Фенотропил как рецепторный модулятор синаптической нейропередачи
Г.И. Ковалев, В.И. Ахапкина, Д.А. Абаимов, Ю.Ю. Фирстова
Препарат Фенотропил (Ы-карба-моил-метил-4-фенил-2-пирролидон) по своим фармакологическим эффектам принадлежит к ноотропным лекарственным средствам. Большинство современных классификаций ноотроп-ных средств относят производные пирролидона - рацетамы (пирацетам, оксирацетам, анирацетам и др.) - к так называемым “истинным ноотропам”, для которых улучшение мнестических функций - памяти, обучаемости - является главным (часто единственным) или наиболее выраженным проявлением психофармакологической активности. Эксперименты на лабораторных животных убедительно показывают, что рацетамы оказывают влияние на функционирование основных нейро-медиаторных систем мозга - холинер-гическую, адренергическую, дофами-нергическую, ГАМКергическую и глу-таматергическую, причем в том направлении, “в котором эти системы имеют отношение к памяти и адаптации организма к экстремальным воз-
Георгий Иванович Ковалев - докт. мед. наук, профессор, зав. лабораторией радиоизотопных методов исследований ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. Валентина Ивановна Ахапкина -директор департамента экспериментальной и клинической фармакологии, зам. генерального директора ЗАО “Отечественные лекарства”.
Денис Александрович Абаимов -
канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории радиоизотопных методов исследований ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. Юлия Юрьевна Фирстова - аспирант лаборатории радиоизотопных методов исследований ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.
действиям” [1]. Тем не менее до последнего времени оставалось непонятным, через какие молекулярные мишени и синаптические механизмы рацетамы, включая Фенотропил, осуществляют эти действия. Более того, с момента опубликования в 1985 г работы Bering and Muller [6] считалось общепринятым, что препараты этой группы не действуют ни на рецепторы нейромедиаторов, ни на какие-то другие места связывания, отличные от них [2, 12].
Однако целый ряд нейрохимических данных позволял сомневаться в справедливости данного утверждения. В частности, было экспериментально показано, что:
1) пирацетам модулирует секрецию D-аспартата из изолированных нервных окончаний коры мозга крыс, вовлекая пресинаптические глутамат-ные рецепторы предположительно неNMDA-типа [4];
2) анирацетам аллостерически потенцирует неNMDA-тип глутамат-ных рецепторов в ооцитах морского ежа [14];
3) анирацетам увеличивает число рецепторов неNMDA-типа в мембранах коры мозга крыс [7];
4) пирацетам модулирует число рецепторов глутамата в мембранах мозга крыс [3].
В последующие годы были открыты и подробно охарактеризованы новые фармакологические типы рецепторов нейромедиаторов, поэтому целью настоящей работы
стало изучение влияния Фенотропила на различные типы рецепторов основных нейромедиаторов ЦНС.
Материал и методы исследования
Для количественного определения рецепторов в мембранных препаратах, приготовленных из компетентных морфофункциональных образований (гиппокампа, полосатого тела, коры больших полушарий) мозга крыс, применяли общепринятый метод радио-рецепторного анализа с использованием специфических лигандов, меченных по тритию, в подборе которых основывались на рекомендациях IUPHAR от 2006 г. [5] (табл. 1).
Были использованы два методических подхода в действии Фенотро-пила на рецепторы нейромедиаторов: метод in vitro и метод ex vivo. В первом случае мембраны мозга, содержащие рецепторы, инкубировали в пробирках вместе с радиоактивно меченным лигандом определенного рецептора в присутствии различных концентраций Фенотропила. Измерение специфически связавшегося в данных условиях радиоактивного лиганда с мембранным рецептором давало ответ на вопрос: оказывает ли лекарственное вещество прямое, конкурирующее
Таблица 1. Типы рецепторов и использованные [3Н]-лиганды
Тип рецептора Специфический лиганд, удельная активность (кюри/ммоль)
Дофаминовый, D, Дофаминовый, D2 Дофаминовый, D3 Серотониновый, HT2 Глутаматный, NMDA Ацетилхолиновый, никотиновый [G-3H]-SCH 23390, (60) ^-3Н]-спироперидол, (95) [G-3H]-7-OH-DPAT, (120) ^-^-кетансерин, (60) [G-3H]-MK-801, (210) ^-^-(-Ьникотин, (140)
Таблица 2. Влияние Фенотропила на рецепторы нейромедиаторов in vitro
Тип рецептора Вещество сравнения, IC50 (мкмоль/л) Фенотропил, IC50 (мкмоль/л)
Дофаминовый, D1 Дофаминовый, D2 Дофаминовый, D3 Серотониновый, HT2 Глутаматный, NMDA Ацетилхолиновый, никотиновый SKF3B393, 1,104 Галоперидол, 0,573 7-OH-DPAT, 0,015 Кетансерин, 0,702 МК^01 (дизоцилпин), 0,007 (-)-Никотин 0,013 >1000 >1000 >1000 >1000 >100 5,B6
действие на изучаемый тип рецептора? Активность препарата в данном варианте опытов выражали величиной концентрации, изменяющей специфическое связывание радиоактивного лиганда с рецептором на 50%, -IC50 (“inhibitory concentration 50”).
Во втором случае Фенотропил вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, один раз в день в течение 7 сут. Группе контрольных животных вводили физиологический раствор. Через 24 ч после последней инъекции крыс декапитировали, извлекали мозг, готовили мембраны выделенных структур мозга, образцы которых инкубировали в присутствии радиолиганда. Обработанные результаты измерений были представлены величинами Bmax и Kd, отражающими концентрацию рецепторов в мембранах и степень структурного сродства (аффинитета) лекарственного средства к рецептору соответственно. Анализ данных ex vivo позволяет интерпретировать полученные сведения в свете возможного
Фенотропила на рецепторный профиль, отражающий реакцию клеток мозга на субхрони-ческое введение препарата.
Все меченые лиганды были получены методом твердофазного катализа в ОХВАВ Института молекулярной генетики РАН (заведующий - академик РАН Н.Ф. Мясоедов). Результаты экспериментов обрабатывали с помощью программ Statistica 6.0 и GraphPad 4.0 Prism.
Радиорецепторный анализ in vitro
Концентрационная зависимость прямого влияния Фенотропила на глу-таматные рецепторы NMDA-типа представлена на рис. 1а. Видно, что влияние селективного антагониста этого типа рецептора MK-B01 (дизоцилпина) описывается классической кривой (пунктирная линия) и характеризуется величиной IC50 0,007 мкмоль/л (табл. 2).
Внесение Фенотропила не обнаруживает эффекта конкуренции с лигандом за рецепторные места связывания вплоть до максимальной использованной концентрации 100 мкМ (сплошная кривая), что интерпретируется как отсутствие структурного сродства препарата к глутаматному рецептору NMDA-типа.
Аналогичная инертность Фенотро-пила продемонстрирована в отношении всех трех типов дофаминовых рецепторов и рецептора серотонина 5-HT2-™-па: в пределах использованных концентраций препарат не вмешивался в процесс связывания специфических рецепторных лигандов SKF3B393 фгтип), галоперидола (Dj-тип), 7-OH-DPAT ф3-тип) и кетансерина ^-HTj-™^ вплоть до 1 ммоль/л (см. табл. 2).
Напротив, изучение влияния Фенотропила на рецепторное связывание высокоизбирательного (IC50 13 нмоль/л) лиганда никотинового типа холинорецепторов ^-^-Н-нико-тина позволило обнаружить фармакологически значимую конкуренцию препарата за данный тип рецептора с IC50 5,B6 мкмоль/л (см. рис. 1б и табл. 2).
Таким образом, представитель структурной группы производных пир-ролидона Фенотропил является н-хо-линергическим препаратом прямого рецепторного действия.
Радиорецепторный анализ ex vivo
Субхроническое введение Фено-тропила в ноотропной дозе 100 мг/кг и последующий радиорецепторный анализ результатов связывания лигандов показали широкий спектр действия препарата. Графики насыщения рецепторов изученных типов в контрольной (пунктирная кривая) и опытной (сплошная кривая) группах крыс, а также рассчитанные величины Kd и Bmax представлены на рис. 2 и в табл. 3 соответственно.
(б)
непрямого, модулирующего влияния
110
100
ТС
S 90
I
со 0Q 80
JQ СО 70
ТС
CD НО
О
О 50
CD =Г 40
VD О 30
Н О 20
чО о4 10
Фенотропил ' МК-801
____I______I_______L
(а)
-ю
-8 -7 -6 -5
Концентрация, IgM
110
к100 і 90 Я
Ш 80
о 60 о
О)
VO
о
н
о
-▼-* (-)-Никотин
___I_______I______L
_|_
_|_
-11
-10
-9
-8
-6
-5
______I
-3
Концентрация, IgM
Рис. 1. Влияние Фенотропила на рецепторы in vitro. а - NMDA в гиппокампе, б - нАХ в коре.
(а)
(б)
Концентрация [G- Н]-МК-801, нМ
Концентрация [G- Н]-никотина, нМ
(г)
2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0
Концентрация [G-3H] спироперидола, нМ
22,5
Концентрация [G-3H] (+) 7-ОН DPAT, нМ
Концентрация [G- Н] кетансерина, нМ
■ Фенотропил Контроль
Рис. 2. Влияние Фенотропила на рецепторы ex vivo. а - NMDA в гиппокампе, б - нАХ в коре, в - D1 в стриатуме, г - D2 в стриатуме, д - D3 в стриатуме, е - 5-HT2 во фронтальной коре.
Продемонстрировано, что в ответ на 7-кратное системное введение Фенотропила мозг опытной группы животных индуцирует статистически значимые изменения для большинства из исследованных типов рецепторов (см. рис. 2а-2в, 2д, 2е).
Важно отметить, что ни для одного из них изменения не касаются величи-
ны Кь отражающей степень сродства рецептора к специфическому лиганду, тогда как концентрация рецепторов (Втах) меняется как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения (см. табл. 3).
Так, под влиянием Фенотропила более всего увеличилась концентрация ЫМЭД-рецепторов в гиппокампе
(+65% относительно группы плацебо, см. рис. 2а), никотиновых рецепторов в коре мозга (+56%, см. рис. 2б) и Эз-дофаминовых рецепторов в стриатуме (+29%, см. рис. 2д). Относительное уменьшение количества рецепторов произошло в стриатуме для 0гдо-фаминовых рецепторов (-18% в сравнении с группой плацебо, см. рис. 2в)
Таблица 3. Влияние Фенотропила на показатели рецепторного связывания в мозге крыс ex vivo после 7-кратного введения (m ± S.E.)
Тип рецептора Контроль (физраствор) Фенотропил, 100 мг/кг/сут
Kd, нМ Bmax, фмоль/мг Kd, нМ Bmax, фмоль/мг
D1 D2 D3 HT2 NMDA нДХ 1,14 ± 0,26 6,B7 ± 1,00 14,70 ± 3,44 5,65 ± 0,94 B,3 ± 1,5 13,1 ± 3,2 77B,B ± 45,3 761.5 ± 44,0 32,1 ± 4,2 176.6 ± 11,0 3350 ± 300 103,3 ± 14,5 I,45 ± 0,20 10,67 ± 2,66 17,31 ± 2,57 4,9B ± 0,B3 II,2 ± 2,0 13,B ± 4,9 639,B ± 23,2* 931,5 ± 102,7 41,5 ± 3,5* 14B,3 ± B,9* 5540 ± 530* 161,1 ± 33,5*
* Различия с показателями в контроле (р < 0,05; F-критерий).
и в коре мозга для серотониновых рецепторов типа НТ2 (-16%, см. рис. 2е). Отсутствие заметных отличий в количестве Э2-рецепторов можно объяснить тем, что использованный в качестве Э2-лиганда спироперидол также проявляет некоторое сродство к субпопуляциям Э3- и НТ2-рецепторов, в связи с чем суммарное связывание не выявило отличий.
Следовательно, субхроническое введение Фенотропила приводит к разнонаправленным изменениям в количестве нейромедиаторных рецепторов по сравнению с плацебо: количество никотиновых, ЫМЭА и Э3-дофа-миновых типов рецепторов увеличивается, а количество НТ2-серотониновых и Э1-дофаминовых - уменьшается.
Заключение
Представленные в данной работе данные о рецепторном механизме действия Фенотропила, с одной стороны, хорошо согласуются со сформировавшимися к сегодняшнему дню взглядами об основных нейрохимических мишенях ноотропных средств ра-цетамового ряда, с другой стороны, привносят в них абсолютно новые элементы. Так, прямое или опосредованное вовлечение дофаминовых рецепторов в механизмы когнитивной дея-
тельности и эффекты ноотропных препаратов обсуждается в работах авторов последних лет [11], равно как и роль в этих процессах серотониновых рецепторов НТ2-типа [13].
Изученный препарат Фенотропил оказался активным в первую очередь в отношении рецепторов никотинового и ЫМЭД-типа глутаматных рецепторов. Но если в отношении первых препарат обнаружил прямое действие, то увеличение концентрации вторых можно объяснить только через механизм нейромодуляции. Ряд свидетельств в пользу участия глутаматных рецепторов ИМЭД- и неЫМЭД-типов в процессах памяти и обучения, а также в механизме действия рацетамов приведен в начале данной статьи.
Холинергические механизмы пластичности нервных клеток являются признанной мишенью для ноотропных препаратов, в основе чего лежат данные нейрофизиологии, нейрохимии, нейрофармакологии и клиники. Во-первых, никотиновые рецепторы активно участвуют в когнитивных процессах [17, 18]. Во-вторых, н-холинер-гические элементы вовлечены в патогенетические механизмы расстройств памяти [8, 10, 15, 16]. В-третьих, одной из основных групп препаратов ан-тиамнестического действия являются
средства, воздействующие на никотиновые рецепторы. Средства, блокирующие активность ацетилхолинэстера-зы (амиридин, такрин), и холинергические предшественники (глиатилин) активно используются в клинике против болезни Альцгеймера [9]. Дальнейшее уточнение рецепторных механизмов действия Фенотропила может быть получено при изучении аналогичного рецепторного профиля при моделировании нарушений когнитивной деятельности.
Список литературы
1. Ахапкина В.И., Воронина Т.А. // Фарма-тека. 2005. Т. 13. С. 1.
2. Ковалев Г.В. Ноотропные средства. Волгоград, 1990.
3. Ковалев Г.И. Изучение роли межмедиа-торных взаимодействий в механизме формирования эффектов ноотропных средств: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М.,1993.
4. Прихожан А.В., Ковалев Г.И. // БЭБиМ. 1986. № 10. С. 440.
5. А^апс^ S.PH. et al. // Br. J. Pharmacol. 2006. V. 147. Suppl. 3. P. S1.
6. Bering B., MUller W.E. // Arzneimittel. Forsch. 1985. V. 35. № 9. P. 1350.
7. Copani et al. // J. Neurochem. 1992. V. 58. P. 1199.
8. Dwoskin L.P., Crooks PA. // JPET. 2001. V. 298. P. 395.
9. Ellis J.M. // JAOA. 2005. V. 105. № 3. P. 145.
10. Francis PT. et al. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1999. V. 66. P 13.
11. Glickstein S. et al. // J. Neurosci. 2002. V. 22. № 13. P 5619.
12. Gouliaev A., Senning A. // Brain. Res. Rev. 1994. V. 19. № 2. P 180.
13. Harvey J.A. // Learn. Mem. 2003. V. 10. P. 355.
14. Ito I. et al. // J. Neurochem. 1990. V. 424. P. 533.
15. Mesulam M. // Learn. Mem. 2004. V. 11. P 43.
16. Parent M.B., Baxter M.G. // Learn. Mem. 2004. V. 11. P. 9.
17. Pepeu J., Giovannini M.L. // Learn. Mem. 2004. V. 11. P 21.
18. Tinsley M.R. et al. // Learn. Mem. 2004. V. 11. P. 3.
АТМОСФ
ЕР
Посетите наш сайт!
На сайте www.atmosphere-ph.ru вы найдете электронную версию нашего журнала, а также журналов “Нервы”, “Атмосфера. Кардиология”, “Легкое сердце”, “Атмосфера. Пульмонология и аллергология”, “Астма и Аллергия”, “Лечебное дело”, переводов на русский язык руководств и популярных брошюр GINA (Глобальная инициатива по бронхиальной астме) и GOLD (Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких), ARIA (Лечение аллергического ринита и его влияние на бронхиальную астму), ИКАР (Качество жизни у больных бронхиальной астмой и ХОБЛ).