CC BY
34
УДК 579.61
Бекпергенова А.В., Хлопко Ю.А., Иванова Е.В., Перунова Н.Б.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г Оренбург, Россия
E-mail: nsavasteeva@gmail.com
ФОРМИРОВАНИЕ АССОЦИАЦИЙ ОБЛИГАТНО-АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА
Рассмотрение инфекции как формы симбиотических отношений микроорганизмов и человека позволило обосновать представление об инфекции как модельной системе ассоциативного симбиоза. Микросимбиоценоз является одним из векторов ассоциативного симбиоза, где происходит формирование ассоциаций микроорганизмов с различными типами связей. Значительный вклад в понимание инфекционной симбиологии внесли новые методические подходы с использованием персистентного потенциала микробов в оценке микросимбиоценоза. Изучение механизмов межмикробных взаимодействий показало, что в основе формирования микросимбиоценоза лежат связи, обуславливающие характер взаимоотношений - синергидные и антагонистические.
Поскольку результаты экспериментов in vitro выявили, что под действием супернатантов происходит в разной степени как увеличение, так и снижение биологических свойств, а также наблюдается отсутствие изменения исследуемых показателей (индифферентный эффект), для установления синергидных и антагонистических связей полученный фактический материал был обработан с помощью дискриминантного анализа, который интегрировал исследуемые свойства: ростовые свойства, биопленкообразование, антилизоцимную активность. Это позволило выделить ассоциации с «синергидным» типом связи: B. bifidum/B. longum; B. longum/E. limosum; E. limosum/B. fragillis; C. perfringens/B. fragilis и «антагонистическим» - E. limosum/C. perfringens.
В естественных условиях подавляющее большинство микроорганизмов существует в виде ассоциаций, формирование которых дает определенное преимущество членам микробного сообщества при выживании в различных биотопах организма человека. Проведенные исследования позволили установить, что помимо ростовых свойств, в ассоциациях облигатно-анаэробных бактерий, происходит изменение биологических свойств (биопленкообразование, антилизоцимная активность), составляющих системообразующий фактор микросимбиоценоза, что вносит вклад в понимание механизмов формирования ассоциативного симбиоза человека и может иметь значение при создании микробных композиций новых синбиотиков.
Ключевые слова: облигатно-анаэробные бактерии, межмикробные взаимодействия, анти-лизоцимная активность, биопленкообразование, ростовые свойства, ассоциативный симбиоз.
Рассмотрение инфекции как формы симбиотических отношений микроорганизмов и человека позволило обосновать представление об инфекции как модельной системе ассоциативного симбиоза. Микросимбиоценоз является одним из векторов ассоциативного симбиоза, где происходит формирование ассоциаций микроорганизмов с различными типами связей [1]. Значительный вклад в понимание инфекционной симбиологии внесли новые методические подходы с использованием персистентного потенциала микробов в оценке микросимбиоценоза. Изучение механизмов межмикробных взаимодействий показало, что в основе формирования микро-симбиоценоза лежат связи, обуславливающие характер взаимоотношений - синергидные и антагонистические [2].
Ранее проведенные исследования взаимоотношений ассоциаций микроорганизмов кишечника проводились на моделях факультативно-анаэробных бактерий. Было установлено изменение персистентных свойств в зависимо-
сти от микроэкологического состояния кишечника человека [3]-[5].
Вместе с тем, отсутствуют работы по изменению биологических свойств облигатно-анаэробных бактерий в ассоциациях при участии их метаболитов, что и определило цель нашей работы.
Цель: определить характер взаимодействий микросимбионтов при формировании ассоциаций облигатно-анаэробных бактерий толстого кишечника человека под контролем ростовых свойств, биоплёнкообразования и антилизоцим-ной активности.
Материалы и методы
В работе по исследованию изменений биологических свойств в ассоциациях облигатно-анаэробных микроорганизмов были изучены по 6 штаммов каждого вида бактерий: Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. catenulatum, Eubacterium limosum, E. con-tortum, Bacteroides fragillis, B. ovatus, Propionibacterium acnes, P.granulosum, Clostridium ram-
nosum, C. perfringens (коллекция лаборатории биологического мониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН), ранее изолированные из микросимбиоценоза кишечника пациентов при обследовании на дисбиоз и верифицированные с помощью вре-мяпролетной масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT c программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 (Bruker Da^on^s, Гер -мания).
Для изучения изменения биологических свойств в ассоциациях облигатно-анаэробных бактерий использовали супернатанты (экзо-метаболиты) микроорганизмов. Для этого воздействующие культуры облигатно-анаэробных бактерий выращивали в питательном бульоне Schaedler (BBL, США) в анаэробном термостате (Binder, Германия) при 370С в течение 48 часов. Конечная оптическая плотность бульонных культур облигатно-анаэробных микроорганизмов в среднем составляла 0,17±0,01 OD450. Далее, полученные культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и стерилизовали фильтрованием, пропуская через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore, Франция). Полученные супернатанты облигатно-анаэробных бактерий в количестве 0,1 мл соинкубировали с чистой культурой исследуемых анаэробов, инокулированных в 2,9 мл питательного бульона. В качестве контроля использовали бульонные культуры, выращенные без добавления метаболитов облигатно-анаэробных бактерий.
На заключительном этапе определяли показатели биологических свойств: ростовые свойства (РС) по оптической плотности бульонной культуры на фотометре iEMS-MF (Labsystem, Финляндия), антилизоцимную активность (АЛА) - фотометрическим методом по О.В. Бухарину с соавт. (1999), образование биоплёнок (БПО) на поверхности 96-луночной полисте-роловой стерильного планшета по OToole G. (1999).
Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов проводили с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2003. Определяли
М - среднее арифметическое, m - среднюю ошибку среднего арифметического, при этом данные представлялись по форме М±т. Для выявления типов связей («синергидный» тип -«антагонистический» тип) между облигатно-анаэробными бактериями был применен «Дис-криминантный анализ».
Результаты и обсуждения
Полученные экспериментальные данные по изменению биологических свойств микросимбионтов показали, что в ассоциациях облигатно-анаэробных бактерий происходит изменение ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов. Поскольку результаты проведенных экспериментов in vitro выявили, что под действием супернатантов происходит в разной степени как увеличение, так и снижение биологических свойств, а также наблюдается отсутствие изменения исследуемых показателей (индифферентный эффект), для установления синергидных и антагонистических связей нами была предпринята попытка систематизировать полученный фактический материал с помощью дискриминантного анализа. Для этого полученные экспериментальные данные были объединены в интегральный показатель по все трем биологическим свойствам и представлены в виде адекватного математического выражения:
Д = х1а1 + х2а2 + хза3 + С
где Д - дискриминантная функция, характеризующая искомый вариант взаимодействий между облигатно-анаэробными микроорганизмами; х1- различие между значением ростовых свойств в опыте (под действием супернатантов облигатных бактерий) и контроле (без влияния супернатантов исследуемых анаэробов) в %; х2 - различие между значением биопленкообра-зования в опыте (под действием супернатантов облигатных бактерий) и контроле (без влияния супернатантов исследуемых анаэробов) в %; х3 -различие между значением антилизоцимной активности в опыте (под действием супернатантов облигатных бактерий) и контроле (без влияния супернатантов исследуемых анаэробов) в %; а - коэффициент показателя; С - поправочная константа.
Бекпергенова А.В. и др.
Формирование ассоциаций облигатно-анаэробных бактерий...
В таблице 1 представлены коэффициенты (а) для каждого показателя и поправочные константы.
Для установления принадлежности исследуемых штаммов по направленности действия к «синергидным» или «антагонистическим» связям, находили разницу полученных у исследуемых штаммов облигатных бактерий количественных значений по показателям в опыте (различие между значением свойства в опыте (под действием супернатантов облигатных бактерий) и контроле (без влияния супернатантов исследуемых анаэробов), переводя их в проценты и используя для расчета дискриминантной функции по приведенной формуле [7]. Расчет проводили по всем строкам соответствующей таблицы.
Наибольшая величина дискриминантной функции из всех полученных будет в 82,4% случаев соответствовать обозначенному на данной строке результату (типу) направленности взаимодействий.
К примеру, исследуемый штамм B. longum характеризовался следующими признаками: РС - 0,74 ОБ450, БПО - 0,35 ед., АЛА - 0,8 мкг/ мл*ОБ, после воздействия экзометаболитов B. bifidum, исследуемые свойства B. longum изменились: РС - 0,9 ОБ450, БПО - 0,48 ед., АЛА - 1,0 мкг/мл*ОБ. Разница между опытным и контрольными значениями в процентах составила: РС - (+21%), БПО - (+37%), АЛА -(+20%). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов показал, что:
Дс = 6,62144 • 21 + 6,36149 • 37 + 1,35796
• 20 + (-5,58339) = 395,96
Да = 5,76822 • 21 + 3,29663 • 37 + 0,56319
• 20 + (-3,39738) = 250,9
В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на первой строке (Д ), что
позволило выявить «синергидный» тип связи между исследуемыми культурами B. bifidum и
B. longum.
Другой штамм C. perfringens характеризовался следующими признаками: РС - 0,8 ОБ450, БПО - 0,38 ед., АЛА - 0,59 мкг/мл*ОБ, после воздействия экзометаболитов B. bifidum, исследуемые свойства C. perfringens изменились: РС - 0,2 ОБ450, БПО - 0,1 ед., АЛА - 0,35 мкг/ мл*ОБ. Разница между опытным и контрольными значениями в процентах составила: РС -(- 75%), БПО - (- 74%), АЛА - (-41%). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов показал, что:
Дс = 6,62144 • (-75) + 6,36149 • (-74) + 1,35796 • (-41) + (-5,58339) = -1028,48
Да = 5,76822 • (-63) + 3,29663 • (-52) + 0,56319 • (-51) + (-3,39738) = -703,08
В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на второй строке (Да), что позволило выявить «антагонистический» тип связи между исследуемыми культурами B. bifidum и
C. perfringens. Помимо распространенности типов взаимодействий, мы находили медианы и квартили значений каждой отдельной группы ассоциаций облигатно-анаэробных бактерий.
При анализе распространенности типов взаимодействий между исследуемыми штаммами облигатно-анаэробных бактерий все исследуемые группы микроорганизмов были представлены в виде графиков (рис. 1).
Как видно из рисунка, при влиянии суперна-тантов бифидобактерий на культуры B. bifidum в большинстве случаев (72±0,69%) наблюдался «синергидный» тип взаимодействий (630 [441; 720]). Такой же тип взаимодействий был характерен при действии супернатантов B. longum (в 94±0,33% случаев, 663 [542; 765]), B. adolescentis (в 82±1,02% случаев, 495 [344; 863]) и В. еагепи-1аШш (в 97±0,1% случаев, 721 [692; 750]). Реже
Таблица 1 - Коэффициенты показателей и поправочные константы для дифференциации «синергидных» и «антагонистических» связей облигатно-анаэробных бактерий
Связи Ростовые свойства БПО АЛА С
«синергидные» связи (Дс) 6,62144 6,36149 1,35796 -5,58339
«антагонистические» связи (Да) 5,76822 3,29663 0,56319 -3,39738
встречался «антагонистический» тип взаимодействий, который был выявлен не более чем в 27% случаев для штаммов B. bifidum.
Аналогичная картина наблюдалась при действии исследуемых супернатантов облигатно-анаэробных бактерий на культуры B. longum. «Синергидный» тип взаимодействий был характерен для 63±0,88% случаев (828 [625; 991]) при влиянии супернатантов B. bifidum на B. longum. Такой же тип взаимодействий наблюдался при действии супернатантов B. longum (в 91±0,41% случаев, 824 [552; 940]), B. ado-lescentis (в 72±0,69% случаев, 725 [568; 780]) и B. catenulatum (в 63±0,88% случаев, 739 [496; 750]). Напротив, «антагонистический» тип взаимодействий встречался реже и был выявлен в 37% случаев у штаммов B. longum.
При влиянии исследуемых супернатантов на культуры P. acnes был характерен «антагонистический» тип взаимодействий: в 76±1,22% случаев при влиянии экзометаболитов B. bifidum (-252 [-382; 154]), в 62±0,98% - при влиянии B. longum (-305 [-538; 269]) и в 67±1,92% - при действии супернатантов B. adolescentis (-315 [422; -151]). «Синергидный» тип наблюдался при взаимодействии супернатантов B. catenulatum и культур пропионибактерий в 97±0,1% случаев (519 [432; 606]).
При действии экзометаболитов B. bifidum, B. longum, B. adolescentis и B. catenulatum на культуры E. limosum «синергидный» тип взаимодействий наблюдался не более чем в 67% случаев. При влиянии супернатантов бифидо-
бактерий на культуры эубактерий в большинстве случаев (60±0,69%) наблюдался «синергидный» тип взаимодействий (630 [441; 720]). Такой же тип взаимодействий был характерен при действии супернатантов B. longum (в 67±0,33% случаев, 663 [542; 765]), B. adoles-centis (в 60±1,02% случаев, 495 [344;863]) и B. catenulatum (в 60±0,1% случаев, 721 [692;750]). Реже встречался «антагонистический» тип взаимодействий, который был выявлен не более чем у 40% штаммов эубактерий.
Напротив, для культур B. fragiШs и C. per-fringens чаще были характерны «антагонистические» взаимодействия с исследуемыми культурами бифидобактерий. При действии метаболитов B. catenulatum на бактероидов (-105 [238; 29] и клостридий (-112 [242; 19]) в 97±0,1% случаев наблюдался «антагонистический» тип. Напротив, «синергидный» тип взаимодействий был выявлен не более чем у 46±2,0% бактероидов и 47±1,67 клостридий % в зависимости от вида бифидобактерий.
При влиянии супернатантов клостридий на культуры B. bifidum в 73±1,57% (670 [468; 882] и B. longum в 97±0,1 % (236 [174; 421] наблюдался «синергидный» тип взаимодействий (рис. 2). Такой же тип был характерен при влиянии исследуемого экзометаболита на бактероидов (в 82±0,9 % случаев, 834 [618; 1016] и клостридий (в 87±0,93 % случаев, 877 [720; 1018].
«Синергидный» тип взаимодействий наблюдался при действии супернатантов бактероидов на B. bifidum (в 97±0,1% случаев, 385
Рисунок 1 - Распространенность типов взаимодействий между облигатно-анаэробными микроорганизмами под влиянием супернатантов В. Ы/Ыыш, В. ¡ощыш, В. айо1езсепйз и В. саЬепиШиш
Бекпергенова А.В. и др.
Формирование ассоциаций облигатно-анаэробных бактерий..
[384; 406]), B. longum (в 97±0,1% случаев, 596 [588; 603]), E. limosum (в 80±1,4% случаев, 612 [599; 671]), B. fragillis (в 80±2,0% случаев, 516 [493; 534]) и C. perfringens (в 60±2,83% случаев, 503 [471; 599]). «Антагонистический» тип был характерен для культур пропионибактерий в 97±0,1% случаев (-429 [-451; -333]).
Аналогичная картина наблюдалась при действии исследуемых супернатантов E. limosum на культуры B. bifidum в 60±2,83% случаев (600 [578; 741]), B. longum в 67±3,32% случаев (635 [611; 660]), P. acnes в 97±0,1% случаев (746 [718; 769]), E. limosum в 97±0,1% случаев (391 [338; 473] и B. fragillis в 60±2,83% случаев (873 [633; 977]). «Антагонистический» тип взаимодействий был характерен для 67±3,32 % случаев (-415 [-436; -395]) при влиянии супернатантов эубактерий на C. perfringens.
Заключение
В естественных условиях подавляющее большинство микроорганизмов существуют в виде ассоциаций, формирование которых дает определенное преимущество членам микробного сообщества при выживании в различных биотопах организма человека. Не стихающий интерес к изучению механизмов формирования микробных сообществ, особенно облигатно-анаэробных бактерий, также обусловлен их прикладным значением, поскольку данные микроорганизмы часто являются объектом биотехнологических производств и широко используются в составе пробиотических препаратов.
Ранее в работах по исследованию механизмов межмикробных взаимоотношений между различными видами облигатно-анаэробных бактерий было показано изменение ростовых характеристик бактерий. Так, Bartosch S. с соавторами [9] и Rey F.E. с соавторами [10] установили, что сокультивирование штаммов бифидобактерий (B. bifidum и B. ¡actis) приводило к увеличению их роста. В нашей работе, при исследовании ростовых свойств, вкупе с показателями адаптации бактерий (антилизо-цимная активность и биопленкообразование), также были показаны синергидные взаимодействия между различными видами бифидобактерий (B. bifidum/B. longum). В другой работе Bacteroides thetaiotaomicron стимулировал рост Bacteroides hydrogenotrophica. Кроме того, в ассоциации облигатно-анаэробных бактерий происходит обмен генетическим материалом как это было показано на примере Bacteroides spp. и Clostridium spp. [8]. Формирование синергидных связей при совместной утилизации питательных субстратов было исследовано на моделях B. ¡ongum/B. thetaiotaomicron; Bacteroides spp J Clostridium spp.; B. adolescentis/Roseburia spp. и B. adolescentis/E. rectale [11], [12], [13], что также подтверждает полученные нами результаты взаимодействия при влиянии метаболитов облигатно-анаэробных бактерий на их биологические свойства (C. perfringens/ B. fragilis; B. longum/E. limosum; E. limosum/B. fragillis).
Проведенные исследования позволили установить, что помимо ростовых свойств, в
Рисунок 2 - Распространенность типов взаимодействий между облигатно-анаэробными микроорганизмами под действием супернатантов C. perfringens, B. fragillis, E. limosum и P. acnes
ассоциациях облигатно-анаэробных бактерий, происходит изменение биологических свойств (биопленкообразование, антилизоцимная активность), составляющих системообразующий фактор микросимбиоценоза, что вносит вклад
в понимание механизмов формирования ассоциативного симбиоза человека и может иметь значение при создании микробных композиций новых синбиотиков.
02.10.2017
Исследование выполнено при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (проект конкурса «УМНИК») и инновационных научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ аспирантов (соглашение № 24)
Список литературы:
1. Симбиоз и его роль в инфекции / О.В. Бухарин, Е.С. Лобакова, Н.Б. Перунова [и др.]. - Уральский центр академического обслуживания Екатеринбург, 2011. - 300 с.
2. Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова. - Екатеринбург, 2014. - 257 с.
3. Перунова, Н.Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника человека / Н.Б. Перунова. - Автореф. дис. ... канд. мед. наук.- Оренбург, 2003. - 25 с.
4. Елагина Н.Н. Факторы персистенции неспорообразующей анаэробной микрофлоры кишечника человека. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2000. - 24 с.
5. Иванова, Е.В. Биологические свойства бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека / Е.В. Иванова. - Дис. ... канд. мед. наук. - Оренбург, 2010. - 128 с.
6. O'Toob, G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A. O'Toob, H.B. Kaplan, R. Kolter // Ann Rev Microbiol. - 1999. -No. 54. - P. 49-79.
7. Алгоритмы: построение и анализ. Introduction to Algorithms / Т. Кормен, Ч. Лейзерсон, Р. Ривест [и др.]. - М.: Вильямс, 2005. -1296 с.
8. Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon / N.B. Shoemaker, H. Vlamakis, K. Hayes [et al] // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - No. 67. - P. 561-568.
9. Microbiological effects of consuming a synbiotic containing Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, and oligofructose in elderly persons, determined by real-time polymerase chain reaction and counting of viable bacteria / S. Bartosch, E.J. Woodmansey, Paterson [et al] // Clin Infect Dis. - 2005. - No 70 (6). - Р. 28-37.
10. Dissecting the in vivo metabolic potential of two human gut acetogens / F.E. Rey, J.J. Faith, J. Bain [et al] // The Journal of biological chemistry. 2010. - No 285 (29) - Р. 22082-22090.
11. Амерханова, А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности / А.М. Амерханова. - Дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2009. - 260 с.
12. Шестаков, С.В. Метагеномика микробиома человека / С.В. Шестаков // Успехи современной биологии. - 2010. - Т. 30. - № 6. - С. 531-543.
13. Small intestinal bacterial overgrowth syndrome / J.G. Banwell, L.A. Kistler, R.A. Giannella [et al] // Gastroenterology. - 1981. - No. 80. - P. 834-845.
Сведения об авторах:
Бекпергенова Анастасия Владимировна, научный сотрудник, аспирант Института клеточного и
внутриклеточного симбиоза УрО РАН
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: 775417; e-mail: nsavasteeva@gmail.com
Хлопко Юрий Александрович, ведущий научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; д.т.н., 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: 775417; e-mail: otbiosistem@mail.ru
Иванова Елена Валерьевна, доцент, ведущий научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; к.м.н.
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: 775417; e-mail: walerewna13@gmail.com
Перунова Наталья Борисовна, заведующий лабораторией Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; д.м.н.
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: 775417; e-mail: perunovanb@gmail.com
