CC BY
45
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
«НАУКА- ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ». №2,2015
удк 631.46 Берсенева О. A. [Berseneva О. А.]
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКОБИОТЫ КАК ИНТЕГРАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПОЧВ В ЗОНЕ ВЛИЯНИЯ МЕТАЛЛУРГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ
The enzymatic activity of micobiota as an integral indicator of the ecological condition of the soil in the zone of influence of metallurgical plants
Проведен сравнительный анализ ферментативной активности почвенных микосообществ в районе действия аэропромвыбросов Иркутского алюминиевого завода и естественных местообитаний Прибайкальского региона. Установлено, что ферментативная активность штаммов, выделенных из контрольной почвы, выше, чем у штаммов, изолированных из опытных почв. В опытных почвах ферментативно активных штаммов выявлено больше среди представителей pp. Aspergillus и Pénicillium, что свидетельствует о их более высокой эврифагности, по сравнению с другими культурами микроскопических грибов, выделенных из опытных почв. Определена доля разных видов ферментативной активности. Выявлено, что доля положительных результатов теста увеличивается по мере удаления от промышленного узла. Показана возможность и необходимость применения ферментативной активности почвенных микосообществ для оценки степени техногенного загрязнения наземных экосистем.
Ключевые слова: Микобиота, экологическое состояние почв, аэро-промвыбросы. ферментативная активность, серые лесные почвы.
A comparative analysis of the enzymatic activity of soil micocommunities in the zone of influence of air industrial emissions of Irkutsk aluminum plant and natural habitats Baikal region is implemented. It was established that the enzyme activity of the strains isolated from the soil test, higher than that of the strain experienced isolation from soil. In the experimental soils enzymatically active strains revealed greater among the genera Aspergillus and Pénicillium, indicating their higher evrifagnosti, compared with other cultures of microscopic fungi. The share different types of enzymatic activity are determined. It was found that the percentage of positive test results increases with distance from the industrial unit. The possibility of using the enzymatic activity of soil micocommunities to assess the degree oftechnogenic pollution of terrestrial ecosystems is showed.
Key words: Micobiota, ecological condition of the soil, air industrial emissions, enzymatic activity, grey forest soils.
В настоящее время особенно остро возникает проблема техногенного загрязнения наземных экосистем, прилегающих к химическим предприятиям. Серьезную опасность представляют комбинаты по выпуску алюминия.
Выбросы предприятий алюминиевой промышленности оказывают значительное воздействие на состав и свойства почв, что отражается на здоровье населения, проживающего в зоне загрязнения [1, 2, 8]. Известно, что формирование почвенного микробного сообщества тесно связано со свойствами почв, что дает возможность использовать показатели почвенных микроорганизмов для оценки степени техногенного загрязнения наземных экосистем [4, 6]. Одним из возможных маркеров в исследованиях экологического состояния почв может являться ферментативная активность почвенной микобиоты.
Цель нашего исследования: изучить ферментативную активность микобиоты, обитающей в условиях загрязнения почвы аэропромвыброса-ми ОАО «ИркАЗ-РУСАЛ».
Материалы и методы
Для изучения микобиоты использовали образцы серых лесных почв, которые отбирали с опытных площадок на расстоянии 0,5; 5; 15 и 25 км, расположенных вдоль градиента аэропромвыбросов ОАО «Ир-кАЗ - РУСАЛ» (рис. 1).
Участок, находящийся на расстоянии 25 км, служил контролем, поскольку был расположен вне зоны загрязнения, о чем свидетельствуют результаты исследований И. А. Белозерцевой (2002), согласно которым изменения физико-химического состава почв, связанные с выбросами предприятия, не прослеживаются, начиная с 25 км от источника воздействия по факелу выбросов [3].
Выделение микромицетов из почв осуществляли методом посева почвенной суспензии на селективные среды [8].
Общее количество микромицетов учитывалось на среде сусло-агар, включающей пивное неохмеле иное сусло - 150 г; агар-агар - 15 г; водопроводная вода - 1000 мл. рН среды доводили до 5,0.
Учет целлюлозоразрушающих микромицетов проводили на среде Чапека, состоящей из следующих компонентов: агар-агар - 3 г; целлюлоза - 1 г; глюкоза - 0,5 г; водопроводная вода - 1000 мл рН среды устанавливали до 5,0. Для поддержания чистых культур применяли среду сусло-агар.
Стерилизацию питательных сред осуществляли автоклавированием при 1 атм. в течение 20 мин.
Полученные чистые культуры микромицетов идентифицировали классическими методами почвенной микробиологии путем проведения
Ч
\
Рис. 1. Место отбора почвенных образцов. 1-0,5 км от ОАО «ИркАЗ-РУСАЛ» (г. Шелехов), 2 - в районе поселка Олха (5 км), 3 - граница Иркутского и Шелеховского района (15 км), 4 - в районе поселка Большой Луг (25 км). Стрелками показана роза ветров.
культурально-морфологических и физиолого-биохимических тестов [5]. Определение культур производили, руководствуясь определителями [7, 10].
В ходе экспериментов ферментативную активность чистых культур микромицетов определяли с помощью качественных тестов [9].
Для определения фенолоксидазной активности применяли тест Ба-вендамма. Для этого к агар-солодовой среде добавляли ОД % танин. О вы-
делении фенолоксидаз судили на основании появления коричневой окраски в субстрате вблизи колоний исследуемого микроорганизма.
Активность лецитиназы определяли по наличию мутных зон осветления желточного агара вокруг колоний микроорганизмов. Для этого готовили среду следующего состава (г/л): пептон - 20; Ыа2НРО, - 2,5; \аС1 1: глюкоза - 1; агар - 25; \1gSO, 5 КГ. рН среды доводили до 7,3;
стерилизовали автоклавированием и охлаждали до 60 °С в водяной бане, после чего в асептических условиях добавляли яичный желток,
тщательно перемешивали суспензию и разливали в чашки. Культуры высевали штрихом на поверхность среды и инкубировали в течение 5 суток.
Образование маслянокислого с переливами или перламутрового слоя над колонией или вокруг нее на поверхности желточного агара свидетельствует об активности липазы.
Протеолитическую активность микроорганизмов визуально определяли по образованию просветленных зон или зон разжижения на чашках Петри с твердой средой, приготовленной смешиванием молока с мя-со-пептонным агаром.
Амилолитическую активность определяли по зонам гидролиза крахмала при выращивании микроорганизмов на крахмало-аммиачном агаре. Среду разливали по чашкам Петри и высевали, исследуемые культуры штрихом. Гидролиз крахмала обнаружили при обработке агаровой пластинки раствором Люголя, после чего среда с крахмалом окрашивалась в синий цвет, а зона гидролиза оставалась бесцветной или приобретала красно-бурую окраску.
Для выявления способности микроорганизмов разжижать желатину исследуемые культуры высевали на мясо-пептонную желатину, приготовленную следующим образом: к мясо-пептонному бульону добавляли 15 г желатины, оставляли на 20 минут, чтобы желатина набухла. Затем смесь нагревали на водяной бане до полного растворения желатины и разливали
полученную МПЖ в пробирки по 10 мл, стерилизовали автоклавировани-ем при 0,5 атм 15 мин. Посев проводили уколом. Разжижение желатины или его отсутствие отмечали визуально.
Для определения активности фермента уреазы штаммы высевали на твердую агаризованную среду с 10 г/л мочевины и 2 мг/л 1,6 % спиртового раствора крезолового красного. О наличии фермента судили по появлению красного окрашивания среды через 24 ч роста при 37 °С.
Целлюлазную активность определяли путем высева микроорганизмов на агаризованную питательную среду МПА с карбоксиметилцеллюло-зой (КМЦ), ко валентно связанной со специальным красителем. О наличии активности судили по образованию зон просветления вокруг колоний.
В целях получения достоверных данных каждый опыт проводили в трех повторностях, причем каждое значение, приведенное в главе результаты и обсуждение, есть среднее арифметическое из трех определений.
Долю разных видов ферментативной активности рассчитывали по формуле:
Е= А/В,
где А - количество баллов (положительных результатов теста),
В - количество видов активности.
Результаты и обсуждение
Редуцирующая активность микроорганизмов определяется, прежде всего, особенностями их ферментных систем. В этой связи все выделенные культуры микромицетов были проанализированы на наличие потенциальной активности следующих ферментов: протеазы, жела-тиназы, уреазы, амилазы, лецитиназы, липазы, целлюлазы и фенолокси-дазы. Отмечено, что большой процент штаммов проявил высокую ту или иную ферментативную активность.
Биохимические характеристики штаммов микромицетов представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, протеолитическая активность при росте на молочном агаре отмечается у большинства штаммов, что составляет 84 % от общего количества всех проанализированных культур. При разжижении желатина этот процент был самый низкий - 14 %. Уреазная активность отмечена у 28, лецитиназная - 78 % культур. Липолитические фер-
Табл. 1. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЕННОЙ МИКОБИОТЫ
Расстояние от «ИркАЗ- РУСАЯ»
0,5 км Pénicillium purpurogenum + - + - + +
Aspergillus níger + + + +
Aspergillus flavus + + + +
Verticillium album - + + - - -
5 км Pénicillium funiculosum + _ + _ + +
Aspergillus niger + + + + + +
Pénicillium velutinum + + + +
Tríchoderma koningii + + +
Pénicillium purpurogenum + + + +
Fusarium oxysporium - _ _ + + - - -
15 км Pénicillium sp. + + + +
Aspergillus flavus + + + + + +
Aspergillus niger + + + +
Pénicillium purpurogenum + - + - - +
Pénicillium funiculosum + - + + - +
Rhizopus sp. + ± + - - - _
Chaetomium sp. + +
25 км Tríchoderma viride + + + + +
Pénicillium sp. + + + - + + +
Mucor sp. + + +
Pénicillium funiculosum + + + + +
Tríchoderma koningii + + + + +
Pénicillium velutinum + + + + +
Rhizopus sp. + + + +
Alternaría sp. + + + + + +
Примечание: +; ± (наличие, степень ферментативной активности)
(отсутствие ферментативной активности),
Название вида
Биохимическии тест
Табл. 2. ДОЛЕВОЕ СООТНОШЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Расстояние от Доля разных видов
«ИркАЗ-РУСАЛ» активности
0,5 КМ 31,25%
5 КМ 33,3%
15 КМ 33,42%
25 км 43%
менты были обнаружены у 36 % исследуемых культур микромицетов, а амилолитические у 48 % культур.
Целлюлазная активность выявлена у 64% штаммов, а фенолокси-дазная активность только у одного штамма - Pénicillium sp., выделенного из контрольной почвы. Обычно грибы этого рода не вступают в реакцию с лигнином. Данный же штамм проявлял оксидазную активность на среде с танином (тест Бавендамма), придавая ей четкую коричневую окраску в местах контакта с мицелием, что говорит о способности окислять ароматические соединения.
Долевое соотношение разных видов активности приведено в таблице 2.
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что доля положительных результатов теста увеличивается по мере удаления от промышленного узла.
Кроме того, необходимо отметить, что в опытных почвах фер-ментативно активных штаммов было больше среди представителей pp. Aspergillus и Pénicillium, что свидетельствует о их более высокой эв-рифагности, по сравнению с другими культурами микроскопических грибов, выделенных из опытных почв.
В целом ферментативная активность штаммов, выделенных из контрольной почвы, выше, чем у штаммов, изолированных из опытных почв.
Результаты проведенных исследований могут быть использованы производственными и природоохранными организациями для биоиндикации и диагностики при оценке экологического состояния почв и их загрязнения техногенными поллютантами.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Берсенева O.A., Саловарова В.П. О некоторых особенностях современного состояния почв и почвенной микобиоты в районе аэровыбросов Иркутского алюминиевого завода (ОАО «ИркАЗ-РУ-САЛ») // Вестник РУДН. 2009. № 3. С. 5-9.
2. Берсенева O.A., Саловарова В.П. Воздействие выбросов металлургических производств на почвенные микробиоценозы // Известия Иркутского государственного университета Серия Биология. Экология. №4. 2011. С. 18.
3. Белозерцева И.А. Воздействие техногенных выбросов на почвенный покров верхнего Приангарья // Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов: материалы Российск. науч.-практ. конф. Иркутск, 2002. С. 13.
4. Гузев B.C., Левин C.B. Техногенные изменения сообщества почвенных микроорганизмов // Перспективы развития почвенной биологии. 2001. №5. С. 178-219.
5. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во Моск. гос. ун-та, 1993. С. 16.
6. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 2005.
7. Литвинов М.А. Определитель почвенных микроскопических. Л.: Наука, 1967. С. 45-47.
8. Одинаев Ш.Ф. Состояние здоровья населения в зоне влияния техногенных факторов алюминиевого производства: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.05. Душанбе, 1997.
9. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева ГИ. Практикум по микробиологии. М.: Дрофа, 2004. С.10-15.
10. Watanabe Т. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to species. Florida, 2000. P. 411-415.
ОБ АВТОРЕ Берсенева Оксана Андреевна, кандидат биологических наук,
старший преподаватель кафедры физико-химической биологии ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет». Телефон 8 (3952) 24-18-55. E-mail: [email protected].
Berseneva Oksana Andreevna, PhD in biology, senior lecturer, Irkutsk State University.
Phone 8 (3952) 24-18-55. E-mail: [email protected].
