CC BY
42
УДК: 616.441-006-091.8-076
ферментативная активность гпютатион s-трансферазы р и уровень экспрессии ее гена в опухолевых тканях щитовидной железы человека
С.П. Шевченко12, С.в. Сидоров12, Л.А. Мостович3, П.Ф. Гуляева23,
Е.Л. Чойнзонов4
МБУЗ «Городская клиническая больница № 1», г. Новосибирск1,
Новосибирский государственный университет2 Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск3,
НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск4 630047, г. Новосибирск, ул. Залесского, 6, e-mail: shevchenko_sp@mail.ru1
Исследована экспрессия онкомаркера глютатион S-трансферазы класса Р (GSTP) в тканях диффузно-узлового зоба (ДУЗ) и папиллярного рака щитовидной железы. Для этой цели определена ферментативная активность GSTP с использованием в качестве субстрата этакриновой кислоты (19 больных), а также уровень экспрессии ее гена методом мультиплексной ОТ-ПЦР (30 больных). Показано, что в тканях ДУЗ наблюдается в среднем 2-4-кратное повышение ферментативной активности GSTP у семи из десяти больных, тогда как в случае папиллярного рака эта активность снижается в 1,5-2 раза у восьми пациентов из десяти. Эти результаты подтверждены данными по исследованию уровня экспрессии гена, у большинства больных с ДУЗ наблюдалось повышение уровня экспрессии гена hGSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормой (от 1,35 до 8 раз). В случае рака щитовидной железы чаще наблюдается понижение уровня экспрессии гена hGSTP в опухолевой ткани ЩЖ, в среднем - в 1,5-3 раза.
Ключевые слова: рак щитовидной железы, диффузно-узловой зоб, глютатион S-трансфераза класса Р (GSTP), экспрессия онкомаркера.
ENZYMATIC ACTIVITY OF GLUTHATIONE S-TRANSFERASE P AND GST-P GENE EXPRESSION IN TUMOR
TISSUES OF HUMAN THYROID GLAND S.P. Shevchenko1-2, S.V. Sidorov1-2, L.A. Mostovich3, L.F. Gulyaeva23, E.L. Choynzonov4 Municipal Clinical Hospital № 1, Novosibirsk1 Novosibirsk State University2
Institute of Molecular Biology and Biophysics, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk3 Cancer Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk4 6, Zalesskogo Street, 6340047-Novosibirsk, e-mail: shevchenko_sp@mail.ru1
Expression of glutathione S-transferase P-form (GST-P) in tissues of diffuse-nodular goiter (DNG) and papillary thyroid cancer was studied. Enzymatic activity of GST-P was determined using ethacrynic acid substrate (19 patients) and the level of GST-P gene expression was determined by a multiplex PCR method (30 patients). It was shown that in DNG tissues, 2-4-fold increase in GST-P enzymatic activity was observed in 7 of 10 patients, whereas in cases with papillary thyroid cancer, this activity was 1,5-2-fold decreased in 8 of 10 patients. These results were confirmed by findings on the study of the gene expression level. Most patients with DNG had increased level of hGST-P gene in tumor tissue as compared to the normal limits (from 1,35 to 8 times). In cases of thyroid cancer, decrease in the level of hGST-P gene expression in thyroid tumor tissue was observed more frequently (at the average 1,5-3 times).
Key words: thyroid cancer, diffuse-nodular goiter, glutathione S-transferase P-form (GST-P), oncomarker expression.
Рак щитовидной железы (РЩЖ) является В последние годы отмечается рост заболеваемо-
наиболее часто встречаемой злокачественной сти данной патологией с различным прогнозом
опухолью органов эндокринной системы [7, 15]. [18]. Основная проблема, возникающая перед
С.П. ШЕВЧЕНКО, С.В. СИДОРОВ, Л.А. МОСТОВИЧ И ДР.
58 -------------------------------------------------------------------------------------------------------
Таблица
Праймеры для генов hGSTP, GAPDH и р-актина человека
Ген Последовательности нуклеотидных праймеров Темпера-тура отжига (°C) Размер продуктов ПЦР (п.о).
в-актин Прямой 5'-ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA - 3' 59 298
Обратный 5' - CGG AAC CGC TCA TTG CC - 3' 59
GAPDH Прямой 5'-GGGCGCCTGGTCACCA - 3' 62 350
Обратный 5'-AACATGGGGGCATCAGCAGA - 3' 62
hGSTP Прямой 5’-CATGCTGCTGGCAGATCA-3’ 63 233
Обратный 3’-CATTCACCATGTCCACCAG-3’ 63
онкологами, заключается в сложности диагностики рака щитовидной железы на ранних стадиях и дифференцировке его от доброкачественных новообразований. Поэтому поиск молекулярных маркеров канцерогенеза щитовидной железы является актуальной задачей.
В настоящее время для своевременной диагностики и эффективного лечения злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) активно ведется поиск новых молекулярных маркеров с использованием геномных и про-теиномных подходов [1, 11]. Так, показано, что соматические мутации в 918 кодоне протоонкогена RET, регистрируемые в 25-33 % случаев спорадической медуллярной карциномы, связаны с плохим прогнозом для этого типа рака [5]. Установлено также, что рецепторы тирозин киназ, такие как RET и TRK, также могут быть вовлечены в патогенез рака щитовидной железы, а мутации в онкогене BRAF - наиболее частые генетические изменения в папиллярной тиреоидной карциноме [6]. Такие исследования открывают широкие перспективы для применения таргетной терапии в лечении рака щитовидной железы [16]. Однако эффективность применения таких подходов пока еще трудно оценить. Поэтому актуальным является поиск новых информативных маркеров для дифференциальной диагностики различных типов опухолей щитовидной железы. Известно, что одним из патогенетических механизмов злокачественной трансформации тканей щитовидной железы является нарушение баланса тиреоидных гормонов [2]. Регуляция такого баланса осуществляется ферментативными системами детоксификации ксенобиотиков. Глутатион S-трансфераза класса Р (GSTP), осуществляющая метаболизм как экзогенных, так и эндогенных субстратов, является одним из таких ферментов. В настоящее
время этот фермент рассматривается как важная мишень в диагностике и терапии рака [14]. Однако до сих пор не определена роль, которую играет GSTP в развитии рака щитовидной железы.
Целью настоящей работы является оценка ферментативной активности GSTP и уровня экспрессии ее гена в нормальных и опухолевых тканях щитовидной железы человека для возможного использования ее как маркера опухолей щитовидной железы.
Материал и методы
В работе использовали 49 образцов нормальной и опухолевой тканей щитовидной железы, удаленных в ходе хирургических вмешательств. Все пациенты были женского пола с диагнозом диффузно-узловой зоб (ДУЗ) или папиллярный рак щитовидной железы II стадии. Средний возраст больных составил 47 лет.
Проводимые исследования соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета ГУ НИИ МББ СО РАМН, разработанным в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.03 № 266. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Определение уровня экспрессии гена hGSTP
Выделение суммарной РНК из тканей ЩЖ проводили гуанидин-фенольным методом. Уровень экспрессии определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР. Для проведения ОТ-ПЦР использовались праймеры, синтезированные в компании «Лаборатория Медиген», Новосибирск (таблица).
Измерение ферментативной активности GSTР
Ферментативная активность GSTР была измерена в цитозольной фракции замороженных тканей щитовидной железы с использованием этакриновой кислоты (ЕА) как субстрата. Реакция проводилась в калий-фосфатном буфере (0,1М КН2РО4, рН 6,5). К 300мкМ раствору ЕА добавлялся глютатион GSH (конечная концентрация 5мМ). В случае ферментативной реакции раствор также содержал 10-70 мкг белка. Через 4 мин к реакционной смеси добавляли двукратный объем хлористого метилена. Смесь тщательно перемешивали в течение 30 сек, после чего центрифугировали и отбирали водную фазу. В раствор вводился внутренний стандарт этилпарабен (6 мкг/мл). Анализ метаболитов проводился методом ВЭЖХ.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ STATISTICA и Origin 7.0. Для оценки достоверности различий между выборками использовался t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Для измерения активности hGSTP в опухолевых и нормальных тканях щитовидной железы человека было использовано 19 послеоперационных образцов ткани, из которых была выделена цитозольная фракция (рис. 1). Как видно из представленных диаграмм, изменение активности hGSTP в опухолевых тканях происходит по-разному у больных с диагнозом диффузно-узловой зоб и папиллярный рак щитовидной железы. В случае ДУЗ наблюдается в среднем 2-4-кратное повышение ферментативной активности у 7 больных из 10. При карциноме ЩЖ активность в опухолевой ткани относительно нормы понижается в 1,5-2 раза у 8 из 10 пациентов.
Для определения уровня экспрессии гена hGSTP в ткани щитовидной железы человека был использован метод полуколичественной мультиплексной ОТ-ПЦР. Экспрессия была измерена в образцах опухолевых и нормальных тканей у 30 больных. Для количественной оценки уровня экспрессии электрофореграмма была денситометрирована, результаты были представлены как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена
Рис. 1 . Ферментативная активность hGSTP в нормальной и опухолевой тканях ЩЖ больных с диагнозом: А) ДУЗ ЩЖ; Б) рак ЩЖ. Представлено среднее значение±SD. Каждый эксперимент проводился трижды
Рис. 2. Типичная картина разделения продуктов амплификации генов hGSTP и GAPDH. 1 - больной с диагнозом рак ЩЖ; 2,
3 - больные с диагнозом ДУЗ ЩЖ; Н - нетрансформированная ткань, О - опухолевая ткань
hGSTP к интенсивности полосы гена GAPDH (рис. 2-4). У 12 больных с диагнозом ДУЗ наблюдалось повышение уровня экспрессии гена hGSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормой (от 1,35 до 8 раз), у двух больных он не менялся, а у двух - понижался (в 1,5 и 2,5 раза). В случае рака щитовидной железы наблюдается понижение уровня экспрессии гена hGSTP в опухолевой ткани ЩЖ у 10 из 12 пациентов (в 1,5-3 раза). У двух больных экспрессия hGSTP повышается.
Полученные результаты выявили различный профиль экспрессии GSTP в тканях щитовидной железы. Известно, что это фермент второй фазы
Рис. 3. Относительный уровень мРНК hGSTP в нормальной и опухолевой тканях ЩЖ больных с диагнозом ДУЗ ЩЖ. Представлено среднее значение±SD. Каждый эксперимент проводился трижды
Рис. 4. Относительный уровень мРНК hGSTP в нормальной и опухолевой тканях ЩЖ больных с диагнозом рак ЩЖ. Представлено среднее значение±SD. Каждый эксперимент проводился трижды
метаболизма ксенобиотиков, выполняющий в организме множество функций. Он участвует в процессах детоксификации чужеродных соединений, способен вызывать эффекты множественной лекарственной устойчивости, играет немаловажную роль в ответе организма на окси-дативный стресс. Однако наибольшее внимание
этот фермент вызывает в связи с его участием в процессах канцерогенеза. Известно, что в некоторых опухолевых тканях уровень экспрессии гена hGSTP увеличен по сравнению с нормой. Особенно это ярко выражено при гепатоканце-рогенезе, где этот ген используется в качестве маркера для диагностики ранних стадий рака печени [19]. Подобные изменения экспрессии показаны для рака молочной железы, рака урогенитальной системы, рака легкого и простаты [3, 8, 12, 17]. Следует заметить, что до сих пор исследователи не уделяли должного внимания роли hGSTP в этиологии рака щитовидной железы. В связи с этим была исследована активность фермента и экспрессии гена hGSTP в опухолях щитовидной железы, как возможного маркера злокачественной трансформации.
Результаты показали, что у больных с диагнозом ДУЗ выявлено повышение ферментативной активности hGSTP в опухолевых тканях по сравнению с нормальными. При карциноме ЩЖ наблюдается обратная картина, то есть происходит снижение активности в опухолевых тканях по сравнению с нормой. Для того чтобы выявить, на каком молекулярном уровне происходит изменение ферментативной активности hGSTP, был измерен уровень мРНК ее гена. Полученные результаты отражают ту же тенденцию, что и данные по ферментативной активности: повышение уровня мРНК hGSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормой при ДУЗ и понижение при карциноме ЩЖ. Таким образом, можно судить о том, что изменение ферментативной активности hGSTP при заболеваниях ЩЖ происходит на транскрипционном уровне. Тогда можно говорить о том, что в процессы трансформации тканей щитовидной железы вовлечены механизмы, регулирующие экспрессию гена hGSTP. Однако ответить на вопрос, является ли изменение в экспрессии гена причиной или следствием трансформации ЩЖ, представляется весьма проблематичным. Можно предположить, что тиреоидные гормоны и их рецепторы могут влиять на экспрессию hGSTP. На сегодняшний день в литературе нет данных о том, регулируется ли экспрессия hGSTP гормонами ЩЖ. Тем не менее известно, что промоторная область GSTP включает в себя элемент, структурно похожий на сайт,
отвечающий за связь с рецептором тиреоидных гормонов [13], из чего следует, что такая возможность существует.
Другим возможным способом регуляции экспрессии гена GSTP в опухолях ЩЖ может выступать эстроген-зависимый путь. Известно, что нарушение функций ЩЖ гораздо чаще встречается у женщин в возрасте 45-60 лет [9]. Было показано, что эстрогены способны вызывать пролиферацию культуры клеток ЩЖ человека, воздействуя на циклин D [10]. Известно также, что уровень мРНК эстрогеновых рецепторов изменяется в трансформированных тканях ЩЖ по сравнению с нормой. Так, например, уровень мРНК ERa повышается при фолликулярной аденоме и понижается при различных карциномах. Уровень мРНК ErP, напротив, понижается при аденоме и повышается при карциномах [4]. Литературные данные о регуляции экспрессии hGSTP эстрогеновыми рецепторами остаются противоречивыми.
Таким образом, в нашей работе первые показано, что в тканях ЩЖ человека регистрируется заметная активность GSTP, которая зависит от степени трансформации ткани. В большинстве случаев (60 %) у больных с диагнозом нетоксический зоб наблюдается 2-8-кратное увеличение активности GSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормальной. У 90 % онкологических больных наблюдается противоположная картина: активность фермента в опухоли в 1,5-3 раза ниже, чем в норме. Такое перераспределение активности GSTP и экспрессии ее гена в доброкачественных и злокачественных тканях ЩЖ может служить основой для дальнейшей разработки метода дифференциальной диагностики этих новообразований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Carpi A., Mechanick J.I., Saussez S., Nicolini A. Thyroid tumor marker genomics and proteomics: diagnostic and clinical implications
// J. Cell Physiol. 2010. Vol. 224. P 612-619.
2. Cheng S.Y., Leonard J.L., Davis P.J. Molecular aspects of thyroid hormone actions // Endocr. Rev. 2010. Vol. 31. P 139-170.
3. Cookson M.S., Reuter V.E., Linkov I., Fair W.R. Glutathione S-transferase-pi (GST-pi) class expression by immunohistochemestry in benign and malignant prostate cancer // J. Urol. 1997. Vol. 157 (2). P 673-678.
4. Egawa C., Miyoshi Y., Iwao K. et al. Quantative analysis of estrogen receptor -a and -p messenger RNA expression in normal and malignant thyroid tissues by real-time polymerase chain reaction // Oncology. 2001. Vol. 61. P 293-298.
5. Elisei R., Cosci B., Romei C. et al. Prognostic significance of somatic RET oncogene mutations in sporadic medullary thyroid cancer: a 10-year follow-up study // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008. Vol. 93. P. 682-687.
6. Gilfillan C.P. Review of the genetics of thyroid tumours: diagnostic and prognostic implications // ANZ J. Surg. 2010. Vol. 80. P. 33-40.
7. Grubbs E.G., Rich T.A., Li G. et al. Recent advances in thyroid cancer // Curr. Probl. Surg. 2008. Vol. 45 (3). P. 156-250.
8. Lasabova Z., Tilandyova P., Kajo K. et al. Hypermethylation of the GSTP1 promoter region in breast cancer is associated with prognostic clinicopathological parameters // Neoplasma. 2010. Vol. 57. P. 35-40.
9. Lazarus J.H., Obuobie K. Thyroid disorders - an update // Postgrad. Med. J. 2000. Vol. 76. P. 529-536.
10. Manole D., Schidknecht B., Gosnell B. et al. Estrogen promotes growth of human thyroid tumor cells by different molecular mechanisms // J. Clin. Endocrin. Metab. 2001. Vol. 86. P. 1072-1107.
11. PaciniF., CastagnaM.G., Cipri C., SchlumbergerM. Medullary Thyroid Carcinoma // Clin. Oncol. 2010. Vol. 22. P. 475^85.
12. Ritchie K.J., Henderson C.J., Wang XJ. et al. Glutathione transferase pi plays a critical role in the development of lung carcinogenesis following exposure to tobacco-related carcinogens and urethane // Cancer Res. 2007. Vol. 67. P. 9248-9257.
13. Rushmore T.H., PickettC.B. Glutathione S-transferases, structure, regulation and therapeutic implications // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 11475-11478.
14. Ruzza P., Rosato A., Rossi C.R. et al. Glutathione transferases as targets for cancer therapy // Anticancer Agents Med. Chem. 2009. Vol. 9. P. 763-777.
15. Schlumberger M. Pacini F. Thyroid tumors. Paris: Nucleon, 2003. 355 p.
16. Sherman S.I. Targeted therapy of thyroid cancer // Biochem. Pharmacol. 2010. Vol. 80. P. 592-601.
17. Simic T., Savic-Radojevic A., Pljesa-Ercegovac M. et al. Glutathione S-transferases in kidney and urinary bladder tumors // J. Nat. Rev. Urol. 2009. Vol. 6. P. 281-289.
18. Sipos J.A., Mazzaferri E.L. Thyroid Cancer Epidemiology and Prognostic Variables // Clin. Oncol. 2010. Vol. 22. P. 395-404.
19. Steinmetz K.L., Pogribny I.P., James SJ., Pitot H.C. Hy-pomethilation of the rat glutathione S-transferase Pi (GSTP) promoter region isolated from methyl-deficient livers and GSTP-positive liver neoplasms // Carcinogenesis. 1998. Vol. 19. P. 1487-1494.
Поступила 4.11.10
