CC BY
78
УДК 579.22
Сидорова О.И., Иванова Е.В., Перунова Н.Б.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения
Росскийской академии наук E-mail: [email protected]
АНТИЛИЗОЦИМНАЯ АКТИВНОСТЬ И БИОПЛЁНКООБРАЗОВАНИЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПРИ СТРЕССОРНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
Изучено влияние стрессовых факторов различной природы на Bifidobacterium bifidum под контролем биологических свойств (антилизоцимная активность и биопленкообразование). Стрессорное воздествие приводило к преимущественному снижению биопленкообразования и увеличению антилизоцимной активности B. bifidum.
Ключевые слова: Bifidobacterium bifidum, антилизоцимная активность, биоплёнкообразова-ние, дефицит источников питания, температурный стресс.
Введение
Важнейшими представителями облигатно-анаэробной микрофлоры кишечника, выполняющими роль доминантной микробиоты при ассоциативном симбиозе человека являются бифи-добактерии [1]. Не снижающийся интерес к данной группе микроорганизмов обусловлен способностью бифидофлоры к обеспечению ряда важных функций в организме хозяина: колонизационной резистентности, детоксикации продуктов метаболизма, продукции витаминов и др. [2].
Интеграция бифидобактерий с организмом человека и их важная «хелперная» функция, обуславливает актуальность не только фундаментальных исследований, но и развития прикладного аспекта использования данных микроорганизмов в области биотехнологии и медицины. В настоящее время микроорганизмы рода Bifidobacterium широко используются для производства пробиотиков и различных продуктов функционального питания [2,3].
Очевидно, что в биотехнологическом производстве пробиотических продуктов бифидобакте-рии находятся под воздействием неблагоприятных физико-химических факторов среды [4], что, в свою очередь, обуславливает необходимость исследовать стрессовые условия в технологическом процессе создания препаратов-пробиотиков.
Известно, что адаптивный ответ бифидо-бактерий на тепловое воздействие реализуется за счёт увеличения белков теплового шока, транскрипции генов SOS-системы, изменения процесса деления клеток микроорганизмов [5]. Не менее важным является изучение ответной реакции на стрессовое воздействие дефицита источников питания, запрограммированное в жизненном цикле клеток бактерий, что приводит к возникновению покоящихся форм микро-
организмов (цистоподобных покоящихся клеток) [6]. Рядом исследователей отмечается взаимосвязь между транскрипцией генов SOS -системы и устойчивостью к стрессовым условиям у бифидобактерий [5,7,8]. В тоже время данные об изменении биологических свойств бифидобактерий под воздействием стрессовых факторов мало изучены, в связи с чем, целью работы явилось изучение антилизоцимной активности и биопленкообразования бифидобактерий под температурным воздействием и при дефиците источников питания.
Материалы и методы
Для исследования были отобраны 14 штаммов Bifidobacterium bifidum, изолированные из кишечника условно здоровых пациентов. Возраст обследуемых лиц варьировал от 18 до 60 лет. Выделение облигатно-анаэробных бактерий проводили в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» [9]. Идентификация бактерий осуществлялась с помощью времяпролетной масс-спектромет-рии MALDI TOF MS серии Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) по прямому белковому профилированию.
Температурное воздействие изучали по методике, описанной Rezzonico E. et al. [10] на 14 штаммах Bifidobacterium bifidum. Исследования влияния дефицита источников питания проводили на 5 штаммах Bifidobacterium bifidum по методике Голод Н.А. с соавт. [6]. Для создания условий исчерпания источников питания была использована среда со сниженным в пять раз содержанием глюкозы, а так же голодная среда без глюкозы.
Способность к образованию биоплёнок (БПО) оценивали по методике G. O'Tool, где мик-
Сидорова О.И. и др.
Антилизоцимная активность и биоплёнкообразование...
роорганизмы образовывали биопленки на поверхности 96-луночного полистиролового стерильного планшета [11], антилизоцимную активность (АЛА) бифидобактерий определяли по методике, описанной Бухариным О.В. с соавт. [12].
Полученные данные были статистически обработаны непараметрическими методами вариационной статистики с применением критерия Манна-Уитни с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Биостат».
Результаты
Исследования in vitro показали, что при воздействии высокой температуры и стресса дефицита источников питания происходило изменение биологических свойств бифидобактерий.
При температурном стрессе было заметно преимущественное (в 65±11,7% случаев) (рис. 1) снижение биоплёнкообразования бифидобактерий (р<0,05) с 10,6±3,8 ед. (в контроле) до 6,4±1,01 ед. (в опытной пробе) (рис. 2). У 14±9,3% исследуемых штаммов B.bifidum отмечается увеличение способности к образованию биопленок до 12,9±2,5 ед.
Аналогичное действие оказывал стресс дефицита источников питания, где было отмечено снижение биоплёнкообразования у B. bifidum в 60±15,5% случаев, где при сниженнии содержания глюкозы в питательной среде значения БПО уменьшились от 3,8±1,1 ед. до 1,9±0,1 ед. При ис-
ключении из питательной среды источников углерода значение БПО снижалось до 1,3±0,09 ед. Однако, у 20±8,3% штаммов бифидобактерий было зафиксировано увеличение БПО при исчерпании источников углерода, и при тех же условиях способность к образованию биоплёнок не изменялась в 20±8,3% случаев.
При оценке влияния стрессовых факторов на антилизоцимную активность бифидобакте-рий наблюдалась противоположная картина. Выявлено, что воздействие высокой температуры приводило к увеличению данного свойства у 43±13,1% (р<0,05) (рис. 1) исследуемых штаммов бифидобактерий с 0,35±0,07 мкг/мл*ОП до 0,92±0,1 мкг/мл*ОП (рис. 3). Так же при данных условиях отмечалось ингибирование анти-лизоцимной активности бифидобактерий в 7±4,3% случаях, а в 50±13% случаев температура не оказывала влияния на АЛА В. Ыйёиш.
Сходные данные были получены при изучении антилизоцимной активности бифидобак-терий в условиях дефицита источников питания. Отмечалось увеличение АЛА в 60±15,5% случаев с 0,37±0,07 мкг/мл*ОП до 0,56±0,09 мкг/мл*ОП при культивировании бифидобактерий в среде со сниженным в 5 раз содержанием глюкозы, что в 1,5 раза больше значения данного свойства в контрольной серии, а у 40±15,5% штаммов бифидобактерий было выявлено снижение АЛА до 0,14±0,09 мкг/мл*ОП. При переносе бифидобактерий в питательную среду без
* - р< 0,05
Рисунок 1. Пенетрантность антилизоцимной активности и биоплёнкообразования Bifidobacterium bifidum
при стрессорном воздействии
Естественные науки
1,6
К
О
*
1,2
0,8
^ 0,4
глюкозы происходило увеличение антилизоцимного признака у всех исследуемых штаммов, где значения АЛА увеличивались почти в 4 раза (до 1,47±0,3 мкг/мл*ОП) по сравнению с показателем данного свойства при культивировании в сбалансированной питательной среде.
Заключение
Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что ответная реакция бифидобактерий на температурное воздействие, а также на дефицит источников питания может сопровождаться снижением био-пленкообразования и увеличением антилизоцимного признака В. Ыйёиш. Выбранные биологические свойства, в последнее время, широко применяются в экспериментальных и клинических работах [13,14], и определены в качестве «биомишени» межмикробных взаимоотношений в ассоциациях. Эффективность применения АЛА доказана при исследовании механизмов действия лекарственных препаратов [12].
Очевидно, что стрессорные воздействия, влияющие на клетки микроорганизмов приводят к изменению их физиологического состояния. Контроль над этими процессами, которые выражаются в изменении интенсивности клеточной пролиферации и клеточной дифференцировки осуществляют внеклеточные мембранотропные метаболиты - алкилоксибензолы (АОБ). Известно, что данная группа соединений влияет на структурную организацию мембран и клеточных биополимеров, изменяя их функциональную активность [14]. Можно предположить, что полученные в работе данные по увеличению антилизо-цимной активности при воздействии стрессовых факторов на бифидобактерии связано с тем, что АОБ, являясь химическими шаперонами, способны оказывать выраженное ингибирую-щее действие на активность лизоцима [15].
Отмеченное в данной работе снижение способности образовывать биопленки бифи-
* - р< 0,05
Рисунок 2. Выраженность биоплёнокообразования Bifidobacterium bifidum при стрессорном воздействии
I контроль
□ опыт
воздействие температурой
сниженное в 5 раз содержание гтгнжочът
голодная питательная среда
* - р< 0,05
Рисунок 3. Выраженность антилизоцимной активности Bifidobacterium bifidum при стрессорном воздействии
добактериями при влиянии различных стрессоров, вероятно, происходит из-за ингибиро-вания адгезии бактерий к полистироловой поверхности. К аналогичным выводам пришли в работе по изучению влияния неоптимальных значений рН среды в качестве стрессового фактора на модели Staphylococcus epidermidis [16].
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что АЛА и БПО бактерий могут являться маркером стрессового ответа (наряду с классическими показателями адаптивного ответа микробной клетки [17]) Bifidobacterium bifidum, что позволяет оценивать эффективность стрессового воздействия и вносит вклад в изучение адаптационных механизмов бактерий к условиям окружающей среды.
6.10.2014
Сидорова О.И. и др.
Антилизоцимная активность и биоплёнкообразование..
Список литературы:
1. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б., Усвяцов Б.Я., Черкасов С.В. Симбиоз и его роль в инфекции. - Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 300 с.
2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. - М.: Грантъ, 2001. - 316 с.
3. Бондаренко В.М. Поликомпонентные пробиотики: механизм действия и терапевтический эффект при дисбиозах кишечника // Фарматека. - 2005. - № 115. - С. 46-54.
4. Пат. 2272837 Российская Федерация МПК C 12 N 1/20, A 61 K 35/74, A 23 C 9/12 Способ получения сухой лиофили-зированной биомассы лакто - и бифидобактерий / Несчисляев В.А., Молохова Е.И., Демешева М.И.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации - № 2004105687/13; заявл. 25.02.2004; обупл. 27.03.2006, Бюл. №9. - С. 1-5.
5. Schmidt G., Zink R. Basic features of the stress response in three species of bifidobacteria: B. longum, B. adolescentis and B. breve. // International Journal of Food Microbiology. - 2000. - № 55. - Р. 41-45.
6. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Воробьева Л.И., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - № 3. - Р. 317-335.
7. Ruiz L., Rus-Madiedo P., Gueimonde M. How do bifidobacteria counteract environmental challenges? Mechanisms involved and physiological consequences. // Genes Nutr. - 2011. - № 6. - Р. 307-318.
8. Ventura M., Margolles A., Turroni F.Eds E. Tsakalidou.. Stress responses of bifidobacteria. // Stress Responses of Lactic Acid Bacteria. Springer US, 2011 - Р. 323-347.
9. Jouseimies-Somer H., Summanen P., Citron D. Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual. // Washington: Start Now Pr., 2002. - 287 pp.
10. Rezzonico E., Lariani S., Barretto C. Global transcriptome analysis of the heat shock response of Bifidobacterium longum // FEMS Microbiol. Lett. - 2007. - № 271. - Р. 136-145.
11. O'Toole G., Kaplan H., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Annu. Rev. Microbiol. - 2000. - № 54. -Р. 49-79.
12. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999. - 88 с.
13. Николаев Ю.А., Плакунов В.И. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - № 2. - С.149-163.
14. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. - М.: Медицина, 2005. - 367 с.
15. Петровский А.С., Дерябин Д.Г., Лойко Н.Г. Регуляция алкилоксибензолами функциональной активности лизоцима.// Микробиология. - 2009. - Т. 78. - № 2. - С. 176-185.
16. Коробов В.П., Лемкина Л.М, Монахов В.И. Анализ чувствительности процессов формирования биопленок Staphylococcus epidermidis 33 к некоторым факторам внешней среды. // Вестник пермского университета. - 2010. - Т. 1. - № 1. - С. 59-63.
17. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - № 4. - С. 387-397.
Сведения об авторах:
Сидорова Оксана Игоревна, аспирант Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, е-шаИ: [email protected]
Иванова Елена Валерьевна, ведущий научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук,
е-шаП: [email protected]
Перунова Наталья Борисовна, заведующая лабораторией Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, доктор медицинских наук,
е-mail: [email protected]
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11
