CC BY
117
УДК 579.61; 579.25
Попова Л.П., Уткина Т.М., Карташова О.Л.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург E-mail:labpersist@mail.ru
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА STAPHYLOCCOCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ РАЗНЫХ ТИПОВ
Изучены биологические свойства Staphylococcus aureus, выделенных от бактерионосителей разных типов - антикарнозиновая активность, способность формировать биопленки, чувствительность к антибиотикам. Определены генетические детерминанты патогенности у «носительс-ких» штаммов золотистых стафилококков - гены lukS и lukF, sec 3, clfA, clfB, agr и mecA. Установлено что штаммы S.aureus, выделенные от резидентных бактерионосителей, чаще обладали ан-тикарнозиновой активностью и способностью образовывать биопленки с более высокими значениями признаков, чем штаммы, выделенные от транзиторных. Данные признаки могут быть использованы как эпидемиологические маркеры «носительских» штаммов стафилококков. Обнаруженные детерминанты патогенности, вероятно, могут обуславливать возникновение эндогенных инфекций.
Ключевые слова: бактерионосители, Staphylococcus aureus, факторы персистенции, анти-биотикорезистентность, генетические детерминанты патогенности.
Введение
Установлено, что стафилококковые бактерионосители являются источниками эпидемиологической опасности. Условия формирования резидентного бактерионосительства связаны с наличием у стафилококковой микрофлоры особых свойств, обеспечивающих ее адаптацию к условиям, складывающимся на слизистой оболочке передних отделов носовых ходов, и таким образом, ответственных за длительное сохранение микроорганизма в данной экологической нише. Показано, что антилактоферриновая и 8^А-протеазная активности, а также их комбинация, могут быть использованы как эпидемиологические маркеры «носительских» штаммов стафилококков [1]. Вместе с тем, ведущим свойством золотистых стафилококков, определяющим формирование бактерионосительства, является их антикарнозиновая активность [2]. Кроме того установлено, что длительное существование стафилококков в организме хозяина обеспечивается их способностью формировать биопленки [3]. Однако данные свойства ранее не определялись в совокупности у штаммов стафилококков, выделенных от бактерионосителей разных типов. Интерес представляет также изучение антибиотикорезистентности и распространенности генетических детерминант патогенности среди штаммов стафилококков, вегетиру-ющих на слизистой оболочке переднего отдела носа, как потенциальных возбудителей эндогенных инфекций.
В этой связи целью работы явилось изучение биологических свойств стафилококков, выде-
ленных от бактерионосителей разных типов, и выявление у них генов - маркёров патогенности.
Материалы и методы
Трехкратно на наличие S.aureus исследовано слизистое отделяемое переднего отдела носа 105 детей (9-12 лет), проживающих в с. Шар-лык Оренбургской области. Выделенные культуры идентифицировали по биохимическим признакам с использованием тест-систем «StaphyTest» («Lachema», Чехия). Персистент-ный потенциал культур оценивали по антикар-нозиновой активности (АКрА) [4] и способности к образованию биопленок (БО) [5]. Значения биопленкообразования стафилококков выражали в условных единицах (ед.), которые рассчитывали как отношение оптической плотности изучаемой культуры (опыт) к оптической плотности раствора в контроле. Устойчивость к следующим антибиотикам: тетрациклину, ципрофлоксацину, ванкомицину, оксациллину, имипинему, левофлоксацину, амоксациллину, цефалоспоринам 1, 3 и 4 поколения, гентами-цину и фузидину определяли по [6]. У 24 штаммов S.aureus, выделенных от бактерионосителей разных типов, дополнительно исследовали генетические детерминанты патогенности (lukS и lukF, sec 3, clfA, clfB, agr и mecA).
Выделение ДНК осуществляли из бактериальной суспензии (107 КОЕ/мл) суточной агаровой культуры сорбционным методом с использованием набора «Рибо-сорб» («Интер-ЛабСервис», Россия) согласно рекомендации
Попова Л.П. и др.
Фенотипическая и генетическая характеристика..
производителя. Амплификацию проводили с применением подобранных праймеров (табл.) на термоциклере МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретичес-кого разделения в 1,5% агарозном геле с использованием стандартных наборов «ЭФ» вариант 300 («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Амп-ликоны визуализировали бромистым этидием при помощи фотодокументационной системы Gel Camera System (UVP, Inc. США). Размер амплифицируемых фрагментов определяли в сравнении с маркерными последовательностями (13 фрагментов от 0,25 до 10 Kb, «Сибэн-зим», Россия).
Статистическую обработку осуществляли с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [7].
Результаты
В работе нами изучены биологические свойства золотистых стафилококков, выделенных от резидентных и транзиторных бактерионосителей.
При изучении распространенности АКрА стафилококков было установлено, что штаммы, выделенные от резидентных бактерионосителей, чаще обладали способностью к инактивации кар-нозина по сравнению со штаммами, выделенными от транзиторных (100% и 63%, соответственно). Причем среди стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей, 56% обладало максимальным уровнем признака, равным 3 мг/мл, 28% - в диапазоне от 1,5 до 2,9 мг/мл и 16% - 0,7-1,4 мг/мл. Среди стафилококков, выделенных от транзиторных бактерионосителей, 35% обладали максимальным уровнем признака, 28% в диапазоне 1,5-2,9 мг/мл и 37% штаммов не обладали изученной активностью.
При изучении выраженности АКрА было показано, что среднее значение признака у стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей, было в 1,4 раза выше по сравнению со средними значениями признака у стафилококков, выделенных от транзиторных бактерионосителей (1,8 и 1,3 мг/мл, соответственно, p<0,05).
Далее нами была изучена способность золотистых стафилококков образовывать биопленки. Штаммы золотистых стафилококков,
выделенных от резидентных бактерионосителей, в 49% случаев характеризовались способностью к биопленкообразованию, тогда как для стафилококков, выделенных от транзиторных бактерионосителей, БО было характерно в 28,6% случаев. При этом выраженность признака у штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей, была равна 1,5 ед., а у штаммов от транзиторных - 1,1 ед. (р<0,05).
При изучении чувствительности к 12 антибиотикам разных групп было показано, что штаммы Б.аитеш, выделенные как от резидентных, так и транзиторных бактерионосителей, были высоко чувствительны к фторхинолонам (ципрофлоксацин 95,3% и 93%, левофлоксацин 90,8% и 85,7%, соответственно), оксациллину (100% и 100%), амоксациллину (58,6% и 57%); цефалоспоринам 1 поколения (97,7% и 100%); цефалоспоринам 3 поколения (100% и 93%); цефалоспоринам 4 поколения (86,2% и 85,7%); имипинему (100% и 100%); ванкомицину (95,4% и 100%); гентамицину (95,4% и 100%); тетрациклину (79,3% и 72%); фузидину (97,7% и 100%). Кроме того установлено, что штаммы Б.аитеш от резидентных бактерионосителей были резистентны к 8 изученным антибиотикам, тогда как штаммы, выделенные от транзи-торных бактерионосителей - к 7 антибиотикам. Причем, в 4,6% случаев золотистые стафилококки, выделенные от резидентных бактерионосителей, были резистентны к ванкомицину, тогда как среди штаммов, выделенных от транзитор-ных бактериносителей, таких штаммов не зарегистрировано. 93% штаммов, выделенных от резидентных, и 100% - от транзиторных бактерионосителей оказались резистентными к ампициллину.
Далее нами проведено выявление фрагментов ДНК Б.аитет, специфичным соответствующим детерминантам факторов патогенности у стафилококков, выделенных от резидентных и транзиторных бактерионосителей.
Полученные результаты показали наличие генов-регуляторов agr у всех штаммов стафилококков, выделенных от бактерионосителей обоих типов. Все выделенные штаммы характеризовались наличием генов с^Л и с1Ш.
У одного штамма, выделенного от транзи-торного бактерионосителя, определен ген па-тогенности 1икБ, у двух штаммов (по одному от бактерионосителей обоих типов) - ген 1икБ, ко-
Естественные науки
дирующий синтез экзопротеина F цитолитичес-кого токсина Panton-Valentine лейкоцидина. Ген sec 3, кодирующий синтез стафилококкового энтеротоксина, определен у трех штаммов, выделенных от резидентных (2 штамма) и тран-зиторных (1 штамм) бактерионосителей. Вместе с тем, ни у одного из выделенных штаммов не выявлены гены mecA.
Таким образом, в работе показано, что штаммы S.aureus, выделенные от резидентных бактерионосителей, чаще обладали АКрА и спо-
собностью образовывать биопленки с более высокими значениями признаков, чем штаммы, выделенные от транзиторных. Данные признаки могут быть использованы как эпидемиологические маркеры «носительских» штаммов стафилококков. Кроме того важным моментом является факт обнаружения детерминант пато-генности у штаммов золотистых стафилококков, выделенных от бактерионосителей обоих типов, что, вероятно, может обуславливать возникновение эндогенных инфекций.
8.10.2014
Работа выполнена при поддержке гранта 14-4-НП-121 «Научные проекты молодых ученых УрО РАН» «Исследование механизмов генетического контроля персистенции S.аureus»
Список литературы:
1. Карташова О.Л., Норкина А.С., Чайникова И.Н., Смолягин А.И. Фенотипическая характеристика стафилококков и местный иммунитет при бактерионосительстве // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. -№4. - С. 99 - 103.
2. Карташова О.Л., Киргизова С.Б., Потехина Л.П., Бухарин О.В. Диагностическое значение персистентных характеристик стафилококков при бактерионосительстве // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №5. -С. 13 - 16.
3. Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2011. - №1. - С. 101 - 108.
4. Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. Способность стафилококков к инактивации карнозина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - №5. - С. 545 - 546.
5. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. - 2000. - №54. - P. 49 - 79.
6. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериаль-ным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04). Клиническая микробиология и антимикробная терапия. - 2004. - №6(4). - С. 306 - 359.
7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Медгиз. - 1962.
Сведения об авторах:
Попова Лидия Петровна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук
Уткина Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук
Карташова Ольга Львовна, заведующий лабораторией по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, доктор биологических наук
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, e-mail: labpersist@mail.ru
