Фенотипические и транскриптомные особенности моноцитов периферической крови в динамике неоадъювантной химиотерапии больных раком молочной железы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-1-79-89

Фенотипические и транскриптомные особенности моноцитов периферической крови в динамике неоадъювантной химиотерапии больных раком молочной железы

чт

сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

а.

о;

М.Р. Патышева1, 2, М.Н. Стахеева1, Е.С. Григорьева1, П.С. Ямщиков1, 2, И.В. Ларионова1, 2, А.А. Будницкая2, ^

Н.А. Тарабановская1, Н.В. Чердынцева1, 2, Ю.Г. Кжышковска2 2

1Научно-исследовательский институт онкологии ФГБНУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр 5

Российской академии наук»; Россия, 634009 Томск, пер. Кооперативный, 5; to

2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет»; Россия, 634050 Томск, проспект и

Ленина, 36 Щ

>

а

<

Контакты: Марина Ринатовна Патышева patysheva_mr@onco.tnimc.ru

Введение. Химиотерапия включена в большинство схем лечения рака молочной железы. Действие химиотерапев- зе тических препаратов оказывает влияние на моноциты крови, которые являются одними из важнейших участников о патогенеза онкологических заболеваний. Однако в настоящий момент не установлено, могут ли изменения моноци- § тов, индуцированные проведением химиотерапии, поддерживать эффект противоопухолевого лечения или, напро- ^ тив, снижать его. q

Цель исследования - охарактеризовать изменения фенотипического и транскриптомного профилей моноцитов >s больных раком молочной железы до и после химиотерапевтического лечения. О

Материалы и методы. В группе, состоящей из 50 больных раком молочной железы, оценена популяционная структура моноцитов на основании экспрессии рецепторов CD14, CD16, CD163 и HLA-DR с помощью проточной цитометрии. У 9 пациенток проанализирован транскриптомный профиль CD14+-моноцитов с применением массового параллель- S ного РНК-секвенирования. Все исследования выполнялись до и после проведения 4 курсов неоадъювантной химио- ¡5 терапии. ^

Результаты. В группе больных раком молочной железы неоадъювантная химиотерапия приводила к снижению ^ содержания CD14+1б+HLA-DR+-моноцитов. На фоне цитостатического лечения в моноцитах пациентов отмечены s повышение экспрессии генов MGLL, NR4A2, UCK1, YOD1, ABCA2, PAPSS2, ATP10 (Log2FoLdChange >0,8; ожидаемая доля 2 ложных отклонений (false discovery rate, FDR) <0,01) и снижение экспрессии генов KPNA2, ERCC4, JAGN1, RUBCNL, с SMYD4, B3GALT4 (Log2FoLdChange >0,8; FDR <0,01). После проведения терапии наблюдалось повышение активности > сигнальных путей, связанных с липидным обменом и внутриклеточным транспортом везикул из эндоплазматического ретикулума, на фоне снижения ответа на воздействие интерферонов у и а, и чужеродных молекул (экзогенных нуклеиновых кислот, вирусов и бактерий). С помощью дискриминантного анализа установлено, что относительное количество CD14+16--, CD14+16+-, CD1416+-, CD14+16HLA-DR+-, CD14+16+HLA-DR+- и Ш416+Н1^^+-моноцитов в крови имеет ценность для предсказания ответа на неоадъювантную химиотерапию у больных раком молочной железы. Заключение. Таким образом, выявлена связь параметров моноцитов крови с проведением химиотерапевтического лечения при раке молочной железы.

Ключевые слова: моноциты, рак молочной железы, РНК-секвенирование, транскриптом, химиотерапия, HLA-DR

Для цитирования: Патышева М.Р., Стахеева М.Н., Григорьева Е.С. и др. Фенотипические и транскриптомные особенности моноцитов периферической крови в динамике неоадъювантной химиотерапии больных раком молочной железы. Успехи молекулярной онкологии 2024;11(1):79-89. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-1-79-89

BY 4.0

Immune-phenotyping and transcriptomic profiling of blood monocytes from patients with breast cancer under neoadjuvant chemotherapy

M.R. Patysheva12, M.N. Stakheyeva1, E.S. Grigoryeva1, P.S. lamshchikov1,2, I.V. Larionova1,2, A.A. Budnickya2, N.A. Tarabanovskaya1, N.V. Cherdyntseva1,2, J.G. Kzhyshkowska2

чт

сч О сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю

< >

а

<

о

Cancer Research Institute of Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences; 5 Kooperativny Line, Tomsk 634009, Russia;

2National Research Tomsk State University; 36 Lenin Prospekt, Tomsk 634050, Russia Contacts: Marina Rinatovna Patysheva patysheva_mr@onco.tnimc.ru

Introduction. Chemotherapy is a common treatment for breast cancer. Chemotherapeutic drugs effect blood monocytes, which are major contributors to cancer pathogenesis. However, to date, pro-tumor or anti-tumor programming by chemotherapy of monocytes is controversial.

Aim. To characterize changes in phenotypic and transcriptomic profiles of monocytes of breast cancer patients before and after chemotherapeutic treatment.

Materials and methods. In a cohort of 50 breast cancer patients, monocyte populations were identified based on their expression of CD14, CD16, CD163, and HLA-DR evaluated by flow cytometry before and after neoadjuvant chemotherapy. Bulk RNA sequencing was adopted to explore the transcriptomic profile of CD14+ monocytes before and after treatment. After treatment, we observed an increase in the activity of signaling pathways related to lipid metabolism and intracellular transport of vesicles from the endoplasmic reticulum, against the background of a decreased response to exposure to interferon y and interferon a, and foreign molecules (exogenous nucleic acids, viruses and bacteria). Results. In breast cancer patients, neoadjuvant chemotherapy decreased in CD14+16+HLA-DR+ monocytes. Under cytostatic treatment, increased gene expression of MGLL, NR4A2, UCK1, YOD1, ABCA2, PAPSS2, ATP10 (log2FoldChange >0.8; false discovery rate (FDR) <0.01) and decreased gene expression of KPNA2, ERCC4, JAGN1, RUBCNL, SMYD4, B3GALT4 (log2FoldChange >0.8; FDR <0.01) were observed in monocytes of patients. Using discriminant analysis, the relative numbers of CD14+16-, CD14+16+, CD14-16+, CD14+16-HLA-DR+, CD14+16+HLA-DR+ and CD1416+HLA-DR+ monocytes in the blood were found to be valuable in predicting response to neoadjuvant chemotherapy.

Conclusion. Thus, association of blood monocytes with chemotherapeutic treatment in breast cancer was revealed. Keywords: monocytes, breast cancer, RNA-seq, transcriptome, chemotherapy, HLA-DR

For citation: Patysheva M.R., Stakheyeva M.N., Grigoryeva E.S. et al. Immune-phenotyping and transcriptomic profiling of blood monocytes from patients with breast cancer under neoadjuvant chemotherapy. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2024;11(1):79-89. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2024-11-1-79-89

о ж.

и >

ВВЕДЕНИЕ

Рак молочной железы (РМЖ) является ведущей патологией в России и составляет более 20 % всех злокачественных нозологий у женщин [1]. В структуре смертности женского населения РМЖ находится на 1-м месте среди онкологических заболеваний репродуктивной системы [1]. Подобные показатели напрямую связаны как с проблемами ранней диагностики заболевания, так и с недостаточной эффективностью лечения. Так, применение предоперационной неоадъ-ювантной терапии (НАХТ) при безметастатических формах РМЖ приводит к достижению полной морфологической регрессии опухоли только в 17,8 % случаев [2]. В настоящее время необходимо дальнейшее изучение патогенеза данной патологии для решения проблемы ранней диагностики и увеличения эффективности лечения.

Способность клеток моноцитарно-макрофагаль-ного ряда поддерживать рост опухоли является значимым фактором патогенеза РМЖ [3—6]. Моноциты составляют 5—10 % лейкоцитов крови и представляют собой клетки неспецифического иммунитета. Популяция моноцитов включает в себя несколько подтипов [7, 8]. Повышенное содержание отдельных субпопуляций моноцитов, таких как СD14+163+ и СD14+204+, или определенные сигнатуры генов, экспрессированных в моноцитах, связывают с наличием РМЖ [6, 9, 10]. Известно, что увеличение от-

ношения абсолютного числа лимфоцитов к абсолютному числу моноцитов в крови ассоциировано с эффективностью НАХТ, а повышенный уровень ^е2+-моноцитов негативно коррелирует с показателями безрецидивной выживаемости [10—12]. В то же время моноциты крови связаны с опухолеассоциированными макрофагами (ОАМ), поскольку представляют собой ресурс для пополнения их пула [3, 11].

Неоадъювантная терапия — обязательный этап лечения ряда молекулярных подтипов РМЖ. Цитостати-ческое лечение сопровождается выраженным влиянием не только на опухолевые клетки, но и на клетки других тканей, в том числе клетки иммунной системы [12, 13]. Известно, что химиотерапия может стимулировать противоопухолевый иммунитет, тем самым увеличивая частоту случаев полного патологического ответа на лечение [12]. Однако иммунные клетки, к которым относятся опухолевые макрофаги и моноциты, могут блокировать или нивелировать эффект химиотерапев-тического лечения [5, 14]. При этом остаются невыясненными вопросы, как цитостатическое лечение влияет на программирование циркулирующих моноцитов и могут ли моноциты как предшественники ОАМ изменять их популяционное представительство в опухоли. В последнее десятилетие вопрос о вовлечении клеток иммунной системы в реализацию терапевтических эффектов цитостатического лечения активно обсужда-

ется [12, 15]. Изучение функционального профиля моноцитов при РМЖ в условиях химиотерапии представляется актуальным для клинической онкологии [12, 16].

Цель исследования — охарактеризовать изменение фенотипического и транскриптомного профилей моноцитов больных РМЖ до и после химиотерапевти-ческого лечения.

материалы и методы

Пациенты. В исследование включены 50 больных РМЖ T1—3N0—3M0 I—III стадии с инвазивной карциномой неспецифического типа (табл. 1). Средний возраст больных составил 52 года (46—63 года). Исследование проводили в двух точках: до НАХТ и после 4 курсов НАХТ по схеме АС (доксорубицин и цикло-фосфамид). Эффективность терапии после 4 курсов оценивали согласно критериям Всемирной организации здравоохранения. Регистрировали полную регрессию (100 % редукция опухоли), частичную регрессию (уменьшение объема опухоли более чем на 50 %), стабилизацию (уменьшение объема опухоли на 25—50 %) и прогрессирование процесса (увеличение объема опухоли более чем на 25 %). В соответствии с международными рекомендациями пациенты со стабилизацией и прогрессированием составили группу плохого ответа на химиотерапию (не ответивших на НАХТ), а пациенты с полной и частичной регрессией — группу объективного ответа.

Фенотипирование моноцитов периферической крови. Проведена оценка уровней CD14+-, CD16+-, CD163+-и HLA-DR+-моноцитов в крови больных. Венозная кровь взята в вакуумные системы сбора крови, стабилизированные К3-ЭДТА. Кровь (100 мкл) окрашивали набором меченных моноклональных антител против маркеров CD45, CD14, CD16, CD163 и HLA-DR (табл. 2). Для блокирования неспецифического связывания применяли Human TruStain FcX™ (Biolegend, США). В контрольный образец добавляли соответствующий изотипический контроль в аналогичной концентрации. Все образцы анализировали на проточном цито-метре NovoCyte (ACEA Bioscience, США). Тактика гейтирования представлена на рис. 1. Обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета NovoExpress SoftWare (Acea, США).

Массовое параллельное РНК-секвенирование и био-информатический анализ данных. В исследование вошли 9 пациенток с РМЖ до и после НАХТ. Для анализа транскриптома моноцитов использовали 18 мл крови, забранной в вакуумные системы с К3-ЭДТА. Предварительно на градиенте плотности раствора фи-колла-урографина (1,077 г/см3) из крови получена фракция мононуклеарных клеток, а далее с помощью проточной цитометрической сортировки — СD14+-моно-циты. Использовалась панель конъюгированных моноклональных антител против маркеров CD45, CD56, CD14 и 7-AAD (см. табл. 2). Сортировка образцов

проводилась на клеточном сортере MoFlo XDP (Beckman Coulter, США).

Сортировку моноцитов выполняли в режиме Purify 1—2; эффективность сортировки в данном режиме составляла 70 %, а чистота целевой популяции — 98—99 %. Далее из полученного лизата клеток не более чем через 60 мин выделяли тотальную РНК c использованием набора RNAeasy mini kit plus (Qiagen, Германия). Качество полученной РНК оценивали с помощью станции автоматического капиллярного электрофореза TapeStation 4150 (Agilent Technology, США). Показатель

Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика больных раком молочной железы (n = 50)

Table 1. Clinical characteristics of patients with breast cancer in this study (n = 50)

Показатель Число пациентов, абс. (%)

Parameter Number of patients, abs. (%)

Состояние менструальной функции: Menses: сохранена saved пременопауза + перименопаза premenopausal + perimenopause постменопауза postmenopausal 24 (48,2) 26 (51,8)

Стадия: Stage: I II III 7(14,0) 23 (46) 20 (40)

Молекулярно-биологический подтип: Molecular subtype: люминальный В luminal B трижды негативный подтип triple-negative НБЯ2-положительный HER2-positive 25 (50,0) 19 (38,0) 6(12,0)

Лимфогенное метастазирование: Lymph node metastases: есть yes нет no 22 (46,5) 28 (53,5)

Эффект неоадъювантной химиотерапии: Neoadjuvant chemotherapy clinical response: полная + частичная регрессия complete response + partial response стабилизация stable disease прогрессирование progression disease 34 (68,0) 8(16,0) 8(16,0)

чт

СЧ

о

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж

to ш и

z <

>

a

<

о

a.

в;

£

о ж.

и >

Примечание. HER2 — рецептор эпидермального фактора роста человека 2.

Note. HER2 — human epidermal growth factor receptor-2.

чт

сч О сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю ш и

Z <

>

а

<

Таблица 2. Антитела и изотипические контроли, применяемые для фенотипирования моноцитов Table 2. Antibodies and isotype controls

Антитела, красители Antibodies, dyes Клон Clone H30THn Isotype Производитель Manufacturer

CD45-APC-Cy7 2D1 Mouse IgG1, k

CD14-FITC M5E2 Mouse IgG2a, k

CD16-APC 3G8 Mouse IgG1, k BD Bioscience, США BD Bioscience, USA

CD163-PE GHI/61 Mouse IgG1, k

HLA-DR-PE-Cy5 G46-6 Mouse IgG2a, k

Isotype PE-Cy™5 G155-178 Mouse IgG2a, k

7-AAD - -

CD56-PE-Cy7 CMSSB Mouse IgG1, k eBioscience, Thermo Fisher Scientific, США

Isotype PE P3.6.2.8.1 Mouse IgG1, k eBioscience, Thermo Fisher Scientific, USA

О m X

о о

X а. те

m

о ж.

и >

0,4

HLA-DR- HLA-DR-

0,84 % 99,16 %

-Ш'

0 103 104 1052 CD163-PE-H

-10» -106 -104 -102 0 1 02 1 04 1 06'7 HLA-DR-PE-Cy5-H

100

с

3 80 I 60 5 40

с

J 20 0

Неок^ошен^й тонтроль /

^^ IsOtypfJCTTOtrT] Р

• ■'■ Окрашенный образ' ' Steioed sample

lis ! :

и j|

0 103 104 105 106 CD163-PE-H

100

с

3 80 I 60 5 40

с

J 20 0

Неок^ошен^й онтроль /

Изотипический контроль / IsTtype cTotrT

^ ' ril/^IIIOULJLlù

St

/ I

0 1 02 1 03 1 04 1 05 1 06 1 07 HLA-DR-PE-Cy5-H

Рис. 1. Тактика гейтирования для идентификации фенотипа моноцитов крови Fig. 1. Flow cytometry gating strategy for the identification of human monocytes

? Т

До НАХТ / После НАХТ / Befor NACT After NACT

До НАХТ / После НАХТ / Befor NACT After NACT

До НАХТ / После НАХТ / Befor NACT After NACT

До НАХТ i После НАХТ i Befor NACT After NACT

До НАХТ i После НАХТ i Befor NACT After NACT

До НАХТ i После НАХТ i Befor NACT After NACT

M

До НАХТ i После НАХТ i Befor NACT After NACT

До НАХТ i После НАХТ i Befor NACT After NACT

p <o,s

_, ■ i

-•Ç

До НАХТ i После НАХТ i Befor NACT After NACT

Рис. 2. Субпопуляционный состав моноцитов у больных раком молочной железы до и после 4 курсов неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) Fig. 2. Circulating monocytes subsets in breast cancer patient before and after neoadjuvant chemotherapy (NACT)

ЧТ

СЧ

о

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж

to

< >

а

<

о m

целостности РНК (RIN) составил 8,5—9,9. Пробы тотальной РНК хранились при —80 °С.

Полнотранскриптомный профиль моноцитов определен с помощью массового параллельного секвенирова-ния. Библиотеки для него готовили с использованием набора NEXT flex Rapid Directional qRNA-SeqKit и одно-концевых индексов NEXTflex-qRNA-8nt-Barcodes (Perkin Elmer, США) по стандартному протоколу. Избавление от рибосомальной РНК осуществлялось с помощью набора NEBNext® rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (New England Bilab, США). Из подготовленных библиотек формировали общий эквимолярный пул и проводили секве-нирование на платформе NextSeq500 (Illumina, США) с набором реактивов для одноконцевого чтения 1х75 (single read); осуществляли 50 циклов. На каждую библиотеку в среднем приходилось около 5 млн ридов.

Методы статистической и биоинформатической обработки данных. Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica 8.0 for Windows (StatSoft Inc., США). Для проверки законов распределения исследуемых переменных на нормальность использовали критерий Колмогорова—Смирнова. После проверки все полученные числовые данные были представлены в виде медианы (LQu—UQu). Для определения статистически значимых различий в зависи-

мых группах использовали критерий Уилкоксона. Для построения математической модели применяли методы! дискриминантного анализа и нелинейной логистической регрессии. Результаты проточной цитометрии представлены с помощью программы GraphPad Prism 8 software (GraphPad Soft Inc., США). Различия считались статистически значимыми приp <0,05.

Картирование ридов на геном проводили с помощью программы STAR 2.5 [17]; в качестве референса использовали геномную сборку GRCh38 и аннотации GENCODE.R34. После картирования получали данные о количестве картирующихся ридов на индивидуальные гены c использованием программы QoRTs [18]. Затем с помощью программного пакета DESeq2, входящего в состав среды R, оценивали дифференциальную экспрессию генов в контрольных и экспериментальных группах. Для обогащения по биохимическим и регулятор-ным путям с использованием списков генов, ранжированных по уровню экспрессии log2FoldChange и p-vate, применяли программы fgsea (https://github.com/ctlab/ fgsea) и Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/), а для эксперимента — базы данных Hallmark gene sets, Reactome и GO. Данные визуализировали с помощью программ FGSEA, Enrichеr и Phantasus (https://genome. ifmo.ru/phantasus), а также средствами среды! R.

а.

в;

£ m

о ж.

U >

3o

2o

s: lo

lo

so

s

o

o

o

so

so

so

o

o

o

so

so

so

o

o

o

чт

сч О сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а. те

о ж.

и >

результаты

Изменение субпопуляционного состава и транскрип-томного профиля моноцитов до и после неоадъювантной химиотерапии. Проведено исследование фенотипа моноцитов крови до и после проведения 4 курсов НАХТ. Эта терапия не влияла на состав основных популяций моноцитов и экспрессию на них рецептора CD163 (рис. 2). Экспрессия HLA-DR на моноцитах CD14+16--класси-ческой и CD14-16+-неклассической популяций также сохранялась на прежнем уровне после НАХТ. Однако количество CD14+16+HLA-DR+ менялось после проведения химиотерапевтического лечения и составило до НАХТ 94 % (84,51-98,44 %), после нее - 84 % (62,61-98,87 %) (р = 0,04) (см. рис. 2).

Транскриптомный профиль моноцитов проанализирован у 9 больных РМЖ до и после НАХТ с помощью метода главных компонент: различий до и после НАХТ выявлено не было (рис. 3а). Однако сравнение показателей каждого пациента показало индивидуальные различия в изменении транскриптомного профиля моноцитов после лечения (см. рис. 3а), а сравнение с помощью кластерного анализа - различия в этом профиле до и после химиотерапии (рис. 3б).

Анализ дифференциальной экспрессии отдельных генов позволил получить генную сигнатуру, характерную для моноцитов больных после проведения НАХТ (рис. 3в). Неоадъювантная химиотерапия инициировала повышение экспрессии в моноцитах 152 генов при log2FoldChange >0,75 и ^-уа1ие <0,001; наиболее выраженными среди которых были гены гемоглобина бета (НВВ), моноацилглицерол липазы (MGLL), транскрипционного фактора ^Я4А2), уридин-цитидин ки-назы (иСК1), деубиквитиназы (YOD2), белка-транспортера (АВСА2), 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат синтазы 2 (PAPSS2), транспортера аденозинтрифос-фата (АТФ) (АТР10А) и компонент комплекса ГТФазы ^ЕРТШ1). Снижение экспрессии отмечено для 89 генов с 1og2Fo1dChange >0,75 и р-уа1ие <0,001, среди которых наиболее выражены гены регулятора нуклео-плазматического траспорта кариоферина а2 (KPNA2), субъединицы эндонуклеазы (ЕЯСС4), трансмембранного компонента эндоплазматического ретикулума (JAGN1), компонента аутофагосом (RUBCNL), катализатора метилирования гистонов (SMYD4) и галакто-зилтрансферазы (B3GALT4) (рис. 3в, г).

После проведения НАХТ в моноцитах активируются процессы, связанные с модификацией тубулина, ретроградная транспортировка липидов из эндоплаз-матического ретикулума в комплекс Гольджи с активацией каскада ГТФазы, а также процессы формирования аггресом (рис. 4) [19]. При этом подавляются процессы, ассоциированные с ответом на чужеродные молекулы и сигнальными путями интерферонов у и а (см. рис. 4).

Предсказание эффективности неоадъювантной химиотерапии при раке молочной железы с учетом особенностей субпопуляций моноцитов. Результаты, полученные с помощью метода нелинейной логистической регрессии, позволили нам разработать математическую модель прогноза для предсказания плохого ответа на НАХТ у больных РМЖ. При построении модели были использованы данные о популяционной структуре моноцитов у пациенток до лечения. Расчет вероятности ответа на НАХТ у больных РМЖ выполнялся по следующей формуле:

Y = 100,67 - 0,3X - 0,08Xj + 0,185X3 + 0,259X4 -- 0,007X5 + 0,503X6,

' 5 ' 6'

где Y - функция, характеризующая больных РМЖ с отсутствием ответа на НАХТ; Xt - относительное количество CD14+16--моноцитов в крови; X2 - относительное количество CD14+16+-моноцитов в крови; X - относительное количество CD14-16+-моноцитов в крови; X4 - относительное количество CD14+16HLA-DR+-моноцитов в крови; X5 - относительное количество CD14+16+HLA-DR+-моноцитов в крови; X6 - относительное количество CD14-16+HLA-DR+-моноцитов в крови.

Параметры модели: F (9,31) = 3,12; X Уилкса = 0,59; p <0,017.

Чувствительность предсказательной модели составила 83 %, специфичность - 96 %.

ОБСУЖДЕНИЕ

Современная химиотерапия основана на системном введении одного препарата или комбинации лекарственных средств, обладающих цитостатическим и цитотоксическим действием. Помимо уничтожения раковых клеток химиотерапевтическое лечение влияет на другие делящиеся клетки организма [12]. Поскольку многие клетки иммунной системы, в частности моноциты, происходят из гемопоэтических клеток-предшественников, данная терапия может угнетать продукцию зрелых форм моноцитов [12, 13]. Исследования, которые сосредоточены на изучении влияния цитотоксических и цитостатических препаратов на моноциты в условиях in vitro, не позволяют учесть весь комплекс факторов организма. В этом аспекте НАХТ, которая проводится до резекции опухоли, является оптимальной биологической моделью исследования модулирующего влияния химиотерапии на клетки моноцитарно-макрофагального ряда.

Неоадъювантная химиотерапия в разной степени влияет на популяции циркулирующих моноцитов (см. рис. 2). Мы обнаружили, что данная терапия снижает содержание CD14+16+HLA-DR+-клеток (см. рис. 2). Ранее нами было продемонстрировано, что пониженное

Пациент/ Г П П rm 1 h in n

• Be? 513 * A Patient 6

Образец пациента/ Patient sample

• 7 8

т 9 10 . 11 12 : 13 14

Статус образца / Condition

Bc

Bcch

;

i -i

-3

Компонента 1: 49% вариабельности / PCI: 49 % variance

!

m

_

__ 4__ -

■ fr

1 1

1 1

„_

—

1 4 1 1 H— 4—L

J J__

Г

y

"1 1" lr

1—

-1 \ -

■ 1 i

1

■ I II

К ■

i I 41 !■ 1 1 nj "

i—

L

Bc 6c h S го a c c hh SS 3 rocacaa 9 iii n о —> к - з- n n n 1 3" 3" 3 1Л 1 1 1 Bc Bc 4c _ Bc 6c h S го ca a о hh SS ro c 9i 1-1 с 3" S _ Bc Bc ic ;c ГО ro cc c

Образец

пациента/

Patient sample

HBB

MGLL

NR4A2

UCK1

YOD1

ABCA2

PAPSS2

ATP10A

CCDC59

PPIEL

SEPTIN11

MRPL4

BTBD3

EP400P1

CHST2

CIAPIN1

NDUFA13

TUBB6

THAP11

ZMYND11

ERMP1

NDUFB1

ANAPC1

TSPOAP1

MYO1C

CDK6

TMEM183A ZNF7 NUAK2 KPNA2 ERCC2 JAGN1 RUBCNL SMYD4 ERCC4 B3GALT4 ABRAXAS1 TSNAX LTB4R2 FPR2 DHX58 RBAK PEX11B KYAT3 EXOSC1 IFIT3 RNASEK DBT PPID ZMYM5 ZBTB8OS IFIT1 RNASAK ZNF557 RN7SL1 I EMG1 ZNF845 XRCC4 MFAP3 ZNRF1

Образец пациента / Patient sample

;

i -i

Пациент/ Patient

6

7

8

9

i0

ii i;

13

i4

Образец / Sample

Bc

Bcch

Пациент / Patient

6 7 8 9

—'

10 11

i;

13

I 14

Образец / Sample

Bc Bcch

ЧТ

pj о

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж

to

LU

и

z <

>

a

<

3" 3" 3" I S S S

l/l 3" 3"

VFAf-.t

о m

a.

в;

li m

о ж.

и >

i Без статистической значимости / Not significant

log; Fold Change log;

FoldChange

p-value

p-value и log; FoldChange /

p-value and log2 FoldChange

а

в

г

8

6

4

;

0

Рис. 3. Влияние неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) на транскриптомный профиль циркулирующих моноцитов больных раком молочной железы до и после лечения: а — распределение образцов до (Bc) и после (Bcch) НАХТ при использовании метода главных компонент; б — различия в транскриптоме, выявленные с помощью иерархического кластерного анализа; в — топ-20 генов, характеризующихся наибольшей и наименьшей экспрессией в моноцитах больных раком молочной железы до и после НАХТ на основании дифференциальной экспрессии с log2FoldChange; г — Volcano-диаграмма распределения генов РНК-секвенирования до (слева) и после (справа) НАХТ

Fig. 3. Neoadjuvant chemotherapy (NACT) alteration to the transcriptome of circulating monocytes in breast cancer patients: а — principal-component analysis plot of genes expressed in monocytes from breast cancer patients before (Bc, circles) and after (Bcch, triangles) NACT; б — hierarchical clustering of all differentially expressed genes between monocytes before (Bc) and after (Bcch) NACT; в — top 20 differentially expressed genes log2FoldChange genes between monocytes before (Bc) and after (Bcch) NACT; г — Volcano-plot of RNA-Seq data between monocytes before (left) and after (right) NACT

чт

сч

^ Постшаперониновая конденсация тубулина (реактом) /

^^ Reactome post chaperonin tubulin folding pathway

RHO ГТФазы-зависимая активация белка IQGAP (реактом) / , Reactome RNO GTPases activate IQGAPS

Агрефагия (реактом) /

^^ Reactome aggrephagy

Двигательная активность (реактом) / Reactome kinesis

t^ Карбокситерминальные посттрансляционные модификации тубулина (реактом) /

^ Reactome carboxyterminal post translational modifications of tubulin

^J Активация аМРК зависимая от белка NMDARS (реактом) /

^ Reactome activation of AMPK downstream of NMDARS

РНК-полимераза зависимая транскрипция ядерной субъединицы рРНК (генная онтология) / GOBP nucleolar large RRNA transcription by RNA polymerase Регуляция активности р53 посредством ацетилирования (реактом) / W Reactome regulation of TP53 activity through acetylation

Включение фактора NUMA в митотические центросомы (реактом) / Reactome recruitment of NUMA to mitotic centrosomes Copi-независимый ретроградный трафик из комплекса Голвджи в эндоплазматический ретикулум (реактом) / Reactome copi independent complex Golgi to ERretrograde traffic РНК-полимераза зависимая транскрипция большой ядерной субъединицы рРНК / GOBP nucleolar large RRNA transcription by RNA polymerase Образование факторов конденсации тубулина под действием белка CC TRIC (реактом) / ^J Reactome formation of tubulin folding intermediates by CC TRIC

Каскад активации TGF-p (молекулярные пути) / Hallmark TGF-в signaling Путь рециркуляции фактора L1 (реактом) /

^^ Reactome recycling pathway of LI

NN Факторы, участвующие в развитии мегакариоцитов и тромбоцитов (реактом) /

^^ Reactome factors involved in megakaryocyte development andplateledproduction

Регуляция сплайсинга мРНК с помощью сплайсосом (генная онтология) / I I GOBR regulation of MRNA splising via spliceosome

Фолдинг протеина (реактом) / Reactome protein folding

^^ Ответ на мышьяксодержащее вещество (генная онтология) /

J? GOBR response to arsenic containing substance

Антероградный транспорт, опосредованный комплексом Copi (реактом) / Reactome copi mediated anterograde transport Привлечение белков и комплексов митотической центросомы (реактом) / Reactome recruitment of mitotic centrosome proteins and complexes Активация NMDA-рецепторов и постсинаптические события (реактом) / ^^ Reactome activation of NMDA receptors and postsynaptic events

Взаимодействие с фактором L1CAM (реактом) / ^^ Reactome LICAM interactions

Регуляция сплайсинга РНК (генная онтология) / ^ GOBR regulation of RNA splicing

^^ Метаболизм аминокислот семейства аспартатов (генная онтология) /

W GOBR aspartate family amino acid metabolic process

Регуляция процессинга мРНК (генная онтология) / GOBR regulation of mRNA processing

^ Элонгация трансляции у эукариот (реактом) /

Reactome eukaryotic translation elongation Рибосомы (киотская генная онтология) /

^ Kegg ribosome

Ответ на интерферон у (молекулярные пути) / Hallmark interferon у response

^^ Защитная реакция на бактерии (генная онтология) /

^^ GOBR defense response to bacterium

^^ Нацеливание котрансляции белка на мембрану (генная онтология) /

^^ GOBR cotranslation protein targeting to membrane

^^ Регуляция лейкоцитарной цитотоксичности (генная онтология) /

GOBR regulation of leukocyte mediated cytotoxicity Модификация рРНК (генная онтология) /

^ GOBR RRNA modification

Шаперонзависимый фолдинг белков (генная онтология) / GOBR chaperone mediated protein folding Ответ на двуцепочечную экзогенную ДНК (генная онтология) / ~ GOBR cellular response to DSRNA

^^ Сигнальный путь цитоплазматического рецептора распознавания воздействий вируса (генная онтология) /

GOBR cytoplasmic pattern recognition receptor signaling pathway in response to virus Антимикробные пептиды (реактом) / Reactome antimicrobial peptides Родопсин-подобные рецепторы класса A1 (реактом) / Reactome class AI rhodopsin like receptors Ответ на ксенобиотики (генная онтология) / GOBR response to xenobiotic stimulus Гуморальный иммунный ответ (генная онтология) / GOBR humoral immune response Рецепторы, связывающие пептидные лиганды (реактом) / Reactome peptide ligand binding receptors Ответ на химический стимул (генная онтология) / GOBR detection of chemical stimulus Ответ на интерферон а (генная онтология) / GOBR response to interferon a Позитивная регуляция ответа на цитокиновый стимул (генная онтология) / GOBR positive regulation of response cytokine stimulus Клеточный ответ на экзогенную двуцепочечную ДГК (генная онтология) / GOBR cellular response to exogenous DSRNA Сигналинг интерферона у (реактом) / Reactome interferon в signaling Детекция биологических стимулов (генная онтология) / GOBR detection of biotic stimulus Противомикробный гуморальный ответ (генная онтология) / GOBR antimicrobial humoral response Ответ на интерферон а (молекулярные пути) / Hallmark interferon a response Детекция чужеродных организмов (генная онтология) / GOBR detection of other organism Детекция внешних биологических стимулов (генная онтология) / GOBR detection of external biotic stimulus

Группа / Group ^^ zBc zBcch

-2 -1 0 1 2

Рис. 4. Сигнальные пути, активированные (красный цвет) и угнетенные (синий цвет) в моноцитах у больных раком молочной железы после проведения неоадъювантной химиотерапии. aBc — сигнальные пути со сниженной активацией; zBcch — сигнальные пути с повышенной активацией; NES — нормализованный показатель обогащения; TGF-p — фактор некроза опухоли в; мРНК — матричная РНК

Fig. 4. The results demonstrate top up-regulated (red) and down-regulated (blue) signaling pathways in monocytes of breast cancer patients. aBc — signaling pathways with reduced activation; zBcch — signaling pathways with increased activation; NES — normalized enrichment index; TGF-в — tumor necrosis, factor в; mRNA — matrix RNA

количество клеток этой популяции характерно для пациентов, не отвечающих на НАХТ [10]. Доказано, что CD14+16+-клетки являются активными продуцентами основного провоспалительного цитокина — фактора некроза опухоли [20, 21], в то время как низкая экспрессия рецептора HLA-DR на моноцитах происходит при их дифференцировке в миелоидные клетки-супрессоры, которые подавляют иммунный ответ [22]. Таким образом, сниженная экспрессия рецептора HLA-DR на моноцитах CD14+16+-популяции может быть связана с иммуносупрессией, а содержание CD14+16+HLA-DR+-моноцитов — являться чувствительным к НАХТ параметром, что позволяет рассматривать его в качестве маркера для прогнозирования эффективности данной терапии при РМЖ. Разработанная нами математическая модель для предсказания результата НАХТ подтверждает это предположение. Данная модель учитывает содержание основных популяций моноцитов и экспрессию на них HLA-DR и обладает высокими чувствительностью и специфичностью. Полученные результаты являются основанием для их дальнейшей верификации на больших выборках больных РМЖ с возможностью трансляции результатов в клиническую практику.

Ранее показано, что транскриптомный профиль моноцитов больных РМЖ и здоровых женщин имеет выраженные различия в модельных организмах и группах больных [6, 10, 23]. Неоадъювантная химиотерапия у больных РМЖ оказывает менее выраженное влияние на транскриптомный профиль моноцитов (см. рис. 3). Анализ с помощью метода главных компонент не показал сильных различий между группами образцов до и после лечения (см. рис. 3а). Однако сравнение образцов для каждой больной попарно до и после НАХТ показывает, что у большинства пациенток химиотерапия вызывает изменения в транс-криптоме моноцитов, но на индивидуальном уровне (см. рис. 3а). Кроме того, результаты кластерного анализа подтвердили различия в транскриптомном профиле моноцитов до и после НАХТ (рис. 3б). Таким образом, отмечено моделирующее влияние данной терапии не только на абсолютное количество моноцитов крови, как это было показано ранее, но и на транскрип-томный профиль и биологию клеток [24].

Сигнатура дифференциально экспрессированных генов свидетельствует об изменении биологических процессов в моноцитах после проведения химиотерапии (см. рис. 3в, г). После НАХТ в моноцитах повышается экспрессия транскриптов молекул, ответственных за транспорт липидов, таких как моноацилглице-

роллипаза (MGLL), и белка-транспортера АВСА2 [25, 26]. Последнее согласуется с активацией процесса транспортировки везикул из аппарата Гольджи в эндоплаз-матический ретикулум (см. рис. 4). Интересно, что дефицит MGLL способствует TLR4-зависимой активации модельных макрофагов, что свидетельствует о способности MGLL подавлять провоспалительную активность моноцитов и макрофагов [26]. Известно, что моноциты и макрофаги, находящиеся в состоянии противовоспалительной М2-подобной поляризации, характеризуются активацией липидного обмена [27]. Кроме того, после НАХТ в моноцитах повышается экспрессия ядерного фактора NR4A2, который обеспечивает их противовоспалительную активность [28, 29]. Повышение экспрессии этих генов свидетельствует об активации в моноцитах процессов, направленных на подавление воспаления. Кроме того, сигнальные пути, связанные с ответом иммунных клеток на интер-фероны, эндогенную ДНК и цитокиновые стимулы, подавляются после НАХТ (см. рис. 4).

Известно, что цитостатические препараты, входящие в состав схем НАХТ, действуют на предшественники моноцитов и макрофагов. После НАХТ наблюдается повышение уровня экспрессии генов иСК1 и YOD1 в моноцитах (рис. 3в, г). Известно, что белки иСК1 и YOD1 обеспечивают в клетке процесс деуби-квитинизации, связанный со снятием «меток смерти» с клеточной ДНК [30, 31]. Ранее в отношении моноцитов активация системы деубиквитинизации в ответ на действие цитостатических агентов описана не была. Мы предполагаем, что это может быть одним из механизмов восстановления пула моноцитов в ответ на НАХТ.

ЗАКЛючЕНИЕ

В ходе сравнительного исследования содержания HLA-DR+- и CD163+-моноцитов при РМЖ до и после НАХТ обнаружено снижение уровня CD14+16+-кле-ток, экспрессирующих рецептор HLA-DR, после лечения. Показано, что после НАХТ индивидуальный транскриптомный профиль моноцитов каждого пациента изменяется, а экспрессия генов, связанных с ли-пидным обменом, подавлением воспалительного ответа и деубиквитинизации, повышается в моноцитах всех больных. Применение метода математического моделирования, определяющего содержание CD14+16-, CD14+16+- и CD14-16+-моноцитов до лечения и экспрессию рецептора HLA-DR на них, позволяет предсказать эффективность НАХТ с чувствительностью 83,3 % и специфичностью 96 %.

чт

сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а.

в;

£

о ж.

и >

чт

сч О сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

о m

а. те

m

о ж.

и >

1. Злокачествен^1е новообразования в Росии в 2021 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. 252 с. Malignanttumors in Russia in 2022 (morbidity and mortality).

Ed. by A.D. Kaprin, V.V. Starinskiy, A.O. Shakhzadova. Moscow: MNIOI im. P.A. Gertsena - filial FGBU "NMITS radiologii" Minzdrava Rossii, 2022. 250 p. (In Russ.).

2. Kim G., Pastoriza J.M., Qin J. et al. Racial disparity in distant recurrence-free survival in patients with localized breast cancer:

a pooled analysis of National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project trials. Cancer 2022;128(14):2728-35. DOI: 10.1002/cncr.34241

3. Qiu S.Q., Waaijer S.J.H., Zwager M.C. et al. Tumor-associated macrophages in breast cancer: innocent bystander or important player? Cancer Treat Rev 2018;70:178-89.

DOI: 10.1016/j.ctrv.2018.08.010

4. Linde N., Casanova-Acebes M., Sosa M.S. et al. Macrophages orchestrate breast cancer early dissemination and metastasis. Nature Commun 2018;9(1):21. DOI: 10.1038/s41467-017-02481-5

5. Larionova I., Tuguzbaeva G., Ponomaryova A. et al. Tumor-associated macrophages in human breast, colorectal, lung, ovarian and prostate cancers. Front Oncol 2020;10:566511.

DOI: 10.3389/fonc.2020.566511

6. Cassetta L., Fragkogianni S., Sims A.H. et al. Human tumor-associated macrophage and monocyte transcriptional landscapes reveal cancer-specific reprogramming, biomarkers, and therapeutic targets. Cancer Cell 2019;35(4):588-602.e10.

DOI: 10.1016/j.ccell.2019.02.009

7. Ziegler-Heitbrock L. Blood monocytes and their subsets: established features and open questions. Front Immunol 2015;6:423.

DOI: 10.3389/fimmu.2015.00423

8. Olingy C.E., Dinh H.Q., Hedrick C.C. Monocyte heterogeneity and functions in cancer. J Leukoc Biol 2019;106(2):309-22. DOI: 10.1002/JLB.4RI0818-311R

9. Zhang B., Cao M., He Y. et al. Increased circulating M2-like monocytes in patients with breast cancer. Tumour Biol 2017;39(6):1010428317711571. DOI: 10.1177/1010428317711571

10. Patysheva M., Larionova I., Stakheyeva M. et al. Effect of early-stage human breast carcinoma on monocyte programming. Front Oncol 2022;11:800235. DOI: 10.3389/fonc.2021.800235

11. Cassetta L., Pollard J.W. A timeline of tumour-associated macrophage biology. Nat Rev Cancer 2023;23(4):238-57. DOI: 10.1038/s41568-022-00547-1

12. Galluzzi L., Buque A., Kepp O. et al. Immunological effects of conventional chemotherapy and targeted anticancer agents. Cancer Cell 2015;28(6):690-714. DOI: 10.1016/j.ccell.2015.10.012

13. Zitvogel L., Apetoh L., Ghiringhelli F. et al. Immunological aspects of cancer chemotherapy. Nat Rev Immunol 2008;8(1):59-73. DOI: 10.1038/nri2216

14. Hughes R., Qian B.-Z., Rowan C. et al. Perivascular M2 macrophages stimulate tumor relapse after chemotherapy. Cancer Res 2015;75(17):3479-91. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3587

15. Kroemer G., Galassi C., Zitvogel L. et al. Immunogenic cell stress and death. Nat Immunol 2022;23(4):487-500.

DOI: 10.1038/s41590-022-01132-2

16. Stakheyeva M., Eidenzon D., Slonimskaya E. et al. Integral characteristic of the immune system state predicts breast cancer outcome. Exp Oncol 2019;41(1):32-8.

17. Dobin A., Davis C.A., Schlesinger F. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 2013;29(1):15—21.

DOI: 10.1093/bioinformatics/bts635

18. Hartley S.W., Mullikin J.C. QoRTs: a comprehensive toolset for quality control and data processing of RNA-Seq experiments. BMC Bioinformatics 2015;16(1):224. DOI: 10.1186/s12859-015-0670-5

19. van Helden S.F., Anthony E.C., Dee R. et al. Rho GTPase expression in human myeloid cells. PLoS One 2012;7(8):e42563. DOI: 10.1371/journal.pone.0042563

20. Belge K.U., Dayyani F., Horelt A. et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF.

J Immunol 2002;168(7):3536—42. DOI: 10.4049/jimmunol.168.7.3536

21. Mysliwska J., Smardzewski M., Marek-Trzonkowska N. et al. Expansion of CD14+CD16+ monocytes producing TNF-a in complication-free diabetes type 1 juvenile onset patients. Cytokine 2012;60(1):309—17. DOI: 10.1016/j.cyto.2012.03.010

22. Mengos A.E., Gastineau D.A., Gustafson M.P. The CD14(+)HLA-DR(lo/neg) monocyte: an immunosuppressive phenotype that restrains responses to cancer immunotherapy. Front Immunol 2019;10:1147. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01147

23. Robinson A., Burgess M., Webb S. et al. Systemic influences

of mammary cancer on monocytes in mice. Cancers 2022:14(3):833. DOI: 10.3390/cancers14030833

24. Foulds G.A., Vadakekolathu J., Abdel-Fatah T.M.A. et al. Immune-phenotyping and transcriptomic profiling of peripheral blood mononuclear cells from patients with breast cancer: identification of a 3 gene signature which predicts relapse of triple negative breast cancer. Front Immunol 2018;9:2028. DOI: 10.3389/fimmu.2018.02028

25. Rahaman O., Ganguly D. Endocannabinoids in immune regulation and immunopathologies. Immunology 2021;164:242-52.

DOI: 10.1111/imm.13378

26. Xiang W., Shi R., Kang X. et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation

and cancer progression. Nat Commun 2018;9(1):2574. DOI: 10.1038/s41467-018-04999-8

27. Li L., Tian Y. The role of metabolic reprogramming of tumor-associated macrophages in shaping the immunosuppressive tumor microenvironment. Biomed Pharmac 2023;161:114504.

DOI: 10.1016/j.biopha.2023.114504

28. Navone N.D., Perga S., Martire S. et al. Monocytes and CD4+

T cells contribution to the under-expression of NR4A2 and TNFAIP3 genes in patients with multiple sclerosis. J Uroimmunol 2014;272(1—2): 99-102. DOI: 10.1016/j.jneuroim.2014.04.017

29. Crean D., Cummins E.P., Bahar B. et al. Adenosine modulates NR4A orphan nuclear receptors to attenuate hyperinflammatory responses in monocytic cells. J Immunol 2015;195(4):143648. DOI: 10.4049/jimmunol.1402039

30. Matchett E.C., Ambrose E.C., Kornbluth J. Characterization ofuridine-cytidine kinase like-1 nucleoside kinase activity and its role in tumor growth. Biochem J 2022;479(11):1149-64. DOI: 10.1042/BCJ20210770

31. Han Z., Jia Q., Zhang J. et al. Deubiquitylase YOD1 regulates CDK1 stability and drives triple-negative breast cancer tumorigenesis. J Exp Clin Cancer Res 2023;42(1):228. DOI: 10.1186/s13046-023-02781-3

Вклад авторов ^

М.Р. Патышева: разработка дизайна исследования, выполнение проточной цитометрии, РНК-секвенирование моноцитов крови, анализ ^

данных, написание текста статьи; ®

CN

М.Н. Стахеева: разработка концепции и дизайна исследования, анализ данных, написание текста статьи; Е.С. Григорьева: выполнение проточной цитометрии и проточной цитометрической сортировки моноцитов крови; П.С. Ямщиков: биоинформатическая обработка данных РНК-секвенирования; И.В. Ларионова: подготовка библиотек секвенирования;

А.А. Будницкая: обработка данных проточной цитометрии, подготовка базы данных о пациентах, подготовка иллюстративного материала; и Н. А. Тарабановская: подбор пациентов, сбор клинических данных о пациентах; О

Н.В. Чердынцева: разработка дизайна исследования, обработка и анализ результатов; О

Ю.Г. Кжышковска: разработка концепции исследования, поиск грантовой поддержки исследования, обработка и анализ результатов. ^

Authors' rontribution

О

M.R. Patysheva: development of the study design, execution of flow cytometry, RNA sequencing of blood monocytes, data analysis, article writing; ^

M.N. Stakheeva: development of the concept and design of the study, data analysis, article writing; ^

E.S. Grigorieva: performing flow cytometry and flow cytometric sorting of blood monocytes; Z^

P.S. Yamshchikov: bioinformatic processing of RNA sequencing data; и

I.V. Larionova: preparation of sequencing libraries; ¡j

A.A. Budnitskaya: processing of flow cytometry data, preparation of a patient database, preparation of illustrative material; О

N.A. Tarabanovskaya: selection of patients, collection of clinical data on patients; S

N.V. Cherdyntseva: development of the research design, processing and analysis of the results; Z

Yu.G. Kzhyshkovska: development of the research concept, search for grant support for the research, processing and analysis of the results. ^

LU

ORCID авторов / ORCID authors ^

М.Р. Патышева / M.R. Patysheva: https://orcid.org/0000-0003-2865-7576 <

М.Н. Стахеева / M.N. Stakheyeva: https://orcid.org/0000-0003-0601-2240 §

Е.С. Григорьева / E.S. Grigoryeva: https://orcid.org/0000-0003-4671-6306 < П.С. Ямщиков / P.S. Iamshchikov: https://orcid.org/0000-0002-0646-6093 И.В. Ларионова / I.V. Larionova :https://orcid.org/0000-0001-5758-7330

Н.А. Тарабановская / N.A. Tarabanovskaya: https://orcid.org/0000-0003-1630-4466 _

Н.В. Чердынцева / N.V. Cherdyntseva: https://orcid.org/0000-0003-1526-9013 L_

Ю.Г. Кжышковска / J.G. Kzhyshkowska: https://orcid.org/0000-0003-0898-3075 ®

О

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ^

Conflict of interest. The authors declare that there is no conflict of interest. EE

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-25-00435). Funding. The work was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation (grant No. 22-25-00435).

в; m

о

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики

Протокол исследования одобрен локальным комитетом по биоэтике Научно-исследовательского института онкологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (протокол № 10 от 05.12.2019 г.). Все участники подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics ^

The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of Cancer Research Institute of Tomsk National Research Medical Center _ of the Russian Academy of Sciences (protocol No. 10 dated 05.12.2019). X

All patients gave written informed consent to participate in the study.

U >

Статья поступила: 09.11.2023. Принята к публикации: 13.02.2024. Article submitted: 09.11.2023. Accepted for publication: 13.02.2024.