CC BY
104
УДК 581.1.085.017.3:631.589.3
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ВИНОГРАДА К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ
Е. Н. ОЛЕШУК, Т. Г. ЯНЧЕВСКАЯ А. Н. ГРИЦ
НИИ экспериментальной ботаники им. В. Ф. Купревича НАНБеларуси, г. Минск, Беларусь, 220072, e-mail: t_yanch@mail.ru
(Поступила в редакцию 03.01.2017)
Работа выполнена по гранту № Б14СРБ-006 БРФФИ (Беларусь-Сербия) от 14.05.2014 «Исследование стрессо-устойчивости интродуцируемых в Беларуси сортов винограда к неблагоприятным абиотическим факторам среды по состоянию Red/Ox-системы растений»
Культура винограда отличается широкой биологической пластичностью, вследствие чего он может расти и плодоносить в самых различных природно-климатических условиях. В статье проанализированы проблемы реализации устойчивости и адаптивности интродуцируемых сортов винограда к стресс-образующим абиотическим факторам. Установлено, что нарушение гомеостаза и Red/Ox-статуса клетки связано с накоплением малонового диальдегида (МДА) и активацией ферментов антиоксидантной защиты (пероксидазы и СОД) в листьях растений. Дана оценка процесса накопления продуктов перекисного окисления липидов и выявлено активное участие Red/Oх-ферментов в детоксикации продуктов ПОЛ. Установлено, что активность Red/Ox-ферментов обусловлена сортоспецифичностью винограда. У стресс-устойчивых сортов выявлено значительное повышение активности ферментов антиоксидантной системы, способствующих нормализации клеточного гомеостаза. Наибольшую стрессоустойчивость при абиотическом стрессе различной природы и интенсивности показали сорта винограда северо-американской селекции (АН), которые реагировали на неблагоприятные стресс-факторы абиотической природы увеличением активности Red/Ox-ферментов.
Ключевые слова: виноград, стрессоустойчивость, адаптация, биологическая пластичность, окислительный стресс, активные формы кислорода (АФК), red/ox- ферменты, молоновый диальдегид (мда), перекисное окисление липидов (ПОЛ).
Grapes are characterized by a broad biological plasticity, so that this crop can grow and bear fruit in a variety of climatic conditions. The article analyzes the problems of realization of stability and adaptability of introduced varieties of grapes to stress-forming abiotic factors. We have established that disturbance of homeostasis and Red / Ox-status of the cell is associated with accumulation of malonic dialdehyde (MDA) and activation of antioxidant defense enzymes (peroxidase and SOD) in plant leaves. We have estimated the process of accumulation of lipid peroxidation products and established the active participation of Red / Ox-enzymes in detoxification of LPO products. We have established that the activity of Red / Ox-enzymes is caused by the variety-specificity of grapes. Stress-resistant varieties showed a significant increase in the activity of antioxidant system enzymes that promote the normalization of cellular homeostasis. The highest stress tolerance for abiotic stress of different nature and intensity was shown by grape varieties of North American breeding (AN), which reacted to unfavorable stress factors of abiotic nature by increasing the activity of Red / Ox enzymes.
Key words: grapes, stress resistance, adaptation, biological plasticity, oxidative stress, active forms of oxygen (ROS), red / ox-enzymes, malonic dialdehyde (MDA), lipid peroxidation (LPO).
Введение
Основным фактором повышения продуктивности виноградных насаждений был и остается сортимент, который постоянно совершенствуется путем отбора лучших сортов и клонов [1, 2, 3]. Ввиду того, что отмечаются значительные сортовые отличия в реализации потенциальной устойчивости растений винограда по отношению к биотическим и абиотическим факторам в разных климатических регионах [1, 4, 5-7], успешное развитие виноградарства должно основываться на научно обоснованном подборе наиболее стрессоустойчивых сортов из всего многообразия мировой ампелографической коллекции.
К основным абиотическим факторам, существенно влияющим на виноград, относятся температура, уровень инсоляции, наличие влаги. Считается, что нижним критерием целесообразности промышленной культуры винограда является сумма активных температур (САТ) выше 10 °C не менее 2500 °C. Тепловые ресурсы и влагообеспеченность Беларуси вполне достаточны для возделывания винограда ранних сортов [2-4, 5-8].
Известно, что сорта различных эколого-географических групп отличаются по уровню адаптивности к новым условиям интродукции и по-разному реагируют на изменение условий произрастания. Так, сорта винограда рода V. vinifera проявляют повышенные требования к теплообеспеченности и свету, а сорта на основе V. amurensis, наоборот, способны выдерживать понижение температуры до -40 °С и плодоносят в затенении дальневосточной тайги [1, 2, 8]. С другой стороны, действие высоких температур более +3540 °С приводит к повреждению клеточных мембран у всех сортов культурного винограда. Высокая температура тормозит процессы фотосинтеза и дыхания растений, уменьшается активность фитогормонов [9-11, 16, 18], происходит накопление ингибиторов (АБК), что приводит к торможению роста и развития. Для группы стрессоустойчивых сортов характерна высокая эффективность работы антиоксидантной системы, у них активно синтезируются стрессовые белки [7, 9-11, 12-14]. В условиях стресса в клетках формируется уникальный стрессовый набор изоферментов пероксидазы, СОД.
В связи с этим задача настоящего исследования заключалась в исследовании физиологических ответов и выявлении закономерностей в изменении антиоксидантного статуса растений винограда под действием абиотического стресса для отбора сортов с генетически высоким уровнем стрессоустойчи-вости.
Основная часть
Исходный посадочный материал, оздоровленный in vitro, получен из коллекции НИВиВ «Мага-рач», Ялта. Представлен сортами винограда (Vitis) раннего срока созревания различной генетической природы и происхождения (Бианка, Красень, Маркетт, Маршал Фош, Пино Нуар, Подарок Магара-ча, Регент, Фронтиньяк) из различных эколого-географических регионов и селекционных центров мирового виноградарства (Западная Европа, Крым, Серная Америка, Юг России).
В условиях биотехнического комплекса (БТК) создавались условия, имитирующие различные проявления стрессобразующих факторов абиотической природы: пониженная и повышенная температура; недостаток освещенности; недостаточное (водный дефицит) или избыточное увлажнение.
Низкотемпературный стресс создавали путем помещения растений винограда в холодильную камеру (при +3 °С) без их предварительной закалки на 1 сут. Недостаток освещенности создавали путем притенения саженцев винограда. Водный стресс различной природы моделировался прекращением полива в течение 3^5 сут. и фиксировался по снижению тургора в листьях; б) избыточное увлажнение (и связанное с ним нарушение корневого дыхания) создавалось путем затопления корневой системы растений водой в течение 3 сут. Стресс-состояние растений винограда определялось по накоплению продуктов ПОЛ в листовой пластинке по содержанию МДА, используя стандартную методику [21]. Изменение активности RedOX ферментов (СОД и пероксидазы) определялось методом Хайрулина [11] с использованием 96-луночных планшетов для иммуноферментного анализа на АИФ-М/340 в полиакриламидном геле SE-250. Полученные электрофореграммы сканировали, после чего обрабатывали с помощью специальных компьютерных программ Total/Lab 3.2.
Для исследований использовали контрастные по устойчивые сорта винограда различных эколого-географических групп, в частности, сложные межвидовые гибриды европейского винограда V. vinifera, морозостойкие американские гибриды (ЛИ), другие перспективные сорта и гибриды винограда, саженцы которых получены путем клонального микроразмножения и адаптированы in vivo на ионообменном субстрате многоразового использования Триона® [22]. Краткое описание сортов представлено в табл. 1.
Таблица 1. Описание сортов винограда, являющихся объектами исследований
Наименование сорта и схема гибридизации Вид или сортогруппа винограда Сила роста Устойчивость к основным болезням, балл Морозостойкость, °С Селекционный центр, страна
Бианка (Bianka) (Виллар блан x Шасла бувье) Межвидовой гибрид V. ут/ега выше средней 2 (высокая) -27 Венгрия
Красень, (Антей Магарачский х Сверхранний бессемянный М.) Межвидовой гибрид V. ут/ега средняя 2-3 (средняя) -25 НИВиВ «Магарач» АР Крым
Маршал Фош (Marechal Foch), (Рипариа х Рупестрис 101-14) х Гольдрислинг Межвидовой гибрид, FAH высокая 2 (высокая) -29 Франция
Маркетт (Marquette), MN 1094 х Ravat 262 Сложный межвидовой гибрид, АН очень высокая 2 (высокая) -32 Университет шт. Миннесота, США
Пино нуар, (клон Pinot Noir) (контроль) Виноград европейский V. ут/ега низкая 4 (низкая) -21 НИВиВ «Магарач» АР Крым
Подарок Магарача, (Ркацители х Магарач 2-57-72) Межвидовой гибрид V. ут/ега средняя 2 (высокая) -28 НИВиВ «Магарач» АР Крым
Регент (Regent), Диана х Шамбурсен Межвидовой гибрид V. ут/ега средняя 2 (высокая) -27 Германия
Фронтиньяк (Frontenac), MN 89 х Ландо 451 Сложный межвидовой гибрид, АН очень высокая 1 (очень высокая) -35 Универ-т шт. Миннесота, США
Экспериментальная работа проводилась в несколько этапов. Первый этап исследований - адаптация микро-саженцев винограда, полученных путем микроклонирования, к условиям in vivo. Адаптация саженцев исследуемых сортов винограда в условиях БТК сопровождалась морфо-биометрическими наблюдениями. Активизация ростовых процессов in vivo у саженцев прослеживалась визуально и обычно сопровождалась пробуждением точки роста, началом образования листьев и удлинением междоузлий (табл. 2).
Наименование сорта Активность ризогенеза Возобновление Количество Развитие Высота растений на Устойчивость к
развития, сут. междоузлии шт. листьев, шт. 30 сут, см патогенам, балл
Бианка высокая 7-12 4-5 5-6 24-28 8
Красень высокая 8-12 4-5 5-6 23-25 6
Маршал Фош относит. высокая 7-9 4-5 5-6 22-25 8
Маркетт высокая 5-7 5-6 7-8 29-35 9
Пино нуар низкая 12-18 2-3 3-4 15-17 4
Подарок Магарача средняя 8-11 3-4 4-5 23-26 7
Регент средняя 8-12 4-5 5-6 23-25 6
Фронтиньяк высокая, 11-16 3-4 4-5 21-27 9
Как следует из табл. 2, возобновление роста и развития у саженцев винограда имеет значительные сортовые различия. Наиболее быстро адаптация in vivo происходит у сорта Маркетт, достаточно динамично у межвидовых гибридов Бианка и Маршал Фош. Для сравнения: у европейского сорта Пино нуар, который относится к виду V. vinifera, процессы адаптации сильно замедлены. Наблюдается значительное отставание в процессах ризогенеза, возобновлении роста и развития. Кроме того, еще на раннем этапе наблюдалась значительная гибель саженцев винограда низко-адаптивного сорта Пино нуар, хотя его отличают высокие вкусовые и технические качества.
После завершения процесса адаптации и возобновления роста переходили ко второму этапу исследований: саженцы винограда были введены в состояние абиотического стресса путем затопления корневой системы растений водой (в течение 3 сут.), что приводило к ухудшению корневого дыхания. Нарушение гомеостаза и Red/Ox-статуса клетки при культивировании растений в стресс-моделируемых условиях опытов фиксировалось путем учета накопления продуктов ПОЛ (малонового диальдегида - МДА) и активации ферментов антиоксидантной защиты. Относительный уровень накопления продуктов перекисного окисления липидов показан на диаграмме (рис.).
1,2
11
ч
0,8 0,6 0,4 0,2 0
варианты
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. Относительный уровень накопления продуктов перекисного окисления липидов Сорта: 1 - Пино Нуар, 2 - Красень, 3 - Маркетт, 4 - Бианка, 5 - Маршал Фош, 6 - Регент, 7 - Фронтиньяк, 8 - Подарок Магарача
Исходя из данных накопления МДА, самую высокую стрессоустойчивость к повреждающему действию абиотических факторов показал с. Маркетт, у которого отмечен наименьший относительный уровень накопления МДА, характеризующий уровень перекисного окисления липидов, изменяющийся в ответ на окислительный взрыв, возникающий на действие стресса. Относительно невысокое значение накопления продуктов ПОЛ имели сорта Маршал Фош и Бианка. Самую низкую стрессоустойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам показал европейский сорт Пино Нуар на основе V. vinifera, имеющий наиболее высокий уровень накопления МДА.
Поскольку в основе механизма устойчивости растений к стрессу лежат генетически обусловленные процессы изменения экспрессии генов и, как следствие, изменения многих метаболических реакций на молекулярном, клеточном уровнях и уровне целого организма, влияние сортовых различий является значимым.
Для оценки стрессоустойчивости растений при адаптации и выращивании in vivo апробирован экспресс-анализ активности Red/Ox-ферментов (изоферментов пероксидаз и СОД) в листьях растений, подвергнутых абиотическому стрессу, экспрессия которых отражает стрессовое состояние изучаемых фитообъектов. Активация пероксидазы и СОД при неблагоприятных воздействиях является ответом на увеличение продукции радикалов супероксида, что обеспечивает защиту клеток и тканей растений от окислительных повреждений. Устойчивые растения имеют более эффективную систему защиты, что обеспечивает возможность функционирования в условиях стресса. По сравнению с вос-
приимчивыми, они характеризуются более высокими активностями Яе^Ох-ферментов (изофермен-тов пероксидаз и СОД) и менее выраженными окислительными повреждениями.
В наших опытах выявлено участие фермента СОД в детоксикации продуктов ПОЛ и последствий оксидативного стресса, поскольку СОД и пероксидаза относятся к группе антиоксидантных ферментов, играющих важнейшую роль в защите растительных клеток от окислительного стресса. Компьютерная обработка электрофореграммы приведена в табл. 3.
Таблица 3. Активность изоферментов пероксидазы у сорта Маркетт при различных видах стресса,
компьютерная обработка электрофореграммы
Трек 1 Трек 2 Трек 3 Трек 4 Трек 5 Трек 6 Трек 7 Т зек 8
ЯГ ЯГ ЯГ ЯГ ЯГ ЯГ ЯГ ЯГ
1 0,090 1 0,021 1 0,093 1 0,086 1 0,079 1 0,086 1 0,094 1 0,034
2 0,214 2 0,169 2 0,193 2 0,400 2 0,297 2 0,331 2 0,100 2 0,079
3 0,359 3 0,210 3 0,393 3 0,472 3 0,383 3 0,4 3 0,386 3 0,328
4 0,445 4 0,431 4 0,652 4 0,493 4 0,590 4 0,541 4 0,486 4 0,593
5 0,559 5 0,469 5 0,697 5 0,593 5 0,734 5 0,662 5 0,524 5 0,693
6 0,645 6 0,731 6 0,717 6 0,714 6 0,800 6 0,783 6 0,769 6 0,834
7 0,721 7 0,859 7 0,952 7 0,924 7 0,848 7 0,848 7 0,828
1 0,09 1 0,021 8 0,89 8 0,869
9 0,907
Примечание: Обозначение треков: 1,4,7 - контрольные варианты без воздействий; 2, 3 - холодовой стресс; 5, 6 -температурный стресс; 8 - водный стресс.
Анализируя данные компьютерной обработки электрофореграммы, можно видеть появление новых изоформ пероксидаз с К£=0,89 и К^=0,907 на треках 5 и 6, что свидетельствует о защитной реакции. У сорта Маркетт температурный стресс (треки 5 и 6) усиливает активность пероксидазы и отвечает образованием новых форм. Таким образом, стресс-защитные реакции у сорта Маркетт, представляющего группу североамериканских сортов, выражены сильнее.
Исследования показали, что влияние стрессора вызывает быстрое увеличение скорости ПОЛ (до 60 минут воздействия) с одновременным повышением активности систем, способствующих нормализации клеточного гомеостаза, в частности, ферментов антиоксидантной системы. Активность ферментов пероксидазы реализуется через менее подвижные изоформы. С другой стороны, высокая активность пероксидазы не может однозначно интерпретироваться как признак устойчивого сорта. Различие в содержании подвижных изоферментов отражает, возможно, их сортовую специфичность или особую реакцию растений различных сортов к неблагоприятным условиям выращивания и ответ на абиотический стресс. Согласно электрофоретическим данным, вне зависимости от типа стрессового воздействия активируются типичные изоферменты СОД у всех исследованных сортов, но их активность различна, что обусловлено сортовой специфичностью. СОД обладает высокой каталитической скоростью реакции, лимитированной только частотой столкновения супероксида с ферментом [19].
При абиотическом стрессе активность СОД в листьях винограда претерпевает изменения. Так, у сорта Маркетт при низкотемпературном стрессе сокращается число изоформ СОД, при этом значительно активируясь по сравнению с контролем (трек 5). В относительных цифрах: контроль ЯГ=0,130 (трек 4),- низкотемпературный стресс - ЯГ=0,046.
Возобновление роста и развития растений винограда, испытывающих состояние сильного абиотического стресса, находится в зависимости от вида повреждающего стресс-фактора. Так, наибольшую чувствительность проявили растения винограда к высокотемпературному стрессу. При этом европейские сорта (Красень) претерпели значительные нарушения гомеостаза и повреждения фотосинтези-рующего аппарата, вследствие чего у них наблюдалась значительная задержка роста и развития (более 10 суток). Сорта американской группы (Маркетт), хоть и имели признаки незначительного угнетения (снижение тургора в листьях, угнетение процесса фотосинтеза), возобновили развитие на 5-7 сутки, в дальнейшем они активно развивались из пазушных почек.
В результате проведенных исследований выявлены значительные сортовые отличия по способности растений винограда противостоять оксидативному повреждающему действию стрессобразующих факторов.
Наибольшую пластичность и адаптивность при абиотическом стрессе проявили сорта винограда североамериканской селекции Маркетт и Фронтиньяк, которые отреагировали на стресс-факторы водного дефицита, пониженных температур и недостаточной освещенности значительным повышением активности Red/Ox-ферментов - пероксидазы и СОД. У сортов европейской селекции (Бианка, Красень) отмечается менее выраженная способность к адаптации после стресса. При активизации накопления продуктов ПОЛ у них не выявлено существенных изменений в динамике нарастания активности ферментов Яе^Ох-системы. У сортов Маркетт и Бианка наблюдалось высокое содержание менее подвиж-
ных форм СОД (верхняя и средняя часть треков), а у менее устойчивых (Красень) - превалировали подвижные формы СОД. Снижение активности СОД (Красень) может быть вызвано с физиологическим состоянием растений - затуханием активности с возрастом и накоплением различных ингибиторов.
Различие в содержании подвижных (Красень) и менее подвижных (Маркетт, Бианка) форм СОД отражает, возможно, их сортовую специфичность, или может характеризовать особую реакцию растений различных сортов к абиотическому стрессу. Совокупность полученных результатов позволяет заключить, что различные по генетическому происхождению сорта винограда по-разному реагируют на стрессовые воздействия, активируя антиоксидантные ферментативные системы, участвующие в поддержании гомеостаза клеток растений при неблагоприятных воздействиях.
Нами обнаружено, что сорта американской группы (-4Л) имеют изначально высокую активность СОД (контрольные растения с. Маркетт и Маршал Фот), что может отражать их неприхотливость к условиям выращивания и высокую морозоустойчивость, в то время как у неустойчивых европейских сортов винограда (V Vinifera) активность фермента изначально значительно меньше.
Полученные данные по физиолого-биохимической оценке активности ферментов Red/Ox-системы свидетельствуют, что сорта европейской селекции (на основе V. vinifera) отличаются меньшей стрес-соустойчивостью к повреждающему действию стресс-факторов абиотической природы и обладают меньшей адаптивностью по сравнению сортами американской группы (АН).
Сопоставление основных генетических, биологических особенностей и биохимических характеристик перспективных сортов с оценкой конкретных экологических факторов и выявление на этой основе степени их соответствия позволяют сделать выводы и дать прогнозы о развитии интродуцируе-мого сорта в новых условиях произрастания, более обоснованно ответить на вопрос о принципиальной возможности и целесообразности интродукции сорта в тот или иной регион.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трошин, Л. П. Ампелография и селекция винограда / Л. П. Трошин. - Краснодар, 1999. - 138 с.
2. Лойко, Р. В. Северный виноград / Р. В. Лойко. - М.: Изд. Дом МСП, 2003. - 256 с.
3. Соболев, С. Ю. Выращивание винограда в Беларуси / С. Ю. Соболев. - Минск: «Сэр-Вит», 2010. - 54 с.
4. Опыт решения проблем интродукции и технологии промышленного выращивания винограда в условиях Беларуси / Т.Г. Янчевская [и др.]. - Минск: Право и экономика, 2012. - 16 с.
5.Разработка и реализация национальной программы совершенствования сортимента винограда в Украине / А. М. Авид-зба [и др.] [Электронный ресурс] - 2009. - Режим доступа: http://vinograd.info/pyblikacii/stati/razrabotka-i-realizaciya-nacionalnoi-programmy-sovershenstvovaniya-sortimenta-vinograda-v-ykraine.html. - Дата доступа. -
6.Губин, Е. Н. Изменчивость и наследование признака раннеспелости винограда по комбинациям скрещивания / Е. Н. Губин // Виноделие и виноградарство. - 2009 - № 2 - С. 42-43.
7. Ускоренное размножение ценных генотипов винограда / П. Я. Голодрига [и др.] // Садоводство. - 1982. - №3. - С. 24-27.
8. Смирнов, К. В. Виноградарство, учебник для вузов / К. В. Смирнов. - 1987. - 217 с.
9.Шакирова, Ф. М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция / Ф. М. Шаки-рова. - Уфа. Гилем. - 2001. - C. 35-39.
10. Удовенко, Г. В. Физиология устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды / Г. В. Удовенко. - Л., 1981. - С. 148.
11. Поликсенова, В. Д. Индуцированная резистентность растений к патогенам и абиотическим стрессовым факторам / В. Д. Поликсенова // Вестник БГУ. - 2009. - №1. - С. 48-60.
12. Тарчевский, И. А. Сигнальные системы клеток растений / И. А. Тарчевский. - М.: Наука, 2002. - 294 с.
13. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К. Г. Рем ; пер. с нем. Л.В. Козлова [и др.] ; под ред. П.Д. Решето-ва, Т. И. Соркиной. - М. - 2000. - 469 с.
14. Влияние биотических и абиотических факторов на продуктивность виноградных растений с различным генетическим потенциалом / М. И. Панкин [и др.] // Обеспечение устойчивого производства виноградовинодельческой отрасли на основе современных достижений науки: материалы Междунар. дистанционной науч.-практ. конф.: АЗОСВиВ. - Анапа, 2010. - С. 158-164.
15. Аверьяно в, А. А. Активные формы кислорода и иммунитет растений / А. А. Аверьянов // Успехи современной биологии. - 1991. - Т.3, вып.5. - С. 722-735.
16. Савич, И. М. Пероксидазы - стрессовые белки растений / И. М. Савич // Успехи современной биологии. - 1999. -№3. - С. 406-416.
17. Минибаева, Ф. В. Продукция супероксида и активность внеклеточной перокисдазы в растительных тканях при стрессе Ф. В. Минибаева, Л. Х. Гордон // Физиология растений. - 2003. - Т.50, №3. - С. 459-464.
18. Карташева, Е. Р. Полифункциональность растительных пероксидаз и их практическое использование / Е. Р. Кар-ташева, Г. Н. Руденская, Е. В. Юрина // С-х. биология . - 2000. - Т.11. - С. 722-737.
19. Бараненко, В. В. Супероксиддиссмутаза в клетках растений / В. В. Бараненко // Цитология. - 2006. - Т. 48,
№6.
20. M. Sagi, R.Fluhr. Production of reactive oxygen species by plant NADH oxidases. // Plant Physiology. - 2006. -V.141. - Р. 336-340.
21. Владимиров, Ю. А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков. — М.: Наука, 1972. - 252 с.
22. Янчевская, Т. Г. Оптимизация минерального питания растений / Т. Г. Янчевская. - Минск, 2014. - 458 с.
