±0,03 0,42±0,02 1,02±0,04
S. aureus 400±24 0,11±0,01 0,17±0,01 1,05±0,06
5800±124 0,26±0,02 0,82±0,02 1,27±0,03
90000±487 0,26±0,02 0,83±0,03 1,35±0,04
E. coli 860±21 0,30±0,03 0,36±0,01 1,24±0,03
14250±348 0,21±0,01 0,51±0,2 1,65±0,02
110000±2431 0,43±0,02 0,67±0,02 1,72±0,05
Enterococcus spp. 790±34 0,23±0,01 0,18±0,01 0,79±0,02
8100±443 0,20±0,02 0,16±0,01 0,62±0,03
77000±2172 0,22±0,02 0,39±0,0 1,16±0,04
P. aeruginosa 960±33 0,22±0,01 0,51±0,02 0,65±0,02
7800±422 0,46±0,02 0,72±0,02 1,08±0,03
82000±2344 0,52±0,02 0,79±0,02 1,17±0,05
P. fluorescens 1050±130 0,23±0,01 0,29±0,01 0,72±0,02
9800±811 0,32±0,02 0,36±0,02 0,78±0,02
92000±1120 0,32±0,01 0,25±0,01 0,86±0,03
Alcaligenes spp. 940±21 0,71±0,02 0,20±0,01 0,71±0,04
11000±530 0,26±0,01 0,28±0,01 0,95±0,02
122000±4210 0,29±0,02 0,32±0,02 0,80±0,03
Flaobacterium spp. 990±50 0,18±0,01 0,21±0,01 0,52±0,02
9100±362 0,22±0,01 0,33±0,01 0,64±0,01
103000±3500 0,36±0,02 0,29±0,02 0,78±0,02
Контроль 0,04±0,01 0,05±0,02 0,09±0,02
Висновки. При вщмшнш 4HCTOTi caHiTapHoro стану дошьного устаткування i молочного швентаря згщно з ветеринарно-ппешчним нормативом до 50 КУО/см2 поверхш (або 500 КУО/см3 змиву) протягом 8 год. мжрооргашзми, якi видiлeнi з молока 36ipHoro та дошьного обладнання, формують бioплiвки низько! щiльнocтi i лише бактери Pseudomonas aeruginosa формують 6ioraißKH середньо! щiльнocтi.
380
Л1тература
1. Оксамитний М. К. Технолопя одержання високояккного молока / М. К. Оксамитний, I. П. Даниленко. - К.: Урожай, 1976. - 96 с.
2. Using enzymes to remove biofilms of bacterial isolates sampled in the food-industry / Yannick Lequette, Gauthier Boels, Martine Clarisse, Christine Faille // Biofouling. - 2010. - Vol.26, №4. - P. 421-431.
3. Understanding and modelling bacterial transfer to foods: a review / F. Pe'rez-Rodri'guez, A. Valero, E. Carrasco and other // Trends Food Sci. Technol. -2008. -P.131-144.
4. Costerton J. W. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections / J.W. Costerton, R. Veeh, M. Shirtliff // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol.112(10). - P. 1466-1477.
5. Kolter R. Microbial sciences: the superficial life of microbes / R. Kolter, EP. Greenberg // Nature. - 2006. - Vol.441. - P. 300-302.
6. Biofilms and Hygiene on Dairy Farms and the Dairy Industry: Sanitation Chemical Products and their Effectiveness on Biofilms - a Review / H. Vlkova, V. Babak, R. Seydlova and other // Czech J. Food Sci. -2008. - Vol.26, №5. - P. 309-323.
7. Anand Y.H. Mechanism of bacterial adhesion and pathogenesis of implant and tissue infections. Handbook of bacterial adhesion: principles, methods and applications / Y.H. Anand, R.S. Frieldman // Humana press; Totowa. NJ: 2000. - P. 1-27.
8. Lars D. Renner. Physicochemical regulation of biofilm formation / Lars D. Renner, Douglas B. Weibel // MRS Bull. - 2011. - Vol. 36(5). - P. 347-355.
9. ГОСТ 9225-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа. Взамен ГОСТ 9225-68. Введ. 01.01.86. - М.: Изд-во стандартов, 1984. - 25 с.
10. Определитель бактерий Берджи: девятое изд. в 2 Т. / [под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.; перевод с англ. под ред. академ. РАН Г.А. Заварзина]. - М.: Мир, 1997. - 799, [1] с.
11. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation / S. Stepanovic, D. Vurovic, I. Duric, B. Savic // J. Microbiol. Methods. - 2000. - Vol. 40. - P. 175-179.
Summary
Kuchtyn M.D., Perkiy Yu.B., N. V. Krushelnitska FORMING OF MICROBAL BIOFILMS IS ON ABIOGENIC SURFACES AT DIFFERENT INITIAL AMOUNT OF BACTERIA
Found, that when excellent clean sanitary condition of milking equipment to 500 bacterium in 1 ml flushing during the time between the use of equipment (8 h.) microorganisms are isolated from milk and milking equipment assembly, form biofilms, and only low-density Pseudomonas aeruginosa bacteria form biofilms average density.
Key words: microbal biofilms, forming, sanitary state, milking equipment.
Рецензент - к.б.н., доцент Турко 1.Б.
381
