CC BY
111
НАШ САЙТ В ИНТЕРНЕТЕ: WWW.OG-CHEMISTRY.RU
НОБЕЛЕВСКИЕ ЛАУРЕАТЫ
£ •о-
Нобелевская премия
по химии - 2014
Флуоресценция: по ту сторону
барьера
Церемония вручения Нобелевских премий, учрежденных Альфредом Нобелем, и Нобелевской премии мира проходит каждый год в день смерти А. Нобеля в Стокгольме (Швеция) и Осло (Норвегия). 10 декабря 1901 г. состоялась первая церемония вручения Нобелевских премий. Сам же Нобелевский комитет, выплачивающий премии, был создан в 1900 г.
Нобелевская премия 2014 г. по химии из числа научных, строго говоря, присуждена не за химию, а за технологию - флуоресцентную микроскопию, которая позволила изучать живые клетки и процессы внутри них в реальном времени. Она присуждена руководителю химического факультета Стэнфордского университета Уильяму Мёрнеру (William E. Moerner), заведующиму лабораторией в исследовательском кампусе Медицинского института Говарда Хьюза в штате Вирджиния Эрику Бетцигу (Eric Betzig) и уроженцу Румынии Штефану Хеллью (Stefan Hell), директору Института биофизической химии Общества Макса Планка в Гёттингене и заведующиму отделением в Немецком центре по изучению рака (DKFZ) в Гейдельберге.
Флуоресцентные микроскопы - это следующее поколение микроскопов после оптических (где увеличение осуществляется с помощью конструкции из линз) и электронных (где используется световой поток пучка электронов и специальные магнитные линзы).
Здесь применяется метод получения увеличенного изображения с исполь-
зованием люминесценции возбужденных атомов и молекул образца.
Сначала было доказано, что теоретический лимит микроскопа составляет половину длины волны видимого света, это несколько сотен нанометров. Давайте возьмем человеческий волос. Его толщина - несколько микрон, и его можно изучать традиционными микроскопами. Но в химии и биохимии объекты гораздо меньше. Стандартная бактерия - 100 нанометров, она попадает под вышеозвучен-ный лимит. Если изучить бактерии с помощью светового микроскопа, то их сложно разобрать. Лауреаты заложили основание спектроскопии. У электронных микроскопов возможности гораздо выше, можно рассмотреть структуры до атома. Но они не позволяют изучить живые клетки или процессы внутри живых клеток. Работы, которые провели лауреаты, дали возможность изучить молекулярные процессы в реальном времени. С помощью этих работ можно изучить динамические процессы, читать ДНК, изучать протеины.
Это открытие, в частности, помогло понять, как протеины соответствуют различным недугам, таким как болезнь Альцгеймера или болезнь Пар-кинсона.
Нобелевская премия по химии - высшая награда за научные достижения в области химии. Первый лауреат этой премии - Якоб Хендрик Вант-Гофф, голландский химик, получивший премию «в знак признания огромной важ-
ности открытия законов химической динамики и осмотического давления в растворах». Премия по химии с самого начала присуждалась в различных областях этой науки, от теоретической химии до биохимии. Тем не менее по количественным показателям лидирует органическая химия.
Согласно завещанию Альфреда Нобеля, премию по химии должен получить тот, «кто сделает наиболее важное открытие или усовершенствование» в этой области
Единственным советским и российским ученым, отмеченным этой наградой, остается академик Николай Семенов, один из основоположников химической физики, создатель теории теплового взрыва газовых смесей. Премии он был удостоен (совместно с английским химиком Сирилом Хин-шелвудом) в 1956 г. за обоснование общей количественной теории цепных реакций.
Всего же с 1901 г. химикам было вручено 100 Нобелевских премий: 62 раза премию вручали одному лауреату, в 22 случаях ее разделили между двумя учеными, в 16 случаях - между тремя. Таким образом, за более чем столетие высокой чести удостоились 153 человека (английский биохимик Фредерик Сенгер был наргажден дважды: в 1958-м и 1980 гг.). К настоящему моменту самым молодым нобелевским лауреатом в области химии является француз Фредерик Жолио, который был награжден вместе со своей женой Марией Жолио-Кюри
1икроскоп Левенгука, доведенный дс субдифракционногс разрешения. На фоне: принцип STED-микрсскспии из материалов пресс-релиза Нобелевского комитета
в 1935 г., когда ему было всего 35 лет. Самым старым лауреатом остается Джон Фен, удостоившийся награды в возрасте 85 лет. Кстати, из 153 человек, получивших Нобелевскую премию по химии, лишь три женщины. Ирена Жолио-Кюри, ее мать Мария Склодовская-Кюри (премия 1911 г.) и британская исследовательница Дороти Кроуфут Ходжкин (премия 1964 г.) являются тремя женщинами - нобелевскими лауреатами в области химии. Кроме того, Мария Склодовская-Кюри получила премию за достижения в области физики в 1903 г.
В истории этой награды есть годы, когда Нобелевский комитет Королевской шведской академии наук не назвал по разным причинам ни одного лауреата. Так, премия не вручалась в 1916, 1917, 1919, 1924, 1933 гг, а также с 1940 по 1942 г. включительно.
Изобретение микроскопа в позднем Средневековье открыло человечеству
целый мир, находившийся испокон веков буквально под носом, - например клеточное строение всех живых организмов и существование бактерий. Однако волновая природа света диктует ограничение на разрешающую способность оптических микроскопов: оно принципиально не может быть лучше 0,2 мкм. В 2014 г. Нобелевскую премию по химии вручили за разработку методов сверхразрешающей микроскопии, позволивших с использованием ряда ухищрений преодолеть дифракционный барьер.
Антони ван Левенгук, благодаря предложенным им новшествам в шлифовке линз микроскопов, сделал массу революционных для XVII века открытий: он впервые увидел бактерии, эритроциты, сперматозоиды, дрожжи, простейших, коловраток и т.д. Так техническое на первый взгляд усовершенствование одним рывком перебросило естественные науки из Средневековья в Новое время. Однако если увеличение микроскопов довольно быстро было доведено до 2000, с разрешением обнаружились проблемы: в 1873 г. Эрнст Аббе установил, что волновая природа света «повинна» в том, что мы принципиально не сможем различить два объекта (или увидеть объект более мелкий), чем половина длины света, то есть около 0,2 мкм (1 мкм, или 1 микрон, равен 10-6 м). Это значение было названо дифракционным пределом. Фактически это значит, что с помощью светового микроскопа нельзя изучить тонкое строение клеточных органелл и вообще мелкие детали устройства клетки. Впрочем, есть еще электрон-
ный микроскоп, обладающий существенно более высоким разрешением, но он требует фиксации и специальной обработки клеток, а значит, исключает прижизненное наблюдение.
Нобелевская премия по химии в 2014 г. вручена за разработку сверхразрешающей микроскопии и за преодоление, казалось бы, нерушимого дифракционного барьера. Развитие сверхразрешающих методик шло по нескольким параллельным направлениям, поэтому и «нобелевка» разделена на три равные части: немцу Штефану Хеллю и американцам Эрику Бетцигу и Уильяму Мернеру.
Сканирующая нановспышка. Штефан Хелль с самой аспирантуры, оконченной в 1990 г. в Гейдельберге (Германия), мечтал обойти дифракционный барьер. Однако более маститые ученые воспринимали эту идею с отчетливым недоверием, и Хелль уехал работать в университет Турку (Финляндия) в лабораторию, занимавшуюся флуоресцентной микроскопией. Вспышка света, указавшая дорогу к заветной мечте, сверкнула в голове исследователя, когда тот, утомленно перелистывая талмуд под названием «Квантовая оптика», наткнулся на словосочетание «вынужденное излучение» (stimulated emission). Это стало ключом к новой методике, за которую Хелль и удостоился Нобелевской премии - микроскопии, основанной на эффекте вынужденного гашения флуоресценции (STED - stimulated emission depletion). В «традиционной» флуоресцентной микроскопии исследователь наблюдает распределение в клетке флуоресцентно-меченных ве-
Дифракционный предел. В конце XIX века Эрнст Аббе определил минимальное расстояние между объектами, на котором их еще можно различить в световой микроскоп: это половина длин волны света, или около 0,2 мкм. На практике это означает, что без ухищрений мы никогда невооруженным глазом не увидим детальные подробности строения клеток, а вирусы и молекулы - и подавно
Дифракционный предел Аббе (0.2 мкм)
муравей I волос клетка 9 (9 i бактерия митохондрия I Г вирус I белок I малая молекула 1
1 мм 100 мкм 10 мкм 1 мкм 100 нм 10 нм 1 нм
НАШ САЙТ В ИНТЕРНЕТЕ: WWW.OG-CHEMISTRY.RU
НОБЕЛЕВСКИЕ ЛАУРЕАТЫ
£
STED-микроскопия. Отличие этой методики от «обычной» флуоресцентной микроскопии заключается в использовании двух лазерных лучей: возбуждающего флуоресценцию и концентрического гасящего, что приводит к сокращению эффективного размера флуоресцирующей области до нанометровых (субдифракционных) величин. Последовательное сканирование образца позволяет провести точную реконструкцию, по разрешению существенно превосходящую то, что можно непосредственно увидеть невооруженным глазом
ществ (например, антител), свечение которых индуцируется лазерным лучом определенной длины волны. В STED-микроскопии техника усложнена за счет второго лазерного луча, вызывающего вынужденное гашение флуоресценции образца (да, есть и такой эффект). Причем происходит это не по всему образцу сразу, а только в небольшой его области около десятков нанометров, как бы выхватывая ее из тьмы. Особенность этой системы в том, что гасящий импульс кольцом охватывает возбуждающий, заставляя флуоресцировать фрагмент образца, находящийся уже в субдифракционном диапазоне. А это и есть сверхразрешение.
Основы своего метода Хелль опубликовал в 1994 г.
Нельзя сказать, чтобы статья сразу «выстрелила», но нужные люди ее заметили, и Хелля пригласили работать в Институт биофизической химии им. Макса Планка в Гёттингене (Германия), где он довел методику до ума и в 2000 г. представил публике рабочую версию, позволившую получить изображения живых клеток с разрешением, в 3-6 раз превосходящим пресловутый дифракционный барьер.
Лауреаты Нобелевской премии
по химии в 2014 г.
За создание флуоресцентной микроскопии высокого разрешения
Штефан Хелль Эрик Бетциг Уильям Мёрнер
Одномолекулярная микроскопия. Высокое разрешение достигается за счет регистрации положения части флуоресцентных меток, после чего, повторив измерение много
раз, можно восстановить полную картину и достичь высокого (субдифракционного) разрешения
Микроскопия на одиночных молекулах. В отличие от STED-микроскопии концепция, разрабатывавшаяся двумя другими лауреатами премии 2014 г. - Эриком Бетцигом и Уильямом Мернером основана на регистрации флуоресцентного сигнала от одиночных молекул с последующим совмещением в единое изображение. Вообще говоря, это серьезное достижение - увидеть отдельную молекулу, ведь в стандартных физико-химических методах (спектроскопия, флуоресценция и т.д.) ученые получают усредненный сигнал от миллиардов молекул. Тем весомее результат Уильяма Мернера, который еще в 1989 г. впервые добился этого. В 1997 г. Мернер перешел на работу в Университет Калифорнии в Сан-Диего (США), где будущий нобелевский лауреат Роджер Тсин работал с флуоресцентными белками (ФБ), пытаясь расширить их спектр от исходного зеленого до полной радуги. Мернер присоединился к исследованиям и обнаружил, что флуоресценция некоторых из этих белков является фотоуправляемой: при освещении ФБ светом определенной длины волны флуоресценция «выключалась», а после использования исходного света - восстанавливалась. «Раста-
щив» молекулы ФБ в геле, чтобы они гарантированно располагались там по одному (с расстоянием между молекулами больше 0,2 мкм), он продемонстрировал регистрацию и управление одиночными молекулами, что стало весьма впечатляющим достижением [8]. Эта технология стала тем, чего так не хватало Эрику Бетцигу.
Одержимость дифракционным барьером. Бетциг в начале 1990-х работал в исследовательском центре Bell Labs в Нью-Джерси (США), занимаясь микроскопией ближнего поля, которая, с одной стороны, дает разрешение лучшее, чем обычная оптическая микроскопия, а с другой -накладывает слишком строгие ограничения на образец и вообще обладает массой недостатков. Несмотря на то, что поэзия зрелых исканий тогда уже требовала от Бетцига смены обстановки исследовательской лаборатории на что-нибудь более динамичное, он, как и другие персонажи этой истории, был буквально одержим идеей преодоления дифракционного барьера. И вот, перед тем как в 1995 г. все-таки бросить исследования на долгие годы, Бетциг публикует свои соображения об одновременном использовании флуоресцентных меток нескольких цветов и совмеще-
нии получающихся изображений для увеличения разрешения метода. Прошло 10 лет. Карьера в бизнесе так и не принесла Бетцигу успокоения и не освободила его от мыслей о дифракционном барьере. И вот наконец он наткнулся на идею флуоресцентных белков, которые могут пометить любые клеточные компоненты, а также управляться светом. Ключевой идеей, которой ему не хватило за десятилетие до того, стало то, что не нужны метки разных цветов. Нужны просто метки, активирующиеся в разные моменты времени!
Всего через год была опубликована работа, ставшая завершающей в этом нобелевском цикле. Новый принцип, названный PALM-микроскопией (Photoactivated localization microscopy), был использован для получения детальной картины мембраны лизосомы, меченной флуоресцентным белком. Принцип состоит в том, чтобы вследствие использования слабого возбуждающего импульса лишь часть молекул ФБ активировалась и начинала светиться, причем чтобы статистически эти молекулы оказывались на расстоянии, большем дифракционного предела. Регистрируемая при этом картина состоит из редких светящихся точек, но зато про каждую известно, что это отдельная молекула, что многократно повышает разрешение. Спустя какое-то время свечение проходит, и новый импульс активирует уже другой набор молекул ФБ. Накопление и совмещение достаточно большого количества таких кадров позволяет провести очень качественную реконструкцию, эффективное разрешение которой существенно превышает ограничение, наложенное дифракционным пределом.
На службе биологии. Все трое ученых продолжают активно заниматься исследованиями. Штефан Хелль устремил взор внутрь нервных клеток, чтобы понять детальное устройство синапсов. Уильям Мернер занимается аномальными белками болезни Хантингтона. Эрик Бетциг следит за делением клеток в развивающихся эмбрионах. Созданные лауреатами методики, по праву получившие название «наноскопия», продолжают активно использоваться учеными в лабораториях всего мира. НГХ
Обзор подготовила Т.И. Шкерина, ООО «ОБРАКАДЕМНАУКА» по материалам пресс-релиза.Нобелевского комитета.
И http://www.biomolecula.ru/content/1463.
