CC BY
385
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ... 29
УДК 612.014.464
Н.Г. Кормош
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА
(СУБКЛЕТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ) - ВЗГЛЯД КЛИНИЦИСТА
РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Наталия Геннадьевна Кормош, врач-хирург отделения опухолей женской репродуктивной системы НИИ клинической онкологии
адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-98-35 e-mail: nkormosh@hotmail.com
Статья поступила: 29.04.2011, принята к печати 25.10.2011
Резюме
Эволюционно сформированная редокс-гомеостатическая система включает активные формы кислорода и антиоксидантную систему.
Показано, что АФК постоянно образуются и являются необходимым компонентом жизнедеятельности клеток и организма в целом.
Для поддержания физиологического уровня АФК требуется постоянная регенерация различных компонентов АОС, а это активные энергоемкие процессы, требующие согласованной работы на всех уровнях организма, клеток, клеточных структур и генов.
Ключевые слова: АФК, физиология, редокс-гомеостаз.
N.G. Kormosh
PHYSIOLOGICAL ROLE
OF A REACTIVE OXYGEN SPECIES
(SUBCELLULAR LEVEL) - CLINICIAN VIEWPOINT
N.N Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
Evolutionarily formed redox homeostatic system includes a reactive oxygen species and antioxidant system.
ROS are generated continuously and are an essential component of cell activity.
To maintain the physiological level of ROS requires constant regeneration of the various components of the AOS. This regeneration is the active energy-consuming processes that require coordinated interaction at all levels of the organism, cells, cellular structures and genes.
Key words: ROS, physiology, redox homeostasis.
Введение
Выявление в последние годы так называемых коротких РНК (21-30 нуклеотидов) продемонстрировало неожиданные и непредсказуемые возможности новых способов контроля экспрессии генов и стабильности генома эукариот.
Выявлены три основных типа коротких РНК: микро-РНК [35; 45], эндогенные малые интерферирующие РНК, или siRNA (small interfering RNA) [30; 33] и piRNA, связываемые так называемыми Piwi (Piwi-interacting RNA) белками [31].
Все эти типы РНК участвуют в регуляции экспрессии генов, а siРНК и р1РНК направлены также на подавление экспрессии транспозонов и обеспечение стабилизации геномов.
Уже совсем недавно была обнаружена защитная роль коротких РНК (CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNAs, или crRNAs) у прокариот [21; 34].
Поэтому представляет интерес рассмотреть возможности существования других, сейчас, казалось бы, невероятных, способов возникновения в клетке коротких олигорибонуклеотидов, которые могут быть использованы для аналогичных регуляторных или защитных целей. Впервые предположение о появлении свободных радикалов в ходе ферментативных
реакций было высказано в 1931 г. немецким биохимиком L. Michaelis. А.Н. Бах и К.О. Энглер разработали теорию горения, согласно которой окисление происходит в две стадии с образованием промежуточного пероксидного соединения. Ведущая роль в изучении АФК и их производных принадлежит Б.Н. Тарасову, который впервые в мире применил методы привитой радикальной сополимеризации и хемилюминесценции для регистрации свободных радикалов в тканях.
В 1954 г. он показал, что в тканях животных под действием ионизирующей радиации появляются токсичные продукты свободнорадикального окисления липидов - перекиси ненасыщенных жирных кислот [1]. Кроме того, он высказал предположение, что динамика накопления активных свободно-радикальных производных в организме будет прямо пропорциональна накоплению симптомов и тяжести патологического процесса, что объяснялось токсическим воздействием свободных радикалов на мембраны клеток.
В том же 1954 г. ученые Вашингтонского университета (University of Washington) B. Commoner, J. Townsend и G. Pake обнаружили и классифицировали сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) свободных радикалов в различных тканях животных.
Они показали, что интенсивность ЭПР-сигналов существенно отличается в различных тканях, что, в свою очередь, предполагало зависимость количества свободных радикалов от метаболических процессов [7].
В те же годы Н.М. Эмануэль выдвинул гипотезу о том, что свободные радикалы могут играть роль в онкогенезе и росте опухолей. В 1956 г. D. Harman высказал идею: в организме могут протекать реакции с образованием свободных радикалов, и эти реакции лежат в основе повреждения клеток, мутагенеза, рака, и, не в последнюю очередь, дегенеративного процесса биологического старения [17].
В 1969 г. J.M. Mac Cord и I. Fridovich обнаружили фермент супероксиддисмутазу и убедили большинство коллег научного мира, что свободные радикалы играют важную роль в биологии.
С учетом методов косвенной регистрации действия свободных радикалов и возможности определения ферментов, которые нейтрализуют активность радикалов, многими исследователями in vitro изучено повреждающее окислительное действие радикалов на ДНК, белки, липиды и другие компоненты клеток. Другими исследователями показано, что данные, полученные в эксперименте, не могут быть формально перенесены на реакции клеток в организме. Среди причин ограничения использования полученных данных называются сами условия эксперимента: применяемые дозы АФК (в частности
- перекиси водорода) и условия культивирования клеток, которые зачастую не физиологичны.
Патологическая роль радикалов показана для многих заболеваний, в том числе лучевой болезни, сахарного диабета, целого ряда бронхо-легочных, сердечно-сосудистых, ревматоидных болезней, патологии нервной системы, злокачественных новообразований. Процесс ПОЛ изучен наиболее подробно. Изменения, выражающиеся в интенсификации процессов ПОЛ при любой патологии, оказались однотипны, но корреляция с тяжестью клинических проявлений заболевания получена далеко не во всех случаях. Обобщая эти исследования, была сформулирована концепция перекисной гибели клетки, а сам процесс ПОЛ признан губительным для организма. С другой стороны, интенсификация процесса наблюдается с увеличением возраста при отсутствии клинически значимой патологии. Возможности коррекции наблюдаемых изменений антиоксидантами оказались не однозначными.
Во-первых, их прием в большинстве случаев сопровождался некоторым снижением, но не нормализацией показателей ПОЛ; а в некоторых исследованиях на фоне приема антиоксидантов наблюдалась дальнейшая интенсификация процессов ПОЛ.
Во-вторых, полученный эффект оказался непродолжительным. Более того профилактический прием витаминов с антиоксидантным действием (ретинол, Р-каротин), как показали исследования, может приводить к росту заболеваемости злокачественными новообразованиями [25], а комплекс витаминов не уменьшает риск сердечно-сосудистых заболеваний [20]. Другими исследователями представлены данные о не менее эффективной коррекции изменений прооксидантами, т.е. веществами с противоположным антиоксидантам действием.
С другой стороны, показана регуляторная роль АФК в процессе жизнедеятельности клеток, а также их участие в синтезе биологически активных веществ. Для того, чтобы дать правильную оценку полученным в эксперименте и клинике результатам и разрешить множество накопившихся противоречий, необходимо,
прежде всего, понимание физиологической роли АФК. Эти знания необходимы не только исследователям, но и клиницистам для разработки адекватной тактики лечения, поскольку окислительный стресс обнаружен при многих заболеваний.
Представленный обзор литературы посвящен вопросу физиологической роли АФК, и разделен на две части: 1 - источники АФК и антиок-сидантной системы; действие АФК на субклеточном уровне; 2 - действие АФК на клеточном уровне и в организме в целом.
Источники АФК
и антиоксидантной системы
Новый импульс в изучении свободнорадикальных процессов и роли АФК дало развитие клеточной и молекулярной биологии и генетики.
Прежде всего, показано, что в клетках АФК образуются постоянно, а источниками их образования являются многие клеточные структуры и многочисленные ферменты. Основным источником АФК в клетке являются митохондрии, в которых потребляемый кислород восстанавливается до воды в процессе окислительного фосфорилирования. Однако часть потребляемого кислорода (около 2 %) идет на образование АФК путем одноэлектронного восстановления при помощи ферментов - НАДФН-оксидазы, ксантиноксидазы, а также убихиноном, которые являются компонентами цепи переноса электронов митохондрий [3]. Кроме того, описано образование АФК во многих других клеточных системах, в том числе: пероксисомах, лизосомах, мик-росомах, эндоплазматическом ретикулуме, цитозоле, протеосомах а также цитоплазматической мембране.
АФК образуются многими ферментами, в том числе митохондриальными комплексами, изоформами НАДФН-оксидазы, цитохромом Р450, ксантиноксидазой, циклооксигеназой, липоксигена-зой. В большинстве случаев образование АФК связано с метаболическими путями в клетках, такими как окисление жирных кислот [5] и углеводов, окислительной конформации белков. При этом образование АФК находится под строгим метаболическим контролем, который включает компартмен-тализацию окислительных реакций [26].
Реактивные формы кислорода, идентифицированные в клетках, включают в себя свободные радикалы, такие как супероксид-анион (О2^ -), гидроксильный радикал (OH^), перекисные радикалы (RO2^), а также молекулы нерадикальной природы, которые являются окислителями и/или легко превращаются в радикалы, такие как перекись водорода (H2O2), гипохлорная кислота (HOCl) и синглет-ный кислород (1О2). Однако часто различные активные формы сосуществуют в реактивной среде и трудно определить однозначно агента, который вызывает данный биологический эффект.
Супероксидный радикал образуется в клетке с помощью ферментов (НАДФН-оксидаза, ксантинокси-даза) или неферментативно в реакции с семиубихино-ном в митохондриальной цепи электронного транспорта. В присутствии металлов переменной валентности (например, ионов железа или меди), перекись водорода может быть преобразована в гидроксильный радикал (реакция Фентона). Период полураспада гидроксильного радикала in vivo составляет около 10-9 сек., что в совокупности с его высокой реактивной способностью приводит к тому, что радикал мгновенно реагирует с любой окисляемой молекулой в ближайшем окружении, практически он является одним из наиболее опасных агентов, образующихся в организме.
Среди всех АФК перекись водорода представляется наиболее распространенной молекулой, потому что постоянно образуется в митохондриях в процессе физиологического обмена веществ, является относительно стабильной молекулой и в тоже время сильным окислителем; молекула достаточно мала, чтобы диффузно проникать через биомембраны. Кроме того недавно были обнаружены аквапо-рины, первоначально описанные как водные каналы, которые присутствуют во всех живых клетках и способствуют диффузии перекиси водорода через клеточные мембраны [4]. Переход перекиси водорода через мембрану способствует, с одной стороны, распространению редокс-сигнала внутри одной клетки, с другой - обеспечивает межклеточное взаимодействие, оказывая влияние на окружающие клетки. Таким образом, способность к диффузии АФК дает возможность вызывать множественные внутриклеточные реакции, а также - инициировать тканевые реакции, такие как массовая гибель клеток [27].
АФК постоянно образуются в клетках и тканях в низких, но измеримых концентрациях [31], что определяется балансом между скоростью образования и дезактивации их антиоксидантами. Поддержание этого равновесия необходимо на всех уровнях: от клеточных органелл и мембран до организма в целом. Поэтому для поддержания гомеостаза, в частности окислительного, необходима непрерывная регенерация антиоксидантной активности. Антиоксиданты по определению - вещества, способные при относительно низких концентрациях конкурентно взаимодействовать с активными свободными радикалами, и, таким образом, значительно уменьшать или препятствовать окислению других субстратов. АО-свойствами обладают многие вещества различной химической природы. Общепринятой классификации на сегодняшний день не существует. Как правило, выделяют жиро- и водорастворимые и ферментативные АО. Жирорастворимые биоантиоксиданты (фосфолипиды, а-токоферол, витамин А, каротиноиды, убихинон, витамины группы К, стероидные гормоны) осуществляют свою защитную функцию в биологических мембранах, водорастворимые (аскорбиновая, лимонная, никотиновая кислоты; серосодержащие соединения; липоевая кислота; церулоплазмин; полифенолы; флавоноиды; трансферрин; лактофер-рин; альбумин; мочевина и мочевая кислота) - в цитозоле клеток, межклеточной жидкости, плазме крови, лимфе. Однако природа многих из этих соединений двойственная: одна и та же молекула (ион) может быть как окислителем, так и восстановителем в зависимости от свойств молекулы (иона), с которой происходит взаимодействие, а также от среды, в которой осуществляется реакция. Примером может служить аскорбиновая кислота, которая обладает широким спектром антиоксидантных свойств: снижает уровень АФК (супероксидного радикала, синглетного кислорода, гидроксильного, перекисного и органических радикалов), восстанавливает окисленную форму витамина Е и глута-тиона. Однако в присутствии ионов железа и меди, при изменении показателей крови (уровень pH или оксигенации), а также при исходно её высокой концентрации в крови аскорбиновая кислота проявляет выраженные прооксидантные свойства и активно инициирует реакции ПОЛ. Аскорбиновая кислота проявляет антиоксидантные свойства, но это не единственная ее роль в организме. Она также принимает участие в синтезе коллагена и эластина, в обмене холестерина, гистамина и ацетилхолина.
Экспериментальные данные показывают, что эффект неферментативных антиоксидантов определяется не только их антиоксидантными свойствами по утилизации свободных радикалов. Помимо роли в клеточной антиоксидантной защите все неферментативные антиоксиданты играют важную роль в реализации физиологических функций клеток: участвуют в регуляции активности факторов транскрипции, модулируют клеточные сигнальные пути, принимают участие в регуляции клеточного цикла, а также процессах дифференцировки, пролиферации и гибели клеток [21].
Первую линию защиты от свободных радикалов представляют антиоксидантные ферменты супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза. Они находятся во всех аэробных клетках и характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов, специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов переменной валентности. Скорость реакции чрезвычайно высока (лимитируется только скоростью диффузии АФК) и не требует энергии для активации.
Супероксиддисмутаза обеспечивает превращение супероксидного анион-радикала в менее активный окислитель - перекись водорода. Различия в свойствах супероксидного радикала (заряжен, активен, не способен преодолеть мембранный барьер) и перекиси водорода (не заряжен, относительно инертен, легко проникает через клеточную мембрану) объясняет важную роль СОД в регуляции распространения АФК от места образования в направлении как внутриклеточно, так и между клетками. СОД - водорастворимый фермент, поэтому супероксидный радикал, генерируемый в мембране, оказывается для него малодоступным. В клетках млекопитающих обнаружены три изоформы фермента - Си, 7п-СОД (цитозольная), Си, 7п-гликозилированная СОД (экстрацеллюлярная) и Мп-СОД (митохондриальная).
Каталаза обеспечивает расщепление перекиси водорода до 2 молекул воды и кислорода; из-за большого молекулярного веса практически не проникает через клеточные мембраны.
Во всех животных тканях содержится тиоло-вый трипептид глутатион. Низкая молекулярная масса определяет его мобильность, а наличие сульфгидриль-ной связи -активность. Восстановленный глутатион участвует во многих клеточных процессах: детоксикации перекиси водорода и гидроперекисей, которые возникают при реакции АФК с полиненасыщенными жирными кислотами мембран; нейтрализации гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона, или в результате радиолиза воды под действием ионизирующих излучений. Глутатион - основной антиоксидант эритроцитов, он служит коферментом при восстановлении метгемоглобина в функционально активный гемоглобин; является основным агентом, защищающим тиоловые ферменты (цикла Кребса, тканевого дыхания) от окисления. Его антиоксидант-ное действие катализируют глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатион-Б-трансфераза. Глута-тионпероксидаза содержит селен и играет основную роль в инактивации липидных, белковых, а также нуклеиновых гидроперекисных соединений. Глутатион-редуктаза поддерживает достаточный уровень активного глутатиона путем восстановления его дисуль-фидной формы. Основной функцией глутатион-Б-трансферазы является детоксикация токсических соединений путем конъюгирования их с глутатионом.
Глутатион, а также другие низкомолекулярные тиолы, такие как тиоредоксин и глутаредоксин объединяют в тиоловую систему, поскольку соотношение восстановленных и окисленных БИ-групп в биосредах (редокс-пар) определяет их потенциальную способность к окислительной модификации и играет важную роль в поддержании внутриклеточного редокс-гомеостаза. Редокс-парой также является НАДФ +/НАДФН. НАДФН имеет самый низкий потенциал для восстановления и, следовательно, является источником для функционирования других редокс-пар [28].
Аминокислоты и белки также могут нейтрализовать АФК, причем эта реакция менее эффективна и специфична, чем с классическими антиоксидантами, но их совокупная внутриклеточная концентрация значительно выше. АФК участвуют в модификации белков, что приводит к изменениям в функции белка, химической фрагментации или повышенной восприимчивости к протеолизу. Протео-лиз белков осуществляется в основном в протеасо-мах. В одном из исследований выявлено, что про-теолиз увеличился более чем в 11 раз после контакта с супероксидом или перекисью водорода [8]. В тоже время этот эффект оказался дозозависимым: протеолиз повышался при концентрациях 20-400 моль перекиси водорода, а при миллимолярных концентрациях протеолиз ингибировался, что приводило к накоплению внутриклеточных окисленных белков [15]. С другой стороны, было показано, что инактивация АФК не измененными по структуре белками значительно слабее, чем белками с нарушенной структурой или эквивалентными концентрациями составляющих их аминокислот [11]. Поэтому свободные аминокислоты также являются важными утилизаторами АФК. Практически все аминокислоты могут служить мишенями для АФК, хотя некоторые аминокислоты, такие как триптофан, тирозин, гистидин, цистеин и метионин особенно чувствительны к АФК [9]. Из них только две аминокислоты, цистеин и метионин, могут быть восстановлены ферментативным путем, окислительные изменения других аминокислот необратимы. Таким образом, АФК осуществляют физиологический контроль синтеза белка в клетке, при окислительном стрессе их взаимодействие с белками носит дозозависимый характер, а восстановление поврежденных белков возможно только в ограниченных случаях.
Наличие в организме многочисленных анти-оксидантных соединений обеспечивают высокую базальную буферную емкость, которая может быть существенно увеличена, например, за счет протео-литической деградации.
Действие АФК на субклеточном уровне
АКМ могут как обратимо, так и необратимо окислять или восстанавливать любую органическую молекулу, но в низких дозах легче взаимодействуют с молекулами, в состав которых входит ион с переменной валентностью (ими в большинстве случаев являются сера и железо). С точки зрения биоорганической химии такими молекулами будут белки, включающие цистеин, а также железосодержащие белки. Из них наиболее значимы белки, содержащие цистеин и железо в активном центре. Биологической сущностью такого взаимодействия является потенциальная обратимость, цикличность реакции. Показано, что степень окисления серы в цистеине с образованием дисульфидов (-ББЫ), сульфеновых кислоты (-БОИ), сульфиновых кисло-
ты (-БО2И) или сульфокислоты (-БО3И) зависит от уровня АФК [34]. Образование последнего соединения необратимо, а восстановление дисульфидных связей возможно при наличии доноров протонов НАДФН и энергии АТФ.
Большинство ферментов центральных энергетических путей метаболизма являются тиолсо-держащими белками, а активность других определяется фосфорилированием.
В митохондриях образование АФК определяется уровнем метаболизма клетки, и при отсутствии адекватной их утилизации АФК служат элементом отрицательной обратной связи, блокируя ферменты цикла Кребса и осуществляя переход с аэробного на анаэробный гликолиз, а также обеспечивая соответствие энергетического метаболизма потребности и возможности клетки. Образование АФК в митохондриях зависит также от наличия митохондриальных энергетических субстратов. Избыток субстратов обычно предотвращается жестким регулированием ключевых ферментов гликолиза. Фосфофруктокиназа, один из первых ферментов на этом пути, ингибируется конечными продуктами цикла Кребса (АТФ и цитратом) и соотносит таким образом образование пирувата и ацетил СоА с клеточным энергопотреблением.
К клеточным белкам, активный центр которых включает ионы переменной валентности, относятся многие ферменты, в том числе киназы, катализирующие перенос фосфатной группы от молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) на различные субстраты. Многочисленные исследования подтверждают, что АФК активизируют фосфорилиро-вание белков путем дисульфидного окисления про-теинкиназ, а также инактивируют каталитическую активность фосфатаз, что ведет к фосфорилирова-нию белков и изменению их функциональной активности. Например, все известные тирозинфосфа-тазы имеют в активном центре остаток цистеина. Биохимические данные свидетельствуют о том, что инактивирование активности таких ферментов может осуществляться двумя способами: окисление остатков цистеина АФК или связывание с дисульфидом глутатиона (глутатионилирование). И. Бип и N. Топкз, изучая процесс фосфорилирования белков, пришли к выводу, что активности тирозин-фосфатаз на несколько порядков выше, чем тиро-зинкиназ. Поэтому для осуществления реакции с участием тирозинкиназ, активность тирозинфосфа-таз должна жестко регулироваться как за счет определенной субклеточной локализации, так и за счет их фосфорилирования [33].
В совокупности эти результаты указывают, что тирозинфосфатаза является типичным примером регуляторного белка, отвечающего на изменения редокс-состояния, а сам процесс фосфорилиро-вания белков - редоксзависимым.
К семейству тирозинкиназ относятся рецепторы инсулина, рецепторы факторов роста, включая тромбоцитарный и эпидермальный. Особенностью таких рецепторов является возможность ау-тофосфорилирования. При активации рецепторы с тирозинкиназной активностью могут фосфорили-ровать сами себя.
Изучение влияния АФК на рецептор инсулина преимущественно проводилось на клеточных линиях адипоцитов, Прежде всего, показано, что уровень и длительность воздействия АФК имеют важное значение для функционирования рецептора. Физиологическая миллимолярная концентрация АФК усиливает клеточный ответ на инсулин.
Показано, что стимуляция инсулином своего рецептора приводит также к активации НАДФН-оксидазы и образованию АФК, которые, в свою очередь, инактивируют тирозинфосфатазы, что приводит к фосфорилированию тирозиновых/цистеиновых остатков, как в самом рецепторе инсулина, так и в ферментах, участвующих в сигнальном каскаде [22]. Учитывая неспецифичность действия АФК, возможно также фосфорилирование других тирозинкиназ-ных рецепторов, что подтверждается синергизмом действия рецепторов.
При воздействии на клетки перекиси водорода в высоких (не физиологических) концентрациях обнаружен эффект инсулиннезависимого фос-форилирования рецептора инсулина, что сопровождалось инсулиноподобными эффектами при отсутствии инсулина [24]. Длительное воздействие умеренных концентраций перекиси водорода уменьшало эффект инсулина [З5].
D. Wang с соавт., изучая фибробласты сердца новорожденных мышей, обнаружили, что активация рецептора ангиотензина II сопровождается активацией других мембранных рецепторов, таких как рецепторы эпидермального и тромбоцитарного факторов роста [Зб]. В механизме множественной активации трансмембранных тирозинкиназных рецепторов установлена важная роль генерации АФК НАДФН-оксидазой, которые способствуют аутофосфорили-рованию мембранных рецепторов и индукции сигнальных каскадов [ЗО]. Таким образом, АФК могут способствовать синергетическому взаимодействию между различными типами мембранных рецепторов.
Исследования в последнее десятилетие позволили установить факт участия АФК в передаче сигнала от рецептора к клеточному ядру и существование особой, зависимой от АФК, регуляторной, редокс-сигнальной системы [12]. Особенностью этой системы является также возможность реагировать на изменения уровня АФК без участия специализированных рецепторов. Передача сигнала реализуется путем обратимого окисления, фосфорили-рования или глутатионилирования белков, что позволяет им принимать и быстро передавать сигналы, опосредованные действием АФК. Поскольку АФК образуются из различных внутриклеточных источников и при многих воздействиях на клетку, такая система приема и передачи сигнала является неспецифической. Это приводит к тому, что практически любой ответ клетки помимо специфической компоненты, содержит и неспецифическую составляющую, опосредованную действием АФК. Кроме того, мембранные рецепторы могут функционировать одновременно в качестве датчика для внеклеточных сигналов и как датчик для внутреннего метаболического состояния отдельной клетки.
Многоуровневая система передачи сигнала внутри клетки, включающая и функциональный ответ на сигнал, и неспецифическую составляющую, оказываются тесно переплетенными между собой. Это обстоятельство имеет важное биологическое последствие: сбой в регуляции ведет к гибели клетки, что для организма в целом является защитным эффектом.
АФК принимают участие в регуляции внутриклеточных процессов [19]. На сегодняшний день известно более 20 факторов транскрипции, активность которых модулируется редокс-балансом в клетках млекопитающих за счет наличия цистеино-вых остатков в их ДНК-связывающих доменах. Показано, что активация редокс-чувствительных факторов транскрипции NF-кВ, АР-1, р5З в клетках
животных и человека приводит к изменению экспрессии нескольких сотен генов и, соответственно, активности многих ферментативных процессов [2]. К изученным редокс-чувствительным сигнальным каскадам относятся митоген-активируемые проте-инкиназы (MAPK) - р38 MAPK, c-Jun N-терминальные киназы (JNK), экстрацеллюлярные сигнал-регулируемые киназы 1 и 2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2 - ERK1/2).
Редокс-сигнализация обнаружена практически у всех живых организмов, включая бактерии. Регуляторные процессы включают защитные реакции от окислительного повреждения. Повышение концентрации АФК вызывает во многих клетках экспрессию генов, продукты которых обладают антиоксидантной активностью, что приводит к увеличению буферной емкости и восстановлению ре-докс-гомеостаза. Таким образом, редокс-гомеостаз клетки, определяемый соотношением уровня АФК и антиоксидантной буферной емкостью, может наблюдаться как при низком, так и высоком уровне АФК. Но при высоком уровне АФК состояние гомеостаза достигается за счет активизации сигнальных путей и экспрессии соответствующих генов. Однако длительная генерация аномально большого количества АФК может привести к стойким изменениям в трансдукции сигнала и экспрессии генов и возникновению патологических состояний [10].
Редокс-состояние клеток зависит не только от уровня АФК, но и от внутриклеточного уровня буферной АОС. Уменьшение емкости буферной системы может быть вызвано как расходованием компонентов её составляющих, так и нарушением их синтеза или восстановления. Показано, что изменение соотношения тиоловых/дисульфид соединений в клетке вызывает изменения тех же сигнальных путей, что и перекись водорода [18; 32].
Окислительно-восстановительный гомеостаз включает регуляторные механизмы, которые способны контролировать как образование АФК, так и емкость буферной АОС системы.
Установлено, что у бактерий при росте АФК наблюдается изменение активности факторов транскрипции OxyR и SoxR, которое сопровождается синтезом Mn-СОД, каталазы, глутатионредуктазы, глу-таредоксина [37]. При этом изменения структуры и соответственно активности OxyR происходит за счет образования множественных дисульфидных связей. Кроме того, окисленный белок OxyR связан отрицательной обратной связью с его синтезом [6]. Окисление активного центра белка SoxR в условиях окислительного стресса стимулирует транскрипцию sox-локуса, что приводит к синтезу белков с антиок-сидантными свойствами [13]. В нормальных физиологических условиях, белок SoxR (содержащий активный центр 2Fe-2S) находится в восстановленном состоянии и не активен. Таким образом, рост АФК эффективно контролируется в клетках бактерий путем изменения активности факторов транскрипции OxyR и SoxR. Более сложная система редокс-регулирования обнаружена у одноклеточных грибков. Добавление перекиси водорода к культуре S. cerevisiae сопровождается индукцией фактора транскрипции АР-1. Обнаружено, что ответный синтез протеинов зависит от уровня как перекиси водорода, так и белка АР-1. Воздействие малых доз Н2О2 сопровождалось продукцией тиоредоксина, увеличение концентрации перекиси водорода сопровождалось гиперэкспрессией АР-1 и дополнительным синтезом СОД, глутатион-редуктазы, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы [29].
Длительное воздействие высоких доз перекиси водорода на S. cerevisiae приводило к активизации синтеза 115 белков и подавлению синтеза 52 белков [14].
Индуцированные белки идентифицированы, ими оказались антиоксидантные ферменты, такие как: Мп-СОД, Си/7п-СОД, глутатион-редуктаза, каталаза, тиоредоксин-редуктаза, цитохром-с-перо-ксидаза и белки теплового шока. Воздействие Н202 также приводило к блокированию синтеза белков, ответственных за биосинтетические процессы и стимулированию деградации собственных белков за счет активации синтеза субединиц протеасом. Также отмечено изменение углеводного обмена -быстрый переход углеводного метаболизма с аэробного на анаэробного гликолиз. Таким образом, рост АФК у одноклеточных грибков вызывает дозозависимый многокомпонентный ответ, не только защитный, антиоксидантный, но и изменение метаболизма белков и углеводов.
Заключение
АФК постоянно образуются и являются необходимым компонентом жизнедеятельности клеток и организма в целом. Они принимают участие во многих метаболических и регуляторных процессах. Условием осуществления всех этих процессов является поддержание физиологического уровня АФК за счет функционирования АОС. Наличие в организме многочисленных антиоксидантных соединений обеспечивают высокую базальную буферную емкость АОС, которая может быть существенно увеличена, например, за счет протеолитиче-ской деградации. АФК и АОС образуют редокс-гомеостатическую систему, обеспечивающую возможность функционального ответа на сигнал. Для поддержания физиологического уровня АФК требуется постоянная регенерация различных компонентов АОС, а это активные энергоемкие процессы, требующие согласованной работы на всех уровнях организма, клеток, клеточных структур и генов.
Эволюционно сформированный редокс-
гомеостаз представляет собой саморегулирующуюся систему. Это означает, что изменение любого из её компонентов ведет к дисбалансу, который, в свою очередь, приводит к компенсаторным реакциям на локальном уровне.
На сегодняшний день нет сомнений, что непосредственное действие АФК может быть пагубным для клетки в связи с окислительным повреждением липидов, белков и ДНК.
Конечными продуктами этого окисления являются гидроперекиси липидов, карбонилирован-ные белки [23] и окисленные основания ДНК (например, 7,8-дигидро-8 -оксогуанин [16]). Однако наводнение системы антиоксидантами или гиперэкспрессия антиоксидантных ферментов могут быть столь же пагубны, как и чрезмерное воздействие свободных радикалов.
Неспецифичность и распространенность окислительного стресса в клетках организма приводит к использованию энергетических субстратов и жизненно необходимых белковых молекул для сбалансирования редокс-системы, и, в зависимости от длительности окислительного стресса и функциональных резервов АОС, в итоге приводит к истощению репарационных и адаптационных возможностей организма. В клинике это проявляется множественными осложнениями при лечении заболевания: когда за успешной коррекцией одного состояния неизбежно идет череда других опасных осложнений, медикаментозная коррекция которых порой является взаимоисключающей.
Интенсификация окисления с участием АФК, расцениваемая как окислительный стресс, может быть проявлением различных процессов происходящих в клетках: интенсификация метаболизма, мобилизация защитных сил, разрушение и гибель клеток. Для адекватной оценки окислительного стресса необходимо динамическое наблюдение за происходящими процессами.
Клиницисту необходимо знать, в какие процессы, происходящие в организме, приходится вмешиваться, и реально оценивать возможные реакции организма. Знание физиологии процесса позволяет выявлять конкретные изменения при различных видах патологии и разрабатывать индивидуальную программу коррекции.
Проведенный анализ литературы показал физиологическую значимость окислительных процессов и позволил сформулировать ряд клинических вопросов:
1. Возможна ли коррекция недостаточности эндогенных антиоксидантов экзогенными препаратами? В каких случаях эффективны антиоксиданты, в каких прооксиданты?
2. Взаимозаменяемы ли анти/прооксиданты различных групп?
3. Как решить вопрос доставки необходимого анти/прооксиданта к конкретным клетками или внутриклеточным структурам?
Литература
1. ТарусовБ.Н. Основы биологического действия радиоактивных излучений. - М.: Медгиз, 1954. - 140 с.
2. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. - 2002. - 61(3).
- C. 339-52.
3. Balaban R.S, Nemoto S., Finkel T. Mitochondria, oxidants, and aging // Cell. - 2005. - 120(4). - Р. 483-95.
4. Bienert G.P., M0ller A.L., Kristiansen K.A. et al. Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes // J Biol Chem. - 2007. - 282(2). - P. 1183-92.
5. Browning J.D.; Horton J.D. Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury // J. Clin. Invest. -
2004. - 114. - Р. 147-52.
6. Christman M.F., Storz G., Ames B.N. OxyR, a positive regulator of hydrogen peroxide-inducible genes in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, is homologous to a family of bacterial regulatory proteins // Proc Natl Acad Sci USA. - 1989. - 86. - P. 3484-8.
7. Commoner B, Townsend J, Pake G.E.. Free radicals in biological materials // Nature. - 1954. - 174. - P.
689-91.
8. Davies K.A., Goldberg A.L Oxygen radicals stimulate intracellular proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erythrocytes // J Biol Chem. - 1987. - 262. - P. 8220-6.
9. Davies K.J., Lin S. W., Pacifici R.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein // J Biol Chem. - 1987. - 262(20). - P. 9914-20.
10. Dro ge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function // Physiol Rev. - 2002. - 82. - P. 47-95.
11. Dukan S., Farewell A., Ballesteros M. et al. Protein oxidation in response to increased transcriptional errors // Proc Natl Acad Sci USA. - 2000. - 97. - P. 5746-9.
12. Forman H.J., Fukuto J.M., Torres M. Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and
nitrogen species can act as second messengers // Am J Physiol Cell Physiol. - 2004. - 287(2). - P. 246-56.
13. Gaudu P., Weiss B. SoxR, a [2Fe-2S] transcription factor, is active only in its oxidized form // Proc Natl Acad Sci USA. - 1996. - 93. - P. 10094-8.
14. Godon C., Lagniel G., Lee J. et al. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem. - 1998.
- 273. - P. 22480-9.
15. Grune T., Reinheckel T., Davies K.J.A. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells // FASEB J. -1997. - 11. - P. 526-34.
16. Haghdoost S., Sjolander L., Czene S., Harms-Ringdahl M. The nucleotide pool is a significant target for
oxidative stress // Free Radic Biol Med. - 2006. - 41(4). - P. 620-6.
17. Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry // J Gerontol. - 1956. - 11. - P. 298-300.
18. Hehner S.P., Breitkreutz R., Shubinsky G. et al. Enhancement of T cell receptor signaling by a mild oxidative shift in the intracellular thiol pool // J Immunol. - 2000. - 165. - P. 4319-28.
19. Lambeth J.D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen // Nat. Rev. Immunol. - 2004. - 4. - P. 181-9.
20. Lee I.M., Cook N.R., Manson J.E. Beta-carotene supplementation and incidence of cancer and cardiovascular disease: Women’s Health Study // J Natl Cancer Inst. - 1999. - 91. - P. 2102-6.
21. Leonarduzzi G., Sottero B., Poli G. Targeting tissue oxidative damage by means of cell signaling modulators: the antioxidant concept revisited // Pharmacol Ther. - 2010. - 128(2). - P. 336-74.
22. Mahadev K., Motoshima H., Wu X. et al. The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulin-stimulated generation of H2O2 and plays an integral role in insulin signal transduction // Mol. Cell. Biol. -2004. - 24. - P. 1844-54.
23. Moskovitz J., Oien D.B. Protein carbonyl and the methionine sulfoxide reductase system // Antioxid Redox Signal. - 2010. - 12(3). - P. 405-15.
24. Musi N., Goodyear L.J. Insulin resistance and improvements in signal transduction // Endocrine. - 2006. -29(1). - P. 73-80.
25. Omenn G.S., Goodman G., Thomquist M. et al. The beta-carotene and retinol efficacy trial (CARET) for chemoprevention of lung cancer in high risk populations: smokers and asbestos-exposed workers // Cancer Res. - 1994. - 54 (7 Suppl). - P. 2038s-43s.
26. Pani G., Bedogni B., Colavitti R. et al. Cell compartmentalization in redox signaling // IUBMB Life. - 2001.
- 52(1). - P. 7-16.
27. Pletjushkina O.Y., Fetisova E.K., Lyamzaev K.G. et al. Long-distance apoptotic killing of cells is mediated by hydrogen peroxide in a mitochondrial ROS-dependent fashion // Cell Death Differ. - 2005. - 12(11). - P. 1442-4.
28. Schafer F.Q.; Buettner G.R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple // Free Radic. Biol. Med. - 2001. - 30. - P. 1191-212.
29. Schnell N., Krems B., Entian K.D. The PAR1 (YAP1/SNQ3) gene of Saccharomyces cerevisiae, a c-jun homologue, is involved in oxygen metabolism // Curr Genet. - 1992. - 21. - P. 269-73.
30. Shah B.H., Catt K.J. A central role of EGF receptor transactivation in angiotensin II -induced cardiac hypertrophy // Trends Pharmacol Sci. - 2003. - 24(5). - P. 239-44.
31. Sies H. Strategies of antioxidant defense // Eur J Biochem. - 1993. - 215. - P. 213-9.
32. SlundF., ZhengM., Beckwith J., Storz G. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulfide status // Proc Natl Acad Sci USA. - 1999. - 96. - P. 6161-5.
33. Sun H., Tonks N.K. The coordinated action of protein tyrosine phosphatases and kinases in cell signaling // Trends Biochem. Sci. - 1994. - 19. - P. 480-5.
34. Thannickal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2000. - 279(6). - P. 1005-28.
35. Tirosh A., Potashnik R., Bashan N., Rudich A. Oxidative stress disrupts insulin-induced cellular redistribution of insulin receptor substrate-1 and phosphatidylinositol 3-kinase in 3T3-L1 adipocytes. A putative cellular mechanism for impaired protein kinase B activation and GLUT4 translocation // J Biol Chem. - 1999.
- 274(15). - P. 10595-602.
36. Wang D., Yu X., Cohen R.A., Brecher P. Distinct effects of N-acetylcysteine and nitric oxide on angiotensin II-induced epidermal growth factor receptor phosphorylation and intracellular Ca(2+) levels // J Biol Chem.
- 2000. - 275(16). - P. 12223-30.
37. ZhengM., Storz G. Redox sensing by prokaryotic transcription factors // Biochem Pharmacol. - 2000. - 59.
- P. 1-6.
