CC BY
47ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВИ ПРОДУКЦИИАПК
УДК 581.1.036:634.8
Метаболические изменения у сортов винограда с различной устойчивостью при заражении милдью
М. А. СУНДЫРЕВА, канд с.-х наук; Я. В. УШАКОВА, канд. биол. наук; М. В. АНТОНЕНКО, канд. техн. наук Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия, г. Краснодар
Производство винограда — одна из наиболее капиталоемких отраслей сельского хозяйства, что определяет необходимость в использовании ресурсосберегающих технологий возделывания. Одним из путей интенсификации производства служит использование агротехнологий, основанных на анализе и применении биологических свойств генотипов растений, таких как их естественная резистентность.
Значительный ущерб отрасли виноградарства наносят болезни, вызываемые грибными фитопато-генами. Для культуры винограда среди возделываемых сортов, относящихся к виду Vitis vinifera L. либо к его межвидовым гибридам, отсутствуют иммунные генотипы устойчивые к распространенным грибным болезням этой культуры [1—3]. В таких условиях получение высококачественного урожая невозможно без применения большого количества разнообразных химикатов и других агротехнических средств. Это влечет за собой повышение цены на продукцию виноградопроизводящих предприятий РФ в сравнении с продукцией из Чили, Турции и других стран — экспортеров винограда.
При взаимодействии растений со специализированными паразитами, обладающими способностью преодолевать механизмы пассивного иммунитета, срабатывают механизмы активного иммунитета [4—8] и др. Большое значение при формировании стрессового ответа имеет скорость и локализация реакции в растительном организме [9].
Изучение устойчивых и не устойчивых генотипов и выявление сущности преобладающих физиологических закономерностей формирования резистентности растений к стрессорам на модели воздействия био-трофных патогенов (Plasmopara viticola), поражение которыми приводит к экономически значимому повреждению виноградных растений, является одним из важных звеньев разработки интенсивных систем виноградарства, которые призваны укрепить на рынке винограда и вина российских производителей.
Задача исследования — выявление метаболических и временных закономерностей и особенностей иммунного ответа растений винограда с различной степенью восприимчивости к грибным патогенам при проявлении защитных реакций.
Объекты исследования: растения двух сортов винограда: Восторг и Мускат белый, контрастные по устойчивости к милдью, зараженные возбудителем милдью
Plasmopara viticola Berl. et Toni и свободные от него. Сорт Восторг является сложным межвидовым гибридом V. vinifera L. и V. amurensis Rupr., сорт Мускат белый относится к эколого-географической группе восточных сортов винограда V. vinifera L. [10]. Пора-жаемость сорта Восторг милдью (Plasmopara viticola Berl. et Toni) составляет 1 балл, а сорта Мускат белый — 4 балла [11].
Для эксперимента использовали полученные in vitro растения сортов винограда Мускат белый и Восторг, не плодоносящие, первого года посадки. Растения по одному выращивались в 32-литровых горшках, содержащих субстрат из 1/3 песка, 1/3 дерновой земли и 1/3 обогащенного торфа. Растения выращивались при 16-часовом световом дне, дневная температура оставляла +24 °С, ночная температура +19 °С. Полив производился через каждые два дня дистиллированной водой. Эксперимент начинали при достижении растениями 16-недельного возраста и 20 полностью сформированных листьях. Для заражения опытных растений использовали споры Plasmopara viticola Berl. et Toni. Для подготовки инокулюма собирали пораженные листья с выраженным спороношением Plasmopara viticola Berl. et Toni с растений винограда гибридной формы ТАНА 33 на опытном участке ФГБНУ СКЗНИИСиВ, расположенном в г. Краснодаре. Спорангии смывали дистиллированной водой, и через 30 мин, когда наблюдался активный выход подвижных зооспор, подготавливали суспензию, содержащую приблизительно 10 000 спор в 1 мл, и опрыскивали ею листья опытных растений с абаксиальной стороны. Через 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч отбирали 4-8 листьев от верхушки растения и сразу же замораживали в жидком азоте. Затем листья растирали в жидком азоте, и полученную пудру хранили при -80 °С до проведения анализов.
Методы исследования. Оценку уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) проводили по изменению оптической плотности раствора при реакции малонового диальдегида (МДА) с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [12]. Анализ фенолкарбоновых кислот (рутин, сиреневая, салициловая, n-кумаровая, кофейная, галловая, 3,4-дигидробензойная) проводили на приборе Капель 105 (Люмэкс, Россия), хлорогеновой и аскорбиновой кислот, ресвератрола, катионов и аминокислот проводили на приборе Капель 104 РТ (Люмэкс, Россия). Расчет концентрации метаболитов производился с помощью программного обеспечения Люмэкс
[13]. Белок для определения активности антиоксидан-тных ферментов и проведения нативного электрофореза белков в ПААГ экстрагировали из растертых в жидком азоте тканей листа винограда. В качестве экстракционного использовали буфер, описанный F. J. Perez (2005) [14]. Определение активности перок-сидазы проводили по методу А. Н. Бояркина по скорости реакции окисления бензидина до образования продукта окисления синего цвета. Активность фермента рассчитывали на 1 мг белка. Визуализация изо-форм антиоксидантных ферментов проводили по ранее отработанных нами методикам [14]. Для разделения белков использовали стандартную процедуру электрофореза в нативном полиакриламидном геле (ПААГ). Анализ изоферментных спектров пероксида-зы проводили согласно ранее отработанным нами методикам [14—16]. Статистическую обработку данных проводили с использованием корреляционного анализа. В эксперименте использовались пять растений в качестве биологических повторностей и три аналитических повторности на каждое растение.
Результаты и обсуждение. У чувствительного сорта Мускат белый спороношение на нижней стороне листа и характерные для милдью маслянистые пятна появлялись через 72 ч после инокуляции. У устойчивого сорта Восторг признаков заболевания не было на протяжении всего времени эксперимента.
Для выявления показателей, характеризующих отличия зараженных и контрольных растений, рассчитывали коэффициент корреляции. Низкий коэффициент корреляции показывал, что связи между вариантами нет, следовательно, отличия максимальны.
вк/вз мк/мз вз/мз
Рис. 1. Коэффициенты корреляции биохимических показателей у винограда: ВК — Восторг контроль; МК — Мускат белый контроль; ВЗ — Восторг зараженный; МЗ — Мускат белый зараженный
Совпадение низких коэффициентов корреляции у контрольных и зараженных растений каждого сорта и аналогично коэффициентов корреляции между зараженными растениями устойчивого сорта Восторг и восприимчивого сорта Мускат белый, позволило выделить преобладающие физиологические особенности формирования резистентности растений к воздействию биотического стрессора. Таким образом, среди первичных метаболитов были выделены: содержание глицина, лейцина, метионина, серина. Вторичные метаболиты, характеризующие иммунный ответ разных по устойчивости сортов винограда, следующие: содержание дигидробензойной, кофейной, кумаровой, сиреневой кислот. Активность пероксидазы также показала видимые отличия между генотипами. Содержание хлорогеновой кислоты отличалось у зараражен-ных растений двух сортов (рис. 1).
Образование малонового диальдегида (МДА) служит одним из показателей развития окислительного стресса и показывает степень повреждающего действия стрессора. У обоих изучаемых сортов наблюдался спад уровня МДА относительно контрольных растений через 48 ч после заражения, с последующим выраженным повышением через 72 ч у сорта Восторг и 96 ч у сорта Мускат белый. Зараженные растения сорта Восторг в целом характеризовались более низкими значениями МДА в листьях, чем растения сорта Мускат белый (рис. 2).
К другим метаболитам, характеризующим развитие стресса у винограда можно отнести изменение содержания кальция, и антиоксидантов пролина и аскорбиновой кислоты. Содержание кальция в листьях чувствительного сорта Мускат белый было выше, чем в листьях сорта Восторг. Антиоксидантные метаболиты аскорбиновая кислота и пролин содержались в листьях обоих сортов в примерно равном количестве. Но у Муската белого через 120 ч после заражения происходило резкое увеличение содержания пролина, что может быть связано с возрастающим стрессовым воздействием (данные не приведены).
Активность пероксидазы значительно изменялась в течение эксперимента. У обоих сортов через 12 ч после заражения отмечался спад активности этого фермента, с последующим повышением. У чувствительного к милдью сорта Мускат белый через 96 ч после заражения происходил второй спад активности
гй
о
X о
се ^
о 5
О а.
0,07 0,06 -0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 -0
0
4
8
12 24 48 72 96 120 144 Время, ч
— Восторг контроль — Восторг зараженный Рис. 2. Содержание МДА в листьях винограда
гй
о
X о
се ^
о 5
О а
0,15 -,
0,1 -
0,05 -
0
0
4
8
12 24 48 72 96 120 144 Время, ч
— Мускат белый контроль — Мускат белый зараженный
о я § ®
<
5 -
4 -
3 -
2 -
1 -
4 ----------------------------------------------------------------------------------------
3 -
0 4 8 12 24 48 72 96 120 144 Время, ч
Восторг контроль Восторг зараженный Рис. 3. Активность пероксидазы в листьях винограда
кт
<
2 -
1 -
0 4 8 12 24 48 72 96 120 144 Время, ч
Мускат белый контроль Мускат белый зараженный
(в £ жен
рб ео
И о. & И
о Е
4~\
о л
0 4 8 12 24 48 72 96 120144 Время, ч
20 -|
Ф.-0- о ° §
0
2-,
I Л £
■»•т' \ /
-I-
т х \ /
Т, ?, Т, тСт,
Я* 5 о,
О*:?
0 4 8 12 24 48 72 96 120144 Время, ч
б
Рис.
— Восторг зараженный — Мускат белый зараженный 4. Содержание фенольных соединений в листьях винограда
,У
0 4 8 12 24 48 72 96 120144 Время, ч
0
0
0
0
в
пероксидазы, что сопровождалось увеличением содержания МДА в листьях (рис. 3). Установлено, что у устойчивого сорта Восторг через 72 ч после инокуляции спорами милдью изменялся изоферментный спектр пероксидазы: снижалась активность изоформ массой 58 и 48 кДа. Синтезировалась дополнительная изоформа массой 45 кДа. У сорта Мускат белый изменений нет.
Что касается вторичного метаболизма, то наибольшие отличия между сортами проявлялись в содержании кумаровой, дигидробензойной, кофейной и хло-рогеновой кислот, являющихся промежуточными элементами шикиматного пути биосинтеза фенольных соединений. В целом в листьях устойчивого сорта Восторг содержалось меньше фенольных соединений, чем в листьях сорта Мукат белый. Наибольшие отличия наблюдались в динамике дигидробензойной кислоты. У сорта Восторг повышение ее содержания отмечалось через 24 и 96 ч после заражения (рис. 4, а). Сорт Мускат белый характеризовался увеличением содержания кумаровой кислоты через 12 и 96 ч после заражения (рис. 4, в). Содержание кофейной кислоты, являющейся ключевым предшественником лигнина клеточной стенки, у этого сорта возрастало в течение всего анализируемого периода (рис. 4, б).
В динамике первичных метаболитов наибольшие отличия отмечались в содержании глицина, тирозина, метионина, серина (см. рис. 1). Содержание глицина, входящего в состав структурных белков, укрепляющих клеточную стенку, возрастало у неустойчивого сорта Мускат белый через 48 ч после заражения, тогда как у устойчивого сорта это происходило только через 120 ч (рис. 5, а). Содержание тирозина — одного из начальных звеньев фенилпропаноидного пути — возрастало
у обоих сортов через 8 ч после заражения. Второе увеличение содержания тирозина в листьях сорта Восторг отмечалось через 72 ч, а у сорта Мускат белый — 48—96 ч после заражения (рис. 5, г). Метионин, как предшественник этилена, — важное звено сигнальных каскадов. У сорта Восторг содержание метионина возрастало через 8 ч после заражения, а у сорта Мускат белый только через 120 ч (рис. 5, в). Интересно, что и по содержанию серина, участвующего в передаче стрессового сигнала, выделяются два пика у сорта Восторг раньше, чем у сорта Мускат белый (рис. 5, б).
Содержание ресвератрола в листьях винограда возрастало через 72 ч после инокуляции у обоих исследуемых сортов. Два сорта статистически не отличались межу собой по содержанию этого метаболита с 72 до 144 ч после инокуляции.
Ответ растений начинается уже с первых часов внедрения патогена и продолжается в течение всего периода взаимодействия хозяина и паразита, интенсивность и направленность процессов отличается у устойчивых и чувствительных генотипов. Устойчивость винограда в милдью включает комплекс не полностью ясных механизмов защиты [17]. Известно, что на начальных этапах ответа растений на биотический стресс необходимо поддержание высокого уровня окисления, чему способствует накопление активных форм кислорода (АФК), которые могут приводить к необратимому повреждению клеточных структур. При воздействии биотических стрессов строго необходимым является скоординированная работа «окисляющей» и антиоксидантной систем. Постепенное увеличение содержания МДА у винограда за период эксперимента может быть вызвано дефолиацией растений, которая является стрессом для растений [18]. Такое
N « рн
а * з ^
о ^ о с
60
40
о. ^ ен
5 ° о ^ О *
0 4 8 12 24 48 72 96 120 144 Время, ч а
0 4 8 12 24 48 72 96 120 144 Время, ч в
15—1
10-
ржа,
ен
о
о
0 4 8 12 24 48 72 96 Время, ч б
120 144
5-1
жа рн
0 4 8 12 24 48 72 96 Время, ч г
120 144
— Восторг зараженный — Мускат белый зараженный Рис. 5. Содержание аминокислот в листьях винограда
5
0
0
0
0
воздействие в равной степени происходит на зараженные и контрольные растения. В точке «72 часа после заражения» (см. рис. 2) у зараженных растений происходило повышение содержания МДА в листьях относительно контрольных растений. Это может быть связано с особенностями развития патогена, так как именно в этот период происходит внедрение патогена в мезофилл листа и его активное развитие. Согласно данным V. А^шо-УШауегёе с соавторами, через 72 ч после инокуляции у чувствительного сорта патоген свободно распространялся по мезофиллу листа, а у устойчивого — после внедрения патогена в подустьич-ную полость происходили нарушения формирования структур гриба [19].
Активными элементами антиоксидантных систем является метаболизация аскорбиновой кислоты и дифференциальная активность различных классов пероксидаз, супероксиддисмутаз и других ферментов
[20]. Среди элементов антиоксидантной системы винограда следует выделить активность пероксидаз, так как содержание аскорбата в листьях контрольных и опытных растений у обоих изучаемых сортов было сходным. Активность пероксидазы и появление различных изоформ этого фермента может свидетельствовать о наибольшем его значении в координации уровня окисленности и, соответственно, значимых реакций на воздействие со стороны патогена (см. рис. 4). Подтверждением тому может быть понижение содержание малонового диальдегида у обоих изучаемых сортов через 48 ч после инокуляции, которое согласуется с увеличением пероксидазной активности в этот период, но не с изменением содержания аскор-бата (см. рис. 2, 3). Многими авторами подтверждается ключевая роль пероксидазы в качестве фермента, окисляющего нетоксичные формы фенольных соединений и стильбенов в микотоксичные производные
[21]. КоЛекатр А. е1. а1 показано, что стильбен-син-таза индуцируется до 4 ч после инокуляции, а для
активации гидростильбен окисляющей пероксидазы требуется накопление активных форм кислорода [22]. Эти данные согласуются с временным снижением активности пероксидазы у устойчивого сорта, что, возможно, необходимо для накопления активных форм кислорода, в целом же активность пероксидазы в листьях устойчивого сорта восторг выше, чем у чувствительного сорта Мускат белый (см. рис. 3). Так, Dhanumjaya Я. К. с соавтором было выявлено у 38 различных сортов винограда, с известной устойчивостью к милдью, что более устойчивые генотипы характеризуются высоким уровнем активности полифенолокси-дазы и пероксидазы [23].
У обоих сортов через 12 ч после инокуляции наблюдалось снижение активности пероксидазы. У устойчивого сорта Восторг такое снижение относительно контроля происходило значительно сильнее в сравнении с неустойчивым сортом Мускат белый. Через 48 ч после заражения у обоих сортов активность перокси-дазы возрастала (см. рис. 3). Возможно, у устойчивого генотипа значительное снижение активности перок-сидазы через 12 ч после инокуляции необходимо для увеличения содержания сигнальных АФК. В течение первых двух суток активность пероксидазы может быть направлена на сдерживание роста уровня перекисно-го окисления липидов и преобразования фенольных соединений. Как показано КоЛекатр А. с соавторами, увеличение активности пероксидазы происходит в течение первых двух суток, у чувствительных сортов на 4 день после инокуляции активность пероксидазы значительно снижается, что прослеживалось и в наших исследованиях [22]. Данный факт может быть обусловлен вторичным заражением и необходимостью повторно увеличить уровень сигнальных АФК. В нашей работе в первые 48 ч динамика МДА и активности пероксидазы имели противоположный характер у сорта Восторг. После, через 72 ч после инокуляции и в дальнейшем, содержание МДА и активность перок-
сидазы имели сходную динамику у устойчивого сорта, что может быть связано с переключением фермента на оксидазную активность (см. рис. 2, 3). У неустойчивого сорта Мускат белый в этот период динамика МДА и активности пероксидазы имели противоположный характер. Таким образом, можно предположить, что у неустойчивого сорта отсутствовало переключение фермента на оксидазную активность и дополнительная выработка сигнальных АФК.
Особое значение имеет активность пероксидазы в отношении специфического фитоалексина винограда ресвератрола, которая преобразует его в высокотоксичный димер виниферин. У восприимчивых к грибным заболеваниям сортов винограда ресвератрол представлен нетоксичной гликозилированной формой — пицеидом. У устойчивых сортов окисленные производные ресвератрола и птеростильбен продуцируются в ответ на инфицирование [24]. По данным разных авторов специфические фитоалексины винограда синтезируются в восприимчивых и устойчивых сортах при инфицировании через 4—7 дней после заражения [9], по другим данным синтез начинается на самых ранних этапах взаимодействия патогена и хозяина и значительно преобладает у устойчивых форм [2]. Микотоксичное действие может быть достаточно сильным и подавлять развитие инфекции у устойчивых сортов, но не у чувствительных сортов. У чувствительных генотипов распространение патогена происходит несмотря на повышение концентрации стиль-бенов. Увеличение концентрации стильбенов у чувствительных генотипов возрастает параллельно с распространением патогена [25]. В наших исследованиях увеличение содержания ресвератрола происходило параллельно у устойчивого и чувствительного сортов, при этом на листьях чувствительного сорта активно развивались признаки заболевания, а листьях устойчивого сорта были не повреждены. Единственной разницей в этот период у двух сортов было значительное понижение активности пероксидазы в листьях Муската белого, что, вероятно приводило к описанному ранее гликозилированию ресвератрола и переводу его в нетоксичное состояние в отсутствии перокси-дазнной активности.
На начальных этапах развития биотического стресса, до формирования специфических ответных реакций происходит использование и преобразование имеющегося пула метаболитов. Фенольные компоненты в связи с их антифунгальной активностью играют большую роль [26], что связано с цитотоксич-ностью продуктов их окисления [27]. Ali K. et al. показано, что в первые 12 ч после заражения в листьях устойчивого сорта происходит накопление фенольных соединений, главным образом, кверце-тина, fertaric и caftaric кислот [9]. В листьях зараженных растений винограда повышается содержание галловой, сиреневой и ванильной кислот, кофейной и р-кумаровой кислот, рутина и кверцетина [27]. Эти результаты, согласуются с полученными нами результатами по неустойчивому к милдью сорту Мускат
белый, у которого происходило накопление кумаро-вой, кофейной, хлорогеновой кислот в первые 48 ч после инокуляции, однако у устойчивого сорта Восторг происходило увеличение только дигидробензой-ной кислоты через 12 ч после инокуляции (см. рис. 4), что согласуется с одновременным понижением активности пероксидазы в листьях. В листьях более устойчивого сорта Восторг содержалось меньше феноль-ных соединений, являющихся промежуточными продуктами при биосинтезе микотоксичных производных, возникающих в основном при окислении пероксидазой. В первые 48 ч динамика МДА и активности пероксидазы имели противоположный характер, при этом динамика дигидробензойной и кофейной кислот также противоположна динамике активности пероксидазы в этот период. Поэтому можно сделать вывод, что этот фермент имел пероксидазную активность в отношении фенольных соединений. У неустойчивого сорта Мускат белый при вторичном заражении (после 72 ч после инокуляции) динамика МДА и активности пероксидазы имели противоположный характер, также происходило увеличение содержания дигидробензойной, кофейной и кумаро-вой кислот. Таким образом, можно предположить, что у неустойчивого сорта, в противоположность устойчивому, не происходило преобразования предшественников в микотоксичные фенольные производные. Предположительно, флавонолы расходуются на замедление развития инфекции P. viticola у устойчивого генотипа. Конститутивные гидроксикоричные кислоты не оказывают значительного влияния на защитную реакцию [28]. Данный факт, может быть подтверждением значимости направленных процессов окисления фенольных компонентов в вегетативных органах устойчивых к милдью генотипов винограда.
Интересен факт, что у неустойчивого сорта Мускат белый происходило изменение большего количества элементов первичного метаболизма в противоположность устойчивому сорту Восторг (см. рис. 1). Данный результат согласуется с данными, полученными Ali K. с соавторами [9].
Такие элементы первичного метаболизма как фени-лаланин и тирозин являются основными предшественниками фенольных соединений шикиматного пути [29]. Изменения в содержании тирозина в листьях устойчивого сорта согласуются с особенностями развития патогена: в первые 12 ч споры Plasmopara viticola прорастают, внедряются и активно распространяются в мезофилле листа через 72 часа после инокуляции [22] — содержание тирозина при этом увеличивалось (см. рис. 5, г).
Метионин, как один из этиленпродуцентов, оказывает влияние на синтез амидов гидроксикоричных кислот и преобразования фенольных соединений. У неустойчивого сорта содержание метионина в листьях возрастало через 120 ч после инокуляции, т. е. после вторичного заражения растений следующим поколением Plasmopara viticola, в то время как у устойчивого
сорта такое повышение содержания метионина происходило уже через 8 ч после первичного заражения (см. рис. 5, в). Содержание МДА после начала споро-ношения на листьях винограда у сорта Мускат белый существенно выше, чем в более ранние сроки заражения (см. рис. 2, б). Можно предположить, что степень рецепции сигнала у чувствительного сорта невысок и требуется многократное усиление степени воздействия патогена.
Серин, являющийся ключевым элементом серино-вых протеаз [30] может также оказывать регуляторное воздействие путем изменений протеомного состава тканей винограда. У устойчивого сорта Восторг в первые сутки и через 120 ч после инокуляции происходит увеличение содержания серина, что может быть свя-занос циклом развития патогена на растении [19]. У чувствительного к милдью сорта Мускат белый аналогичные изменения в содержании серина проиходят с суточным запозданием в сравнении с устойчивым сортом Восторг (см. рис. 5, б). Содержание глицина, входящего в состав структурных белков клеточных оболочек, у устойчивого сорта в течение первых четырех суток после заражения находилось примерно на одном уровне и увеличивалось только через 120 ч после заражения, а у чувствительного сорта происходило его накопление через 48 ч (см. рис. 5, а). Таким образом, можно предположить, что конститутивные изменения
у сорта Восторг имеют меньшее значение в иммунном ответе, чем у чувствительного сорта Мускат белый.
Таким образом, у обоих изученных сортов винограда основные стрессовые реакции происходят в первые 48 ч после заражения. Очевидно, что в первые двое суток воздействия биотического стресса происходит активация различных звеньев шикиматного пути у различающихся по устойчивости сортов винограда. Полученные факты могут подтверждать, что у чувствительного сорта происходит выраженный конститутивный ответ на воздействие биотического стресса, но замедлены пути дальнейшего преобразования образовавшихся метаболитов в эффективные против воздействия патогена вещества. Неустойчивый генотип реагирует на воздействие стресс-фактора значительным увеличением содержания фенольных соединений, но не их дальнейшим преобразованием. В противоположность этому в тканях устойчивого генотипа ведущую роль может играть согласованность процессов синтеза фенольных соединений и их скорейшая метаболизация за счет быстрой активации регулятор-ных процессов и быстрое образование микотоксич-ных, укрепляющих клеточную стенку веществ, что позволяет эффективно противостоять патогену.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-34-60154 мол-а-дк.
Литература
1. Boso, S. Different susceptibility of European grapevine culti-vars for downy mildew / S. Boso, H. H. Kassemeyer // Vitis. 2008. V. 47 (1). P. 39-49.
2. Gindro, K. Susceptibility to downy mildew in grape clusters: New microscopical and biochemical insights / K. Gindro, V. Alonso-Villaverde, F. Voinesco, J. L. Spring, O. Viret, P. H. Dubuis // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. — V. 52. — P. 140-146.
3. Orlandini, S. An agrometeorological approach for the simulation of Plasmopara viticola / S. Orlandini, L. Massetti, A. Dalla Marta // Computers and electronics in agriculture. — 2008. — V. 64. — P. 149-161.
4. Elato, D. W. System-wide hypersensitive response-assosiated trasnscriptome and metabolome reprogramming in tomato / D. W. Elato, I. J. Stulemeijer, van H. P. Esse, de R. C. Vos, H. J. Boumeester, M. H. Joosten // Plant Physiol. — 2013. — V. 162. — P. 1599-1617.
5. Fung, R. W.M. Powdery mildew induces defense-oriented reprogramming of the transcriptome in a susceptible but not in a resistant grapevine / W. M. Fung R., M. Gonzalo,
C. Fekete, L. G. Kovacs, Y. He, E. Marsh, L. M. McIntyre,
D. P. Schachtman, W Qiu // Plant Physiology. — 2008. — V. 146. — P 236-249.
6. Dadakova, K. Proteome and transcript analysis of Vitis vin-ifera cell cultures subjected to Botrytis cinerea infection / K. Dadakova, M. Havelkova, B. Kurkova, I. Tlolkova, T. Kasparovsky, Z. Zdrahal, J. Lochman // J. Prot. — 2015. http://dx.doi.org/10.1016/jjprot. 2015.02.001.
References
1. Boso S., Kassemeyer H. H. Different susceptibility of European grapevine cultivars for downy mildew. Vitis, 2008, vol. 47 (1), P. 39-49.
2. Gindro K., Alonso-Villaverde V, Voinesco F. et al. Susceptibility to downy mildew in grape clusters: New microscopical and biochemical insights. Plant Physiology and Biochemistry, 2012, vol. 52, pp. 140-146.
3. Orlandini S., Massetti L., Dalla Marta A. An agrometeorological approach for the simulation of Plasmopara viticola. Computers and electronics in agriculture, 2008, vol. 64, pp. 149161.
4. Elato D. W, Stulemeijer I. J., Boumeester H. J., Joosten M. H. et al. System-wide hypersensitive response-assosiated trasn-scriptome and metabolome reprogramming in tomato. Plant Physiol., 2013, vol. 162, pp. 1599-1617.
5. Fung R. W M., Gonzalo M., Fekete C., Kovacs L. G., He Y. et al. Powdery mildew induces defense-oriented reprogramming of the transcriptome in a susceptible but not in a resistant grapevine. Plant Physiology, 2008, vol. 146, pp. 236249.
6. Dadakova K., Havelkova M., Kurkova B., Tlolkova I., Kasparovsky T et al. Proteome and transcript analysis of Vitis vin-ifera cell cultures subjected to Botrytis cinerea infection. J. Prot., 2015. Available at: http://dx.doi.org/10.1016/jjprot. 2015.02.001.
7. Ahuja I., Kissen R., Bones A. M. Phytoalexins in defense against pathogens. Trends in Plant Science, 2012, vol. 17, no. 2. doi:10.1016/j. tplants. 2011.11.002.
7. Ahuja I., Kissen R., Bones A. M. Phytoalexins in defense against pathogens // Trends in Plant Science. 2012. V. 17. No. 2. doi:10.1016/j.tplants. 2011.11.002.
8. Batovska D. I. iomarkers for the prediction of the resistance and susceptibility of grapevine leaves to downy mildew / D. I. Batovska, I. T Todorova, S. P. Parushev, D. V. Nedelche-va, V. S. Bankova, S. S. Popov, I. I. Ivanova, S. A. Batovski // Journal of Plant Physiology. — 2009. — V. 166. — P. 781785.
9. Ali, К. lterations in grapevine leaf metabolism upon inoculation with Plasmopara viticola in different time-points / K. Ali, F. Maltese, A. Figueiredo, M. Rex, A. M. Fortes, E. Zyprian, M. S. Pais, R. Verpoorte, Y. H. Choi // Plant Science. — 2012. — V. 191-192. — P. 100-107.
10. Анапская ампелографическая коллекция. Краснодар,
2009. 215 с.
11. Петров, В. С. Устойчивость сортов винограда к вредным организмам / В. С. Петров, А. И. Талаш — Краснодар,
2010. — 45 с.
12. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. В. В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. — 487 с.
13. Захарова, М. В. Методика определения массовой концентрации аскорбиновой, хлорогеновой и кофейной кислот / М. В. Захарова, И. А. Ильина, Г. В. Лифарь// Методическое и аналитическое обеспечение исследований по садоводству. — Краснодар: ГНУ СКЗНИИСиВ. — 2010. — С. 279-283.
14. Сундырева, М. А. Методы экстракции и анализа антиок-сидантных ферментов вегетативных органов винограда / М. А. Сундырева, Т. В. Савченко // Современные инструментально-аналитические методы исследования плодовых культур и винограда. — Краснодар, 2015. — 115 с.
15. Shimazakia Y., Shimizu K., Suzuna Masaoka S. Enzyme separation and isozyme heterogeneity analysis using non-denaturing two-dimensional electrophoresis. 2010. Р. 1063-1067.
16. Стручкова, И. В. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. / И. В. Стручкова, Е. А. Кальясова // Электронное учебно-методическое пособие. — Нижний Новгород. — 2012. — 60 с.
17. Gessler, C. Plasmopara viticola: review of knowledge on downy mildew of grapevine and effective disease management. /
C. Gessler, I. Perlot, M. Perazolli // Phytopathol Mediterr. —
2011. — V. 50. — P. 3-44.
18. Garrido, 1.1. Effects of defoliation and water restriction on total phenols and antioxidant activities in grapes during ripening / I. I. Garrido, J. L. Llerena, M. E. Valdés, I. A. Mancha,
D. Uriarte, Prieto M. Del H., F. Espinosa // J. Int. Sci. Vigne vin. — 2014. — V. 48. — P. 31-42.
19. Alonso-Villaverde, V. The effectiveness of stilbenes in resistant Vitaceae: ultrastructural and biochemical events during Plasmopara viticola infection process. / V. Alonso- F. Villaverde, Voinesco, O. Viret, J. L. Spring, K. Gindro // Plant Phisiol. Biochem. — 2011. — V. 49. — P. 265-274.
20. Sgherri, C. Antioxidative responses in Vitis vinifera infected by grapevine fanleaf virus / C. Sgherri, A. Ranieri, M. F. Quart-
8. Batovska D. I., Todorova I. T., Parushev S. P., Nedelche-va D. V., Bankova V. S. et al. iomarkers for the prediction of the resistance and susceptibility of grapevine leaves to downy mildew. Journal of Plant Physiology, 2009, vol. 166, pp. 781— 785.
9. Ali К., Maltese F., Figueiredo A., Rex M., Fortes A. M. lterations in grapevine leaf metabolism upon inoculation with Plasmopara viticola in different time-points. Plant Science, 2012, vol. 191-192, pp. 100-107.
10. Anapa ampelographic collection. Krasnodar, 2009. 215 p. (In Russ.)
11. Petrov V. S., Talash A. I. Ustoichivost'sortov vinograda k vred-nym organizmam [Stability of grape varieties to harmful organisms]. Krasnodar, 2010. 45 p.
12. Kuznetsov Vl.V., Kuznetsov V. V., Romanov G. A., eds. Molekulyarno-geneticheskie i biokhimicheskie metody v sovre-mennoi biologii rastenii [Molecular-genetic and biochemical methods in modern plant biology]. Moscow, Binom. Labora-toriya znanii Publ., 2012. 487 p.
13. Zakharova M. V., Il'ina I. A., Lifar' G. V. [Method for determination of mass concentration of ascorbic, chlorogenic and caffeic acids]. Metodicheskoe i analiticheskoe obespechenie issledovanii po sadovodstvu [Methodical and analytical support of research on gardening]. Krasnodar, GNU SKZNIISiV Publ., 2010, pp. 279-283. (In Russ.)
14. Sundyreva M. A., Savchenko T V. [Methods of extraction and analysis of antioxidant enzymes of vegetative organs of grapes]. Sovremennye instrumental'no-analiticheskie metody issledo-vaniya plodovykh kul'tur i vinograda [Modern instrumental-analytical methods of research of fruit crops and grapes]. Krasnodar, 2015. 115 p. (In Russ.)
15. Shimazakia Y., Shimizu K., Suzuna Masaoka S. Enzyme separation and isozyme heterogeneity analysis using non-denaturing two-dimensional electrophoresis. 2010. Pp. 10631067.
16. Struchkova I. V., Kal'yasova E. A. Teoreticheskie iprakticheskie osnovy provedeniya elektroforeza belkov vpoliakrilamidnom gele: Elektronnoe uchebno-metodicheskoe posobie [Theoretical and practical principles of electrophoresis of proteins in poly-acrylamide gel]. Nizhnii Novgorod, 2012. 60 p.
17. Gessler C., Perlot I., Perazolli M. Plasmopara viticola: review of knowledge on downy mildew of grapevine and effective disease management. Phytopathol Mediterr, 2011, vol. 50, pp. 3-44.
18. Garrido I. I., Llerena J. L., Vald's M. E., Mancha I. A. Effects of defoliation and water restriction on total phenols and antioxidant activities in grapes during ripening. J. Int. Sci. Vigne Vin, 2014, vol. 48, pp. 31-42.
19. Alonso-Villaverde V., Villaverde F, Voinesco, Viret O., Spring J. L., Gindro K. The effectiveness of stilbenes in resistant Vitaceae: ultrastructural and biochemical events during Plasmopara viticola infection process. Plant Phisiol. Biochem., 2011, vol. 49, pp. 265-274.
20. Sgherri C., Ranieri A., Quartacci M. F. Antioxidative responses in Vitis vinifera infected by grapevine fanleaf virus. Journal of Plant Physiology, 2013, vol. 170, pp. 121-128.
21. Timperio A. M., D'Alessandro A., Fagioni M., Magro P., Zolla L. Production of the phytoalexins trans-resveratrol and delta-viniferin in two economy-relevant grape cultivars upon
acci // Journal of Plant Physiology. — 2013. — V. 170. — P. 121-128.
21. Timperio, A. M. Production of the phytoalexins trans-resvera-trol and delta-viniferin in two economy-relevant grape culti-vars upon infection with Botrytis cinerea in field conditions / A. M. Timperio, A. D'Alessandro, M. Fagioni, P. Magro, L. Zolla // Plant Physiology and Biochemistry. — 2012. — V. 50. — P. 65-71.
22. Kortekamp, A. Characterization of Plasmopara-resistance in grapevine using in vitro plants / A. Kortekamp, E. Zyprian // J. Plant Physiol. — 2003. — V. 160. — P. 1393-1400.
23. Dhanumjaya, R. K. Studies on biochemical variability for disease resistance in grape germplasm against powdery mildew (Uncinula Necator) / R. K. Dhanumjaya, P. C. Jindal // Bio Science Research Bulletin-Biological Sciences. — 2006. — V. 22, — № 2. — P. 95.
24. Pezet, R. Glycosylation and oxidative dimerization of resvera-trol are respectively associated to sensitivity and resistance of grapevine cultivars to downy mildew / R. Pezet, K. Gindro, O. Viret, J. L. Spring // Physiological and Molecular Plant Pathology. — 2004. — V. 65. — P. 297-303.
25. Poutaraud, A. Fast and local assessment of stilbene content in grapevine leafby in vivo fluorometry / A. Poutaraud, G. Latou-che, S. Martins, S. Meyer, D. Merdinoglu, Z. G. Cerovic // J. Agric. Food Chem. — 2007. — V. 55. — P. 4913-4920.
26. Hammershmidt, R. Phenols and plant pathogen interaction: the saga continues. Physiol. Mol. Plant Pathol. 2005. V. 66. P. 77-78.
27. Macoy, D. M. Biotic stress related functions of hydroxycin-namic acid amide in plants / D. M. Macoy, W-Y. Kim, S. Y. Lee, M. G. Kim // J. Plant Biol. — 2015 — V. 58. — P. 156-163.
28. Latouche, G. Influence of constitutive phenolic compounds on the response grapevine (Vitis vinifera L.) leaves to infection by Plasmopara viticola / G. Latouche, S. Bellow, A. Poutaraud, S. Meyer, Z. Cerovic // Planta — 2013. — V. 237. — P. 351361.
29. Dufour, M. C. Benzothiadiazole-primed defence responses and enhanced differential expression of defence genes in Vitis vin-ifera infected with biotrophic pathogens Erysiphe necator and Plasmopara viticola / M. C. Dufour, C. Lambert, J. Bouscaut, J. M. Me'rillon, M. F. Corio-Costet // Plant Pathology. — 2013. — V. 62. — P. 370-382.
30. Kidric, M. Proteases and their endogenous inhibitors in the plant response to abiotic stress / M. Kidric, J. Kos, J. Sabotic // Botanica serbica. — 2014. — V. 38 (1). — P. 139-158.
infection with Botrytis cinerea in field conditions. Plant Physiology and Biochemistry, 2012, vol. 50, pp. 65—71.
22. Kortekamp A. Zyprian E. Characterization of Plasmopara-resistance in grapevine using in vitro plants. J. Plant Physiol.,
2003, vol. 160, pp. 1393-1400.
23. Dhanumjaya R. K., Jindal P. C. Studies on biochemical variability for disease resistance in grape germplasm against powdery mildew (Uncinula Necator). Bio Science Research Bulletin -BiologicalSciences, 2006, vol. 22, no. 2, p. 95.
24. Pezet R., Gindro K., Viret O., Spring J. L. Glycosylation and oxidative dimerization of resveratrol are respectively associated to sensitivity and resistance of grapevine cultivars to downy mildew. Physiological and Molecular Plant Pathology,
2004, vol. 65, pp. 297-303.
25. Poutaraud A., Latouche G., Martins S., Meyer S., Merdino-glu D., Cerovic Z. G. Fast and local assessment of stilbene content in grapevine leaf by in vivo fluorometry. J. Agric. Food Chem., 2007, vol. 55, pp. 4913-4920.
26. Hammershmidt R. Phenols and plant pathogen interaction: the saga continues. Physiol. Mol. Plant Pathol., 2005, vol. 66, pp. 77-78.
27. Macoy D. M., Kim W-Y., Lee S. Y, Kim M. G. Biotic stress related functions of hydroxycinnamic acid amide in plants. J. Plant Biol., 2015, vol. 58, pp. 156-163.
28. Latouche G., Bellow S., Poutaraud A. Influence of constitutive phenolic compounds on the response grapevine (Vitis vinifera L.) leaves to infection by Plasmopara viticola. Planta, 2013, vol. 237, pp. 351-361.
29. Dufour M. C., Lambert C., Bouscaut J., Benzothiadiazole-primed defence responses and enhanced differential expression of defence genes in Vitis vinifera infected with biotrophic pathogens Erysiphe necator and Plasmopara viticola. Plant Pathology, 2013, vol. 62, pp. 370-382.
30. Kidric M., Kos J., Sabotic J. Proteases and their endogenous inhibitors in the plant response to abiotic stress. Botanica ser-bica, 2014, vol. 38 (1), pp. 139-158.
Метаболические изменения у сортов винограда с различной устойчивостью при заражении милдью
Ключевые слова
Vitis vinifera; Plasmopara viticola; биохимические параметры; метаболические изменения; стресс; устойчивость.
Реферат
Производство винограда является одной из наиболее капиталоемких отраслей сельского хозяйства, что делает необходимым использование ресурсосберегающих технологий возделывания. Виноград в значительной степени поражается большим количеством грибных патогенов, вредосносность которых связана с повреждением всех фотосинтезирующих органов. Задача исследования — выявление метаболических и временных закономерностей и особенностей иммунного ответа растений винограда с различной степенью восприимчивости к грибным патогенам при проявлении защитных реакций. Были исследованы метаболичесикие особенности двух сортов винограда Восторг и Мускат белый, отличающихся по устойчивости к милдью. Результаты корреляционного анализа показали, что наибольшие отличия между разными по устойчивости сортами винограда прослеживаются по содержанию аминокислот глицина, лейцина, метионина, серина; вторичных метаболитов — дигидробензойной, кофейной, кумаровой, сиреневой кислот. Активность пероксидазы также показала видимые отличия между генотипами. У обоих изученных сортов винограда основные стрессовые реакции происходят в первые 48 ч после заражения. Активность пероксидазы у устойчивого к милдью сорта Восторг оказывает значительное влияние на преобразование имеющегося пула вторичных метаболитов в микотоксичные производные, в то время как у неустойчивого сорта Мускат белый аналогичных процессов не происходит. В листьях неустойчивого сорта выявлено высокое содержание малонового диальдегида в сравнении с устойчивым сортом, что свидетельствует о значительном развитии окислительного стресса и недостатками в функционировании антиоксидантной системы. Неустойчивый генотип реагирует на воздействие стресс-фактора значительным увеличением содержания фенольных соединений, но предположительно, не их дальнейшим преобразованием. В противоположность этому в тканях устойчивого генотипа ведущую роль может играть согласованность процессов синтеза фенольных соединений и их скорейшая метаболизация, связанная с активностью пероксидазы, за счет быстрой активации регуляторных процессов и быстрое образование микотоксич-ных, укрепляющих клеточную стенку веществ, что позволяет эффективно противостоять патогену.
Авторы
Сундырева Мария Андреевна, канд. с.-х. наук; Ушакова Яна Владимировна, канд. биол. наук; Антоненко Михаил Викторович, канд. техн. наук Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия, Россия, 350901, Краснодарский край, г. Краснодар, ул. им. 40-летия Победы, 39, taurim2012@yandex.ru, u_yana@mail.ru, antonenko84@bk.ru
Metabolic Changes in Grape Varieties with Different Resistance to Mildew Infection
Key words
Vitis vinifera; Plasmopara viticola; biochemical parameters; metabolic changes; stress; stability.
Abstract
The production of grapes is one of the most capital-intensive branches of agriculture, which makes it necessary to use resource-saving technologies of cultivation. Grapes are largely affected by a large number of fungal pathogens, the harmfulness of which is associated with damage to all photosynthetic organs. The task of the study is to identify the regularities and characteristics of the immune response of grape plants with different degrees of susceptibility to fungal pathogens. Metabolic peculiarities of two varieties of grapes differing in resistance to mildew Vostorg and Muscat belyy were studied. The results of the correlation analysis showed that the greatest differences between grape varieties can be traced in the content of amino acids glycine, leucine, methionine, serine; secondary metabolites — digidrobenzoynoy, caffeic, coumaric, lilac acids. The activity of peroxidase also showed visible differences between the genotypes. In both studied varieties of grapes, the main stress reactions occur in the first 48 hours after infection. The activity of peroxidase in the mildew-resistant cultivar Vostorg has a significant effect on the transformation of the existing pool of secondary metabolites into myco-toxic derivatives, whereas in the unstable Muscat belyy, no similar processes occur. In the leaves of the unstable variety, a high content of malonic dialdehyde was found in comparison with the resistant variety, which indicates a significant development of oxidative stress and deficiencies in the functioning of the antioxidant system. The unstable genotype reacts to the stress-factor effect by a significant increase in the content of phenolic compounds, but presumably not by their further transformation. In contrast to this, in the tissues of a stable genotype, the coordination of the processes of the synthesis of phenolic compounds and their speedy metabolization associated with peroxidase activity can play a leading role through the rapid activation of regulatory processes and the rapid formation of myco-toxic substances that strengthen the cell wall, which makes it possible to effectively resist the pathogen.
Authors
Sundyreva Maria Andreevna, Candidate of Agricultural Science; Ushakova Yana Vladimirovna, Candidate of Biological Science; Antonenko Mikhail Viktorovich, Candidate of Technical Science North Caucasian Regional Research Institute of Horticulture and Viticulture,
39, 40 years of Victory st., Krasnodar, Krasnodar Region, 350901, Russia,
taurim2012@yandex.ru, u_yana@mail.ru, antonenko84@bk.ru
