CC BY
84
УДК 582.665.11:577.19 (571.1)
ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ATRAPHAXIS FRUTESCENS (L.) C. KOCH, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В СИБИРИ
© В.А. Костикова, Т.А. Кукушкина, Д.К. Костиков
Центральный сибирский ботанический сад СО РАН,
630090, Россия, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101, [email protected]
Проведено фитохимическое изучение Atraphaxis frutescens (курчавка кустарниковая) из природных популяций Сибири. В листьях обнаружено более высокое содержание дубильных веществ (до 16,3%), каротиноидов (до 152,4 мг%) и пектинов (до 0,9%) по сравнению с соцветиями и стеблями. Содержание протопектинов неодинаково в исследованных популяциях: у A. frutescens из Новосибирской области их оказалось больше в соцветиях (3,2%), а из Алтайского края и Республики Тыва - в листьях (до 7%). В соцветиях A. frutescens содержание катехинов более высокое (до 3,8%), чем в листьях и стеблях. При изучении состава фенольных соединений в листьях A. frutescens методом ВЭЖХ идентифицированы 6 веществ - хлорогеновая кислота, кверцетин, кемпферол, изо-кверцитрин, рутин и астрагалин. A. frutescens из Республики Тыва отличается от растений из Новосибирской области и Алтайского края наличием рутина и других дополнительных соединений в экстрактах из листьев, а также более высоким содержанием хлорогеновой кислоты, астрага-лина и кемпферола.
Ключевые слова: Atraphaxis frutescens; ВЭЖХ; дубильные вещества; каротиноиды; катехины; пектиновые вещества; хлорогеновая кислота; кверцетин; кемпферол; изокверцитрин; рутин и аст-рагалин.
PHYTOCHEMICAL INVESTIGATION OF ATRAPHAXIS FRUTESCENS (L.) C. KOCH, GROWING IN SIBERIA
V.A. Kostikova, Т.А. Kukushkina, D.K. Kostikov
Central Siberian Botanical Garden SB RAS,
101, Zolotodolinskaya St., Novosibirsk, 630090, Russia, [email protected]
Phytochemical study of Atraphaxis frutescens from natural populations of Siberia is carried out. Higher content of tannins (up to 16,3%), carotenoids (up to 152,4 mg%) and pectins (up to 0,9%) is revealed in leaves, in comparison with inflorescences and stems. The content of protopectins in the studied populations is unequal: A. frutescens from Novosibirsk region contains major portion of protopectins in inflorescences (up to 3,2%), whereas from Altai region and the Republic of Tyva - in leaves (up to 7%). The inflorescences of A. frutescens contain more catechines (up to 3,8%), than leaves and stems. The six phenolic compounds (chlorogenic acid, quercetin, kaempferol, rutin, isoquercitrin and astragalin) were identified in the leaves of A. frutescens by HPLC method. Extracts from A. frutescens leaves from the Republic of Tyva differ in presence of the rutin and other additional compounds, and also higher content of chlorogenic acid, astragalin and kaempferol.
Keywords: Atraphaxis frutescens; HPLC; tannins; carotenoids; catechins; pectins; chlorogenic acid; quercetin; kaempferol; rutin; isoquercitrin; astragalin.
ВВЕДЕНИЕ
Растения являются уникальным природным источником различных классов вторичного метаболизма, таких как флавоноиды, тер-пеноиды, фенолкарбоновые кислоты, сапонины, которые необходимы для поддержания жизнедеятельности человека и животных. Поиск новых источников биологически активных веществ (БАВ) среди представителей местной флоры является важным этапом в исследова-
ниях ресурсного значения.
Растения рода Atraphaxis Ь. проявляют антибактериальную и антиоксидантную активность, используются как красильные, дубильные, жирно-масличные, кормовые и медоносные, их побеги применяют при диарее [10, 15]. Комплекс БАВ растений рода Atraphaxis обуславливает их полезные свойства. В надземных и подземных органах идентифицированы фла-вонолы, флаваны, флавоны, антрахиноны, фе-
нолкарбоновые кислоты и их производные, дубильные вещества, алкалоиды [2, 9, 10, 13, 15].
Atraphaxis frutescens (L.) C. Koch - кур-чавка кустарниковая, кустарник до 70 см высотой. Ветки тонкие, не колючие. Листья от узколанцетовидных до продолговато-обратнояйце-видных, острые. Цветочные кисти конечные. Плод - орешек тёмно-бурый, блестящий. Растет одиночно, иногда группами в степных и полупустынных котловинах горных районов, хорошо переносит избыточное засоление почв, типичный ксерофит или ксерофит-петрофит. Распространен в Европе, Средней Азии, Сибири, Монголии и Китае [4]. Состав биологически активных веществ, содержащихся в A. frutescens, мало изучен.
Цель работы - исследование состава и содержания биологически активных веществ в надземных органах A. frutescens из природных популяций.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Содержание БАВ в листьях, соцветиях и стеблях A. frutescens определяли в образцах из 3 природных популяций Сибири, собранных в 2013-2014 гг. в фазе конца цветения - начала образования плодов (таблица).
Содержание катехинов, танинов, кароти-ноидов определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-26, пектиновых веществ - на спектрофотометре Agilent 8453. Метод определения катехинов основан на их способности давать малиновое окрашивание с раствором ванилина в концентрированной соляной кислоте. Пересчетный коэффициент рассчитывали по (±)-катехину [7]. Количественное определение танинов (гидроли-зуемых дубильных веществ) проводили по описанной ранее методике [11]. Расчет содержания производили по стандартному образцу ГСО танина. Каротиноиды определяли в аце-тоново-этанольном экстракте [6]. Замеры и расчеты содержания каротиноидов проводили при длинах волн 662, 644 нм (для хлорофилла а и б) и 440,5 нм (для каротиноидов) [3]. Пектиновые вещества (протопектины и пектины) определяли бескарбазольным методом. График строили по галактуроновой кислоте [5]. Экстракцию для определения содержания пектиновых веществ проводили по методике Ермакова [3].
Для хроматографического исследования фенольных соединений использовали этаноль-ные (40%) извлечения из сырья, полученные экстракцией на водяной бане [2]. Для анализа проб применяли аналитическую ВЭЖХ-сис-тему, состоящую из жидкостного хроматографа Agilent 1200 с диодноматричным детектором и
системы для сбора и обработки хро-матографических данных ChemStation. Разделение проводили на колонке Zorbax SB-C18, размером 4,6 * 150 мм, с диаметром частиц 5 мкм, при градиентном режиме элюирования. Для приготовления стандартных образцов хлорогеновой кислоты, кверцетина, кемпфе-рола, изокверцитрина, рутина и астрагалина применяли препараты фирмы Fluka и Sigma. Вещества идентифицировали методом сравнения времени удерживания пиков веществ на хроматограммах анализируемых образцов со временем удерживания пиков стандартных образцов и УФ-спектров. Количественное определение индивидуальных компонентов в образцах растений проводили по методу внешнего стандарта. Содержание индивидуальных компонентов (Сх) вычисляли по формуле (в мг/г):
Сх = Сст х S1 х V1 х V2 / S2 x M x V3 x 1000,
где Сст - концентрация соответствующего стандартного раствора флавонола (мкг/мл); S1 - площадь пика флавонола в анализируемой пробе (е.о.п.); S2 - площадь пика стандартного флавонола (е.о.п.); V1 - объем элюата после вымывания флавонолов с концентрирующего патрона (мл); V2 - общий объем экстракта (мл); V3 - объем экстракта, взятый на анализ; М - масса навески (г); 1000 - пересчетный коэффициент.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Фитохимическое изучение A. frutescens, произрастающего в Сибири, показало, что надземные органы растения содержат ценные БАВ: катехи-ны, танины, каротиноиды, пектиновые вещества (пектины и протопектины) (см. таблицу).
В листьях обнаружено более высокое содержание дубильных веществ (до 16,3%), каротиноидов (до 152,4 мг%) и пектинов (до 0,9%) по сравнению с соцветиями и стеблями. Каротиноиды защищают клетки от окислительного повреждения, являются эффективными протекторами зрения, препятствуют развитию сердечно-сосудистых заболеваний и рака, в медицине используются главным образом для профилактики и лечения авитаминоза А [14]. Растения, содержащие дубильные вещества, используют как вяжущие, противовоспалительные, кровоостанавливающие и бактерицидные средства [8]. Пектиновые вещества в растениях присутствуют в растворимой (пектин) и нерастворимой (протопектин) форме. Они используются в основном в пищевой промышленности в качестве желеобразователей. Вместе с тем, пектиновые вещества способны
Содержание основных групп БАВ в А. Гг^езсепв (% от абсолютно сухой массы)
Место сбора, местообитание, Орган Дубильные Катехины Кароти- Пектины Прото-
дата сбора вещества ноиды, мг% пектины
Новосибирская область, Ордынский соцветия 10,0 1,1 23,8 0,5 3,2
р-н, берег р. Обь, окр. с. Антоново; 13,8 0,3 146,8 0,5 2,8
степной песчано-глинистый южный листья
склон, выс. 109 м; 11.07.2013 г. стебли 1,5 0,2 7,7 0,4 2,1
Алтайский край, Бурлинский р-н, соцветия 9,6 1,1 12,1 0,6 3,6
берег оз. Большое Топольное, листья 15,3 0,2 37,3 0,8 4,7
окр. с. Петровка; степь, выс. 99 м;
13.07.2013 г. стебли 2,5 0,2 4,1 0,7 4,3
Республика Тыва, Пий-Хемский р-н, соцветия 15,5 3,8 28,9 0,7 6,6
Уюкский хр., берег р. Енисей, листья 16,3 0,3 152,4 0,9 7,0
окр. г. Кызыл; степь, выс. 645 м;
09.07.2014 г. стебли 5,2 0,6 11,7 0,8 5,4
проявлять лечебные и профилактические свойства при ряде заболеваний. Особенно ценится свойство пектинов связывать тяжёлые металлы и выводить их из организма, в том числе и радионуклиды [12]. Содержание протопектинов неодинаково в растениях из разных популяций: у A. frutescens из Новосибирской области их оказалось больше в соцветиях (3,2%), а из Алтайского края и Республики Тыва - в листьях (до 7,0%). В соцветиях A. ^и-tescens содержание катехинов более высокое (до 3,8%), чем в листьях и стеблях. Катехины проявляют Р-витаминную активность, укрепляя стенки кровеносных сосудов в организме человека и животных, обладают антибактериальными и антиоксидантными свойствами [1]. В растениях из Республики Тыва, в отличие от растений из других исследуемых популяций, содержание практически всех веществ выше.
В стеблях содержится меньше веществ, чем в листьях и соцветиях. Однако содержание некоторых веществ достаточно высокое -протопектинов (до 5,4%) и дубильных веществ (до 5,2%).
Согласно литературным данным, в A. ^и-tescens обнаружены фенолкарбоновые кислоты - галловая и дигидробензойная, а также флавонолы - кемпферол, кверцетин, астрага-лин, изокверцитрин, изомирицитрин, рутин, 3-О-рутинозид мирицетина [2, 9, 13]. При изучении состава фенольных соединений в листьях A. frutescens методом ВЭЖХ идентифицированы хлорогеновая кислота и 5 флавонолов -кверцетин, кемпферол, рутин, изокверцитрин и астрагалин (рис. 1 и 2).
В листьях растений из Республики Тыва обнаружено 14 фенольных соединений, тогда как в растениях из Новосибирской области -10 соединений, а из Алтайского края - 8 (см. рис. 1). Рутин содержится только в экстрактах листьев А. frutescens из Республики Тыва.
Остальные идентифицированные вещества обнаружены у всех растений и являются основными соединениями экстрактов из листьев.
Анализ соотношения содержания идентифицированных веществ показал, что в листьях растений из Новосибирской области преобладает изокверцитрин (0,86 мг/г) и астрагалин (0,29 мг/г) (см. рис. 2). В А. frutescens из Алтайского края содержится больше изокверцитрина (0,71 мг/г), хлорогеновой кислоты (0,15 мг/г) и астрага-лина (0,14 мг/г). В растениях из Республики Тыва больше содержится астрагалина (0,44 мг/г), кемпферола (0,40 мг/г), рутина (0,38 мг/г) и изокверцитрина (0,32 мг/г). В целом можно сказать, что растения из Республики Тыва отличается от растений из Новосибирской области и Алтайского края наличием в экстрактах из листьев рутина и других дополнительных соединений, а также более высоким содержанием всех идентифицированных веществ, кроме кверцетина и изокверцитрина. Существует мнение, что фенольные соединения накапливаются в ответ на различные стрессовые условия, в том числе и экологические [1]. Растения из Республики Тыва произрастают на большей высоте над уровнем моря по сравнению с остальными исследованными растениями. Флавоноиды обеспечивают биохимическую адаптацию А. frutescens в условиях резко континентального климата Республики Тыва, где уровень инсоляции выше, чем в Новосибирской области и Алтайском крае.
ВЫВОДЫ
В результате исследований биологически активных веществ, содержащихся в надземных органах А. frutescens из природных популяций Сибири, выявлено достаточно высокое их содержание. Листья А. 1rutescens могут быть источником дубильных веществ (до 16,3%), кароти-ноидов (до 152,4 мг%), пектинов (до 0,9%); соц-
Рис. 1. ВЭЖХ-хроматограмма водно-этанольных экстрактов из листьев Д^арЬах1з &Мезсепз (см. таблицу): По оси ординат - оптическая плотность. По оси абсцисс - время удерживания, мин. Обозначения: 1 - хлорогеновая кислота; 2 - изокверцитрин; 3 - рутин; 4 - астрагалин;
5 - кверцетин; 6 - кемпферол
ветия - катехинов (до 3,8%) и протопектинов (до 7%). В растениях из Республики Тыва, в отличие от растений из других исследуемых популяций, содержание практически всех веществ выше.
Методом ВЭЖХ в листьях А. Мезсвпв идентифицированы хлорогеновая кислота и 5 флавонолов - кверцетин, кемпферол и их гликозиды рутин, изокверцитрин и астрагалин. Резко континентальный климат Республики
Тыва способствует большему накоплению соединений фенольного типа в листьях А. &и-tesceпs. Растения из Республики Тыва отличаются от растений из Новосибирской области и Алтайского края наличием в экстрактах из листьев рутина и дополнительных соединений, а также более высоким содержанием всех идентифицированных веществ, кроме изоквер-цитрина и кверцетина.
Рис. 2. Содержание фенольных веществ в экстрактах из листьев А. frutescens: По оси ординат - содержание веществ, мг/г от воздушно-сухой массы. По оси абсцисс -место сбора: 1 - Новосибирская область; 2 - Алтайский край; 3 - Республика Тыва
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Бахтенко Е.Ю., Курапов П.Б. Многообразие вторичных метаболитов высших растений: учебное пособие. Вологда: МакросПринт, 2008. 264 с.
2. Высочина Г.И. Фенольные соединения в систематике и филогении семейства гречишных. Новосибирск: Наука, 2004. 240 с.
3. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. 429 с.
4. Коропачинский И.Ю., Встовская Т.Н. Древесные растения Азиатской России. Новосибирск: Гео, 2002. 707 с.
5. Кривенцов В.И. Бескарбазольный метод количественного спектрофотометрического определения пектиновых веществ // Труды Никитского ботанического сада. 1989. Т. 109. С. 128-137.
6. Кривенцов В.И. Методические рекомендации по анализу плодов на биохимический состав. Ялта: Госуд. Никитский бот. сад, 1982. 21 с.
7. Кукушкина Т.А., Зыков А.А., Обухова Л.А. Манжетка обыкновенная (Alchemia vulgaris L.) как источник лекарственных препаратов природного происхождения // Материалы VII международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб., 2003. С. 64-69.
8. Мальцева А.А. Количественное определение дубильных веществ в траве горца почечуйного // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация.
2013. № 2. C. 203—205.
9. Омуркамзинова В.Б. Фенольные соединения некоторых растений рода Atraphaxis L.: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Алма-Ата, 1978. 22 с.
10. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Magnoliaceae-Limoniaceae. Л.: Наука, 1984. 460 с.
11. Федосеева Л.М. Изучение дубильных веществ подземных и надземных вегетативных органов бадана толстолистного (Bergenia Crassifolia (L.) Fitsch.), произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья. 2005. № 2. С. 45-50.
12. Хотимченко Ю.С., Кропотов А.В., Хотим-ченко М.Ю. Фармакологические свойства пектинов // Эфферентная терапия. 2001. Т. 7, № 4. С. 22-36.
13. Чумбалов Т.К., Омуркамзинова В.Б. Полифенолы Atraphaxis frutescens. III. // Химия природ. соединений. 1975. № 3. С. 424.
14. Johnson E.A. The role of carotenoids in human health // Nutrition in Clinical Care. 2002. Vol. 5. P. 56-65.
15. Nakano H, Schrader K.K., Mamonov L.K., Kustova T.S., Mursaliyeva V.K., Cantrell C.L. Isolation and Identification of Flavobacterium columnare and Streptococcus iniae Antibacterial Compounds from the Terrestrial Plant Atraphaxis aetevirens // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2012. Vol. 60. P. 10415-10419.
REFERENCES
1. Bakhtenko E.Yu., Kurapov P.B. Mnogoobrazie vtorichnykh metabolitov vysshikh rastenii [Variety of secondary metabolites of the higher plants]. Vologda, MakrosPrint Publ., 2008, 264 p.
2. Vysochina G.I. Fenol'nye soedineniya v siste-matike i filogenii semeistva grechishnykh [Phenolic compounds in systematics and phylogeny of the family Polygo-naceae Juss.]. Novosibirsk, Nauka Publ., 2004, 240 p.
3. Ermakov A.I., Arasimovich V.V., Yarosh N.P. [et al.] Metody biokhimicheskogo issledovaniya rastenii [Methods of biochemical research of plants]. Leningrad, Agropromizdat Publ., 1987, 429 p.
4. Koropachinskii I.Yu., Vstovskaya T.N. Dreves-nye rasteniya Aziatskoi Rossii [Woody plants of the Asian Russia]. Novosibirsk, Geo Publ., 2002, 707 p.
5. Kriventsov V.I. Beskarbazol'nyi metod koliche-
estvennogo spektrofotometricheskogo opredeleniya pek-tinovykh veshchestv [Without karbazole method of quantitative spectrophotometry determination of pectic substances]. Trudy Nikitskogo botanicheskogo sada - Proc. of the Nikitsky botanical garden, 1989, vol. 109, pp. 128137.
6. Kriventsov V.I. Metodicheskie rekomendatsii po analizu plodov na biokhimicheskii sostav [Methodical recommendations for the analysis of the biochemical composition of fruits]. Yalta, Gosud. Nikitskii bot. sad Publ., 1982, 21 p.
7. Kukushkina T.A., Zykov A.A., Obukhova L.A. Manzhetka obyknovennaya (Alchemia vulgaris L.) kak istochnik lekarstvennykh preparatov prirodnogo pro-iskhozhdeniya [Lady's mantle (Alchemilla vulgaris L.) as a source of the medicinal preparations]. Materialy VII mezhdunarodnogo s"ezda «Aktual'nye problemy soz-daniya novykh lekarstvennykh preparatov prirodnogo proiskhozhdeniya» [Proc. Vll-th Int. Congress "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin"]. St. Petersburg, 2003, pp. 64-69.
8. Mal'tseva A.A. Kolichestvennoe opredelenie dubil'nykh veshchestv v trave gortsa pochechuinogo [Quantitative definition of tannins in a grass of the Gorec pochechuyny]. Vestnik VGU, seriya: khimiya, biologiya, farmatsiya - Bulletin of the VSU, series: chemistry, biology, pharmacy, 2013, no. 2, pp 203-205.
9. Omurkamzinova V.B. Fenol'nye soedineniya nekotorykh rastenii roda Atraphaxis L. Avtoref. dis. kand. khim. nauk [Phenolic compounds of some plants of the genus Atraphaxis L. Autor's abstract of PhD thesis ]. Alma-Ata, 1978, 22 p.
10. Rastitel'nye resursy SSSR: tsvetkovye ras-
teniya, ikh khimicheskii sostav, ispol'zovanie. Semeistva Magnoliaceae - Limoniaceae [Plant resources of the USSR: flowering plants, their chemical composition, use. Family Magnoliaceae - Limoniaceae]. Leningrad, Nauka Publ., 1984, 460 p.
11. Fedoseeva L.M. Izuchenie dubil'nykh veshchestv podzemnykh i nadzemnykh vegetativnykh or-ganov badana tolstolistnogo (Bergenia Crassifolia (L.) Fitsch.), proizrastayushchego na Altae [The study of tannins of underground and aboveground vegetative organs of the Bergenia Crassifolia (L.) Fitsch., growing in Altai]. Khimiya rastitel'nogo syr'ya - Chemistry of plant raw material, 2005, no. 2, pp. 45-50.
12. Khotimchenko Yu.S., Kropotov A.V., Kho-timchenko M.Yu. Farmakologicheskie svoistva pektinov [Pharmacological properties of the pectins]. Efferentnaya terapiya - Efferent therapy, 2001, vol. 7, no. 4, pp. 22-36.
13. Chumbalov T.K., Omurkamzinova V.B. Polifenoly Atraphaxis frutescens. Ill [Polyphenols of Atraphaxis frutescens. Ill]. Khimiya prirodykh soedinenii -Chemistry of Natural Compounds, 1975, no. 3, p. 424.
14. Johnson E.A. The role of carotenoids in human health. Nutrition in Clinical Care, 2002, vol. 5, pp. 56-65. Cited 253 times. doi:10.1046/j.1523-5408.2002.00004.x.
Nakano H, Schrader K.K., Mamonov L.K., Kustova T.S., Mursaliyeva V.K., Cantrell C.L. Isolation and Identification of Flavobacterium columnare and Streptococcus iniae Antibacterial Compounds from the Terrestrial Plant Atraphaxis laetevirens. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, vol. 60, pp. 10 415-10 419. Cited 3 times. doi: 10.1021/jf.304155.n.
Статья поступила в редакцию 2.11.2015 г.
УДК 581.1:581.19:547
ПОВЫШЕНИЕ ХОЛОДОСТОЙКОСТИ ПРОРОСТКОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ОБРАБОТКЕ СЕМЯН ТЕБУКОНАЗОЛОМ
Л О Л Л о
© А.В. Корсукова1'2, О.А. Боровик1, О.И. Грабельных1'2, Н.В. Дорофеев1, Т.П. Побежимова1, В.К. Войников1
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, [email protected]
2 Иркутский государственный университет, 664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.
Цель работы - изучение влияния тебуконазола на холодоустойчивость яровой пшеницы (Тпйоит aestivum L.) и механизмы, связанные с её формированием. Исследования проводились в лабораторных условиях на сорте яровой пшеницы Новосибирская 29. Показано, что тебуконазол-содержащий протравитель семян «Бункер» (по препарату 1,5 мкл/г семян) повышает холодоустойчивость этиолированных проростков яровой пшеницы. Это сопряжено с торможением ростовых процессов,
