CC BY
59
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2005
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ 8ГТРБ И ТГГ3 В ПРЕДОПЕРАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКЕ ПАПИЛЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
МАНЬКОВСКАЯ С.В.*, РЕКЕЧИНСКАЯ Н.В.**, ДЕМИДЧИК Ю.Е.**, САЕНКО В.А.***, ХАМАДА А.****, ЯМАСИТА С.****
Институт физиологии НАН Беларуси *,
Республиканский центр опухолей щитовидной железы, Беларусь**, Медицинский радиологический научный центр РАМН***, Медицинская школа университета г.Нагасаки, Япония****
Резюме. Папиллярный рак щитовидной железы отличается разнообразием морфологических вариантов, что иногда затрудняет цитологическую диагностику. Цель исследования заключалась в возможности использования экспрессии маркерных генов SFTPB (повышенная экспрессия в ПРЩЖ) и TFF3 (пониженная экспрессия) в предоперационной диагностике папиллярной карциномы. Методом дуплексной ПЦР исследовали уровень экспрессии этих генов на материале пункционной биопсии узловых образований щитовидной железы. В 22 (75.9%) из 29 случаев результат молекулярного теста совпал с цитологическим диагнозом. У 7 (24.1%) не оперированных пациентов, с диагнозом узловой зоб щитовидной железы, образцы продемонстрировали спектр экспрессии изученных генов, характерные для ПРЩЖ. К моменту окончания данного исследования 3 больных прооперированны и у них установлен диагноз папиллярной карциномы щитовидной железы.
Ключевые слова: папиллярный рак щитовидной железы, маркерные гены SFTPB и TFF3.
Absract. Papillar cancer of thyroid gland is characterized by the variety of morphological variants and it makes difficult to put a diagnosis. The aim of study is possibility of expression using of marker genes SFTB (elevated expression) and TFF3 (reduction expression) in pre -operation diagnostics of thyroid gland papillar carcinoma . By the method of double PCR study the expression level of theses genes on the material of biopsy of node formation of thyroid gland has been studied. In 22 (75.9%) from 29 cases the result of molecular test is coincided with cytological diagnosis. In 7(24,1%) of non-operative patients with the diagnostic of thyroid node goiter , the samples showed the spectrum of expression of genes specific for SFTB. To the moment of this study finishing 3 patients have been operated and papillary carcinoma of thyroid gland has been diagnosed.
Последствия Чернобыльской аварии привели к значительному увеличению числа случаев папиллярного рака щитовидной железы на территории республики Беларусь [1,2]. Современные методы обследования пациентов
Адрес для корреспонденции: 220013, г. Минск, пр-т Независимости д.64, к.4, Республиканский центр опухолей щитовидной железы, тел. 375017-2902971
- Демидчик Ю.Е.
позволяют установить диагноз данного заболевания и выбрать правильную тактику лечения. Однако папиллярный рак щитовидной железы отличается разнообразием морфологических вариантов, причем цитологическая диагностика некоторых разновидностей довольно сложна [1,3,5,7]. Установить диагноз в таких случаях становится возможным только после детального гистологического исследо-
вания. Поэтому вопрос о разработке дополнительных методов предоперационного обследования больных с заболеваниями щитовидной железы до сих пор остается актуальным.
В 2001 году методом анализа экспрессии генов на олигонуклеотидных микрочипах определены гены, уровни экспрессии которых характерны и стабильно изменялись в ткани папиллярной карциномы щитовидной железы [6]. В нашем предыдущем исследовании мы показали, что ген SFTPB (surfactant, pulmonary associated protein B), расположенный на коротком плече хромосомы 2, и ген TFF3 (intestinal trefoil factor), цитогенетическое положение 21q22.3 - маркеры папиллярного рака щитовидной железы [4]. Протеин SFTPB обладает свойствами поверхностно-активного вещества и принимает участие в функционировании дыхательной системы [8]. Следует заметить, что роль гена SFTPB в опухолевом процессе ещё не установлена. Повышенная экспрессия гена TFF3 наблюдается при раке желудка, кишечника и кожи [9], а его супрессия недавно описана в фолликулярном раке щитовидной железы [10]. Предполагают, что продукт этого гена может влиять на процессы дифферен-цировки клеток, однако его роль в биологии опухоли также пока остается невыясненной и требует дополнительных исследований.
В данной работе мы провели анализ экспрессии маркерных генов SFTPB и TFF3 в пунктатах опухолей щитовидной железы и оценили возможность использования этих данных для молекулярной диагностики папиллярного рака щитовидной железы на предоперационном этапе.
Методы
В исследование включены 42 пациента с узловыми образованиями щитовидной железы. Во всех случаях аспирационная биопсия выполнялась под контролем УЗИ. Каждый образец подвергался цитологическому исследованию, а смывы из аспирационной иглы использовались для молекулярных тестов. За время выполнения настоящего исследования прооперированно 9 пациентов: 4 с папиллярным раком щитовидной железы (ПРЩЖ), 3 - узловым зобом (УЗ), 2 - фолликулярной аденомой (ФА). У остальных 33 неоперированных пациентов установлен диагноз - узловой зоб.
РНК выделена с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США) по методике производителя. Синтез кДНК проводили с использованием MuLV Reverse Transcriptase и рандо-мических гексамеров (все реагенты Applied Biosystems, США) при следующих условиях: 41оС - 60 мин, 95оС - 5 мин.
Анализ экспрессии генов SFTPB и TFF3 проведен при помощи дуплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы 2 мкл кДНК и двух пар праймеров. Одна пара служила для размножения участка гена внутреннего контроля KPNA4. Другая была специфична к исследуемому гену. Последовательность праймеров и концентрация MgCl2 в каждой реакции представлены в таблице 1. Условия ПЦР: 94оС - 10 мин, затем 31 цикл для гена TFF3 или 32 цикла для SFTPB 94оС - 30 сек, 61 оС - 30 сек, 72оС
Таблица 1
Последовательность праймеров и концентрации реагентов в смеси дуплексной ПЦР
Гены Продукт ПЦР Последовательность нуклеотидов в праймере Концентрация реагентов в смеси
Праймеры, нМ ад % % S
RPNA4
SFTPB 137 F -AATTCCCCATTCCTCTCCCCTAT R -GATGCCGCCCGCCAC 200 200 1.5
TFF3 147 F -TGGTGTTTCAAGCCCCTGCA R -CAAAGGGACAGAAAAGCTGAGATGA 60 200 1.5
KPNA4 170 F -AAGTTGTGCAAGTAGTACTCGATGG R -ATCAATGATCTCATAGGCCAATTT
- 30 сек. Анализ продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 3,5% агарозных блоках с последующим окрашиванием бромистым этидием. Изображения геля фиксировались, и интенсивность свечения каждой полосы измерялась с помощью программного пакета Gel-Pro ANALYZER (Media Cybernetics Inc., США). Уровень экспрессии исследуемых генов рассчитывали по отношению интенсивности свечения полосы гена к интенсивности свечения полосы, соответствующей гену KPNA4.
Статистическую оценку результатов проводили с помощью теста Манна-Уитни. Статистически достоверным считалось значение р, не превышающее 0,05.
Результаты и обсуждение
Основываясь на результатах предыдущего исследования, мы провели анализ экспрессии маркерных генов 8¥ТРБ (повышенная экспрессия в ПРЩЖ) и Т¥¥3 (пониженная) в материале аспирационной биопсии узловых образований щитовидной железы. Случаи, в которых уровень экспрессии гена 8¥ТРБ превышал уровень экспрессии Т¥¥3, интерпретировались как ПРЩЖ-подобные (положительный молекулярный тест), и, наоборот, случаи, в которых уровень экспрессии гена Т¥¥3 превышал уровень экспрессии 8¥ТРБ, диагностировались как доброкачественное тиреоид-ное заболевание (отрицательный молекуляр-
10 Ё
55 1СГ :
В 10 =
1 -=
Б. Случаи, у которых диагноз установлен цитологичесии (не оперированные пациенты')
і
Л
т
і
I
II
I
Hdmsp .ІДҐ-И- I г і 1 5 6 7!
Гнотолопи УЗ УЗ >3 УЗ УЗ УЗ >3 УЗ УЗ >3 УЗ УЗ
10 II 12 15 16 17 І! ІІ 20 22 55 56 21 13 14 21 2-5 Н 2І 2S
УЗ >3 УЗ УЗ УЗ >3 УЗУЗ гЗ.-З ПРПРПРПР ПРПРПР
Рис.1. Экспрессия генов 5¥ТРБ и Т¥¥3 в пунктатах узловых образований щитовидной железы. * Случаи, у которых результат молекулярного теста не совпал с клиническим диагнозом.
ный тест). У 8 (88.9%) из 9 прооперированных пациентов наблюдалось совпадение данных молекулярного анализа (профиля экспрессии генов 8¥ТРБ и Т¥¥3) с морфологическим заключением (рис.1 А).
В одном образце ПРЩЖ, который согласно результатам молекулярных тестов был интерпретирован как доброкачественный, морфологическое исследование выявило наряду с малигнизированной тканью наличие ги-перпластического узла. Возможно, аспираци-онный материал был получен именно из последнего источника, что привело к появлению отрицательного результата.
Из 33 случаев, для которых возможен был только цитологический диагноз, в 4 (12.1%) выделенная РНК оказалась непригодна для анализа. В 22 (75.9%) из 29 образцов получено совпадение результатов молекулярного теста с цитологическим диагнозом (7 - ПРЩЖ, 15 -доброкачественное образование щитовидной железы). Но у 7 (24.1%) неоперированных пациентов, с диагнозом узловой зоб щитовидной железы, образцы продемонстрировали спектр экспрессии изученных генов, характерные для ПРЩЖ: повешенная экспрессия для гена 8¥ТРБ и пониженная для Т¥¥3 (*, рис. 1Б). По клиническим данным, из 7 больных (шесть женщин и один мужчина, возраст на момент исследования 43-76 лет) 3 находились на диспансерном учете по поводу узлового зоба, у 4 заболевание выявлено впервые.
По данным лабораторного исследования у всех пациентов гормональный статус соответствовал эутиреоидному состоянию. Во всех случаях проведена ультрасонография и определен размер опухоли, который составил 0.7 -1.2 см. По данным УЗИ диагностики не было замечено изменений в регионарном аппарате ни у одного пациента. Таким образом, клиническая картина у всех больных не предполагала наличия злокачественного процесса в щитовидной железе. Поскольку прогностическое значение молекулярного анализа пока не выяснено, предусмотрено более частое (раз в
три месяца) обследование этих пациентов. К моменту окончания данного исследования 3 больных прооперированны и у них установлен диагноз папиллярной карциномы щитовидной железы.
В целом, результаты работы показывают, что молекулярный генетический анализ пунк-татов аспирационной биопсии опухолей щитовидной железы может служить информативным средством диагностики и использоваться на предоперационном этапе в качестве вспомогательного средства для установления диагноза.
Литература
1. Демидчик Е.П. Рак щитовидной железы у детей/ Е.П Демидчик, А.Ф. Цыб, Е.Ф. Лушников.- Москва, 1996. - 207с.
2. Рак щитовидной железы в Беларуси/ Е.П. Демидчик [и др.]// Клиническая онкология: сборник научных работ/под ред. Е.П. Демидчика.- Минск, 1999. - С. 24-31.
3. Кириллов В. А Морфометрия в диагностике рака щитовидной железы: методические рекомендации/ В.А. Кириллов, Ю.П. Ющенко, Е.П. Демидчик. -Минск, 1997. - 12с.
4. Особенности экспрессии SFTPB и TFF3 в папиллярном раке щитовидной железы/ С.В. Маньковс-кая [и др.]// Медицинская панорама. - 2005. - № 5.
- С. 49-50.
5. Хмельницкий О.К. Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний щитовидной железы/ О.К. Хмельницкий.- Санкт-Петербург, 2002. - 286с.
6. Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals highly consistent profiles/ Huang Y., Prasad М., Lemon W.[ et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -2001. - Vol.98. - P.15044-15049.
7. LiVolsi V.V Papillary neoplasms of the thyroid. Pathologic and prognostic features/ LiVolsi V V. // Am. J. Clin. Patol. - 1992. - Vol.97. - P.426-434.
8. Clinical biological and genetic heterogeneity of the inborn errors of pulmonary surfactant metabolism/ M. Tredano, J.De Blic., M. Griese [et al.] // Clin. Chem. Lab. Med. - 2001. - Vol.39.- № 2. - P.90-108.
9. Intestinal trefoil factor: a marker of poor prognosis in gastric carcinoma/Yamachika T. [et al.] // Clin.Cancer Res. - 2002. - Vol.8. - P. 1092-1099.
10. High-throughput differential screening of mRNAs by serial analysis of gene expression: decreased expression of trefoil factor 3 mRNA in thyroid follicular carcinomas/ T. Takano [et al.] // Br.J.Cancer.
- 2004. - Vol.90. - P.1600-1605.
Поступила 25.09.2005 г.
Принята в печать 26.09.2005 г.
