CC BY
65
иммунология
© коллектив авторов, 2012
УДК 616-056.43-055.5/.-092
С. Ю. Терещенко, в. А. Бабушкин, И. А. Ольховский, И. А. Новицкий, И. в. Исаков, Н. А. шакина
фенотип ^^'Сйбэ- т-лимфоцитов пуповинной КРОВИ, АССОЦИИРОВАННЫЙ с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования Атопии
НИИ медицинских проблем Севера СО РАмН, Красноярск; ГОУ вПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. в. Ф. войно-Ясенецкого, Красноярский филиал учреждения Российской академии медицинских наук ГНц РАмН, КГБУз Красноярский краевой центр СПИД
Цель исследования - определение возможной роли дисбаланса лимфоцитов Thl/Th2 при рождении в патогенезе развития атопии у детей. Исследовали субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови у 153 новорожденных детей с последующим проспективным наблюдением в течение 1 года жизни. Установлено, что низкое содержание неактивированных мононуклеаров в пуповинной крови, продуцирующихИФН-у (IFNy+CD69~), ассоциировано с атопическим семейным анамнезом (p = 0,006), проживанием беременной в городе (в сравнении с сельской местностью, p = 0,02) и мужским полом новорожденного от повторных родов (p = 0,008), что согласуется с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопии у детей. Контакт беременной с домашними животными приводит к увеличению количества активированных лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у+ (субтип IFNy+/CD69~), p = 0,03. Снижение количества неактивированных продуцирующих ИФН-у+ (IFNy+/CD69~) клеток является сильным и независимым предиктором формирования атопического дерматита у детей грудного возраста. Относительный риск формирования атопического дерматита составлял 3,4 (1,19-9,69).
Ключевые слова: атопия, дети, интерферон-у
S.Yu. Tereschenko, V.A. Babushkin, I.A. Olkhovsky, I.A. Novitsky, I.V. Isakov, N.A. Shakina THE PHENOTYPE IFNY+CD69- OF T-LYMPHOCYTES OF UMBILICAL BLOOD ASSOCIATED WITH EPIDEMIOLOGICALLY VERIFIED RISK FACTORS OF ATOPY FORMATION The article deals with the determination of possible role of imbalance of lympho-cytes TH1/TH2 at birth in pathogenesis of atopy development in children. The subpopulation compound of umbilical blood lymphocytes was examined on sam-pling of 153 newborns. The following prospective monitoring was applied during first year of life. It is established that the low content ofnonactivated mononuclears in umbilical blood producing y-interferon (IFNy+/CD69-) is associated with atopic family anamnesis (p=0.006), residing of pregnant woman in town (in com-parison with rural area, p=0.02) and male gender of newborn in case of repeated labor (p=0.008). This situation matches the epidemiologic verified risk factors of atopy formation in children. The contact of pregnant woman with domestic pets results in increasing of content of activated lymphocytes producing y-interferon (IFNy+/CD69-), p=0.03. The decrease of content of nonactivated cells producing y-interferon (IFNy+/CD69-) is a strong and independent predictor of formation of atopic dermatitis in children of infancy age. The relative risk of formation of atopic dermatitis consisted 3.4 (1.19-9.69).
Key words: atopy, childrens, y-interferon.
Хорошо известно, что предрасположенность к атопическим заболеваниям может передаваться по наследству [1]. Так, если в семье болен один из родителей либо братья и сестры, вероятность аллергических проявлений у ребенка составляет 20-40%. Если аллергическими заболеваниями страдают оба родителя, то вероятность заболевания у детей достигает 50-80% [8, 9].
Поскольку атопический дерматит (АД), бронхиальная астма и поллиноз относятся к мультифакторным, генетически детерминированным заболеваниям, важное значение приобретает поиск наследуемых биологических дефектов, которые могли бы принимать участие в патогенезе атопических заболеваний.
Одной из актуальных версий об увеличении частоты атопиче-ских заболеваний до настоящего времени остается «гигиеническая» гипотеза [12], согласно которой причиной увеличения частоты развития аллергических состояний является снижение инфекционной антигенной нагрузки на организм ребенка в связи с улучшением
Для корреспонденции:
Терещенко Сергей Юрьевич, д-р мед. наук, проф., рук. клин. отд-ния
соматического и психического здоровья
Адрес: 660022, Красноярск, ул. партизана Железняка, 3Г
Телефон: (391)-256-81-18
E-mail:legise@mail.ru
жизненных условий и уменьшением размера семьи. Снижение частоты контакта с инфекционными антигенами в детском возрасте уменьшает возможность «обучения» иммунной системы и переключения сформировавшегося в антенатальном и неонатальном периоде преимущественно ТЪ2-клеточного характера иммунного ответа в направлении более сбалансированного соотношения ТЫ- и ТЪ2-ответов. Острые респираторно-вирусные инфекции, переносимые в раннем детском возрасте, способствуют не только формированию противовирусного иммунитета, но и поляризации иммунного реагирования организма по ТЫ-пути, т. е. полноценному созреванию противоинфекционного иммунитета ребенка.
В настоящее время известно, что для атопических состояний характерен дисбаланс между различными субтипами Т-клеток, вследствие чего в ответ на антигенный стимул наблюдается избыточный синтез ^Е [6, 7, 13]. У человека функциональный субтип ТЫ-лимфоцитов характеризуется способностью вырабатывать ИНФ-у, в то время как ТК2-клетки вырабатывают другие цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13) [2, 3]. Атопические заболевания характеризуются дисбалансом этих цитокинов за счет недостатка ИНФ-у и преобладания ТК2-цитокинового профиля [4,8].
До настоящего времени неизвестно, может ли генетически детерминируемый дисбаланс ТЫЛЪ2 в виде преобладания количества лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у+ (ТЫ-субтип), формироваться внутриутробно уже к моменту рождения ребенка.
ИММУНОЛОГИЯ
Материалы и методы. Клинический эксперимент проводился в 2 этапа. На I этапе были проведены клинические наблюдения и исследование субпопуляционного состава мононуклеаров пуповинной крови (МПК) у 153 новорожденных. За данными детьми в дальнейшем проведено проспективное наблюдение в течение 1 года.
Клиническое обследование детей включало: сбор анамнестических данных с заполнением специально разработанной анкеты, содержащей данные о течении беременности, генеалогическом анамнезе, о районе и условиях проживания. Анализ течения родов и периода новорожденности проводился по медицинской документации.
Фенотипирование лимфоцитов выполнялось методом проточной лазерной цитофлюориметрии на проточном цитометре FACS СаНЬит с использованием программы SimulSET
Для верификации баланса активности ТЫ/ТЪ2 использованы следующие маркеры: процентное содержание СБ26+- и СБ30+-лимфоцитов и их отношение, а также процент клеток, синтезирующих ИНФ-у+, после стимуляции фитогемагглютини-ном (раздельно для общей популяции лимфоцитов и ТЪ (СБ4+)-лимфоцитов). Оценка внутриклеточной продукции ИНФ-у+ проводилась раздельно для лимфоцитов, имеющих и не имеющих маркер активации, - СБ69+. Исследования проводили с использованием трехцветных реагентов FASTImmune ЮТ-у/СБ69/СБ4 и программного обеспечения СeИQuest (ВБ, США) [11].
На II этапе исследования осмотрено 62 ребенка по достижении ими возраста 12 мес. На всех повторно обследованных детей, была заполнена дополнительная анкета, включающая данные о наличии и активности АД, об общем числе фебрильных эпизодов, случаев респираторных инфекций, эпизодов диареи, а также данные о вакцинации и размерах БЦЖ-рубца.
Статистическую значимость различий количественных признаков анализировали с помощью критерия Манна-Уитни.
Взятие пуповинной крови доношенных новорожденных проводилось на базе родильных домов № 5 и 6 Красноярска, исследование проб методом проточной цитометрии осуществлялось в лаборатории КГБУЗ Красноярский краевой Центр СПИД.
Результаты и обсуждение. Мы установили различия в содержании отдельных субпопуляций лимфоцитов крови новорожденных в зависимости от наличия или отсутствия атопических проявлений у ближайших родственников (см. таблицу).
Из таблицы следует, что содержание МПК, синтезирующих ИФН-у+, у детей с отягощенным аллергологическим анамнезом достоверно ниже, чем у детей, родственники которых не страдают атопией. Необходимо отметить, что уменьшение содержания мононуклеаров, синтезирующих ИФН-у+, происходит в основном за счет снижения популяции неактивированных интерфе-ронпродуцирующих клеток (ШПу+/СБ69").
Многочисленные эпидемиологические данные свидетельствуют о более низкой распространенности атопии у проживающих в сельской местности по сравнению с городским населением [2, 5]. В соответствии с «гигиенической» гипотезой механизм такого влияния связывают с недостаточной активацией звена ТЫ иммунитета у городских жителей. Однако неизвестно влияние таких экологически обусловленных различий на формирование продукции интерферона иммунными клетками плода. Нами установлено четкое снижение содержания неактивиро-
количество клеток пуповинной крови, продуцирующих ИФН-у+, у детей, имеющих родственников с атопическими заболеваниями (АЗ)
Группа детей
Параметр не имеющие родственников с АЗ (п = 109) имеющие родственников с АЗ (п = 43) P
^Пу+СБ69", клеток/мкл 7,21 (3,09-15,41) 3,50 (0,00-7,04) 0,015
% 0,76 (0,43-1,18) 0,53 (0,31-0,68) 0,038
^П+СБ69- (%) 0,20 (0,07-0,36) 0,09 (0,00-0,17) 0,006
^П+СБ69+, % 0,46 (0,27-0,77) 0,42 (0,20-0,54) > 0,05
Примечание. p - достоверность различий по методу Манна-Уитни.
ванных лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у+ (ШПу+/СБ69~), в пуповинной крови новорожденных, ассоциированное с местом проживания беременной женщины. Количество мононуклеаров, продуцирующих ИФН-у+ (субтип IFNy+/СD69") у новорожденных, матери которых были из сельской местности, составило 11,09 (6,8-18,01) клеток/мкл, а у новорожденных, матери которых жили в городе - 4,73 (0-10,49) клеток/мкл (а = 0,02).
Также было установлено, что контакт беременной с домашними животными приводит к увеличению количества активированных МПК, продуцирующих ИФН-у+ (субтип IFNy+/СD69+; p = 0,03), что также согласуется с эпидемиологическими данными о распространенности атопии и согласно "гигиенической" гипотезе может быть обусловлено стимуляцией продукции ИФН липополисахаридными эндотоксинами, содержащимися в кишечнике некоторых животных.
Нами было проанализировано также влияние порядка рождения (первые/повторные роды) пола новорожденного на продукцию ИФН-у+ МПК, что продемонстрировано на рисунке.
Факторы, влияющие на проявление атопии на первом году жизни, описаны ранее [10].
Из рисунка следует, что у новорожденных от вторых родов снижено количество неактивированных клеток, продуцирующих ИФН-у+ (первые роды - 7,2 (3,4-15,3) клеток/мкл, вторые - 2,9 (0-7,2) клеток/мкл; р = 0,013). Дополнительный анализ показал, что снижение количества ^П+/СБ69" МПК у новорожденных от повторных родов более четко проявляется у мальчиков ($ = 0,008), но не у девочек ^ = 0,427).
У 62 новорожденных, включенных в проспективное наблюдение, было оценено наличие АД в возрасте 1 года, АД установлен у 36 из них. Данные анализа показали, что только для неактивированных МПК, продуцирующих ИФН-у+ (субтип ШПу+/ СБ69-, нами найдена выраженная ассоциация с формированием АД на первом году жизни у обследованных новорожденных (количество ^у+/СБ69" МПК у детей с АД было 3,3 (0-6,4) клеток/мкл, тогда как у детей без АД - 9,4 (5,3-16,5) клеток/мкл; p = 0,006). Относительный риск формирования АД у новорожденных со сниженным количеством ^П+/СБ69" (< 5,0 клеток/мкл - медиана для нашей совокупности) составил 3,4 (1,19-9,69).
Выводы. 1. Установлено, что низкое содержание неактивированных мононуклеаров пуповинной крови (МПК), продуцирующих ИФН-у (ШПу+/СБ69"), ассоциировано с положительным атопическим семейным анамнезом ^ = 0,006), проживанием беременной в городе (в сравнении с сельской местностью; p = 0,02), мужским полом новорожденного от повторных родов ^ = 0,008), что согласуется с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопии у детей. Контакт беременной с домашними животными приводит к увеличению количества активированных МПК, продуцирующих ИФН-у+ (субтип !ЕПу+/ СБ69-; p = 0,03.
2. Снижение количества неактивированных МПК, проду-пирующих ИФН-у+ (ШПу+/СБ69~), свидетельствующее о вну-
р=0,008
•Ш
- 1 3=0,427
- и р
Первый Второй Первый Второй Порядок рождения ^ Мальчики И Девочки
Влияние порядка родов и пола новорожденного на количество мононуклеаров субтипа ШПу+/СБ69- (клеток/мкл). p - достоверность различий по методу Манна-Уитни (и).
триутробном сдвиге в балансе лимфоцитов Th1/Th2, является сильным и независимым предиктором формирования атопического дерматита у детей грудного возраста. Относительный риск формирования атопического дерматита у новорожденных со сниженным абсолютным количеством МПК субтипа IFNy+/ CD69- составил 3,4 (1,19-9,69).
3. Пренатально сформированный дисбаланс в системе Th1/ Th2, выражающийся в низком содержании мононуклеаров, способных продуцировать ИФН-у+, ассоциирован с наиболее важными эпидемиологическими факторами формирования атопиче-ского фенотипа у детей.
ЛИТЕРАТУРА
1. АдоВ. А., МокроносоваМ. А. // Иммунология. - 1997. - № 2. - С.
49-51.
2. Балаболкин И. И. // Рос. педиатр. журн. - 2002. - № 5. - С. 4-8.
3. Балаболкин И. И. // Вестн. РАМН. - 2003. - № 8. - С. 30-34.
4. ИльинаН. И. // Рос. аллергол. журн. - 2004. - № 1. - С. 37-41.
5. Пролыгина Д. Д., ХайруллинаР. М., Макарова Г. У. // Мед. имму-нол. - 2006. - № 2-3. - С. 381-382.
6. Терещенко С. Ю., Прохоренков В. И., Новицкий И. А. и др. // Сборник трудов 16-го Национального конгресса по болезням органов дыхания и II конгресса Евроазиатского респираторного общества. - СПб., 2006. - С. 87.
7. Терещенко С. Ю., Прохоренков В. И., Новицкий И. А. и др. // Рос. аллергол. журн. - 2007. - № 3, прил. 1. - С. 147.
8. Федосеева В. Н., Иванов В. Д., Федоскова Т. Г. // Вестн. РАМН. -2006. - № 5. - С. 39-42.
9. Хаитов Р. М. Физиология иммунной системы. - М., 2001.
10. Kurzius-Spenser M., Halonen M., Lohman I. C. et al. // Pediatr. Allergy Immunol. - 2005. - Vol. 16, N 1. - P. 19-26.
11. Messele T., Roos M. L., Hamann D. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2000. - Vol. 7, N 4. - P. 687-692.
12. StrachanD. P. // Thorax. - 2000. - Vol. 55. - Suppl. 1. - P. S2-S10.
13. Tereshchenko S., Prochorenkov V, Novitzkiy I. et al. // Wld Allergy Org. J. - 2007. - November. - P. S124.
Поступила 07.09.10
МИКРОБИОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2012
УДК 616.98:578.825.11]-078
А. Н. васильев1, Н. Е. Федорова2, Р. Р. Климова2, А. А. Адиева2
совершенствование диагностики герпес-вирусных инфекций
1ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития РФ Центр экспертизы и контроля готовых лекарственных средств, 2ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ, Москва
Представители семейства герпес-вирусов (Herpesviridae; ГВ) - вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус человека (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции. Данные ГВ вызывают тяжелые нарушения эмбрионального развития вплоть до гибели плода, болезни новорожденных, неврологические нарушения, глухоту и слепоту, являются причиной тяжелых поражений органов у больных, которым произведена трансплантация и отторжения пересаженных органов. Оба ГВ способны поражать ЦНС и приводить к энцефалитам со смертельным исходом. Особого внимания заслуживают бессимптомные формы, при которых вирус выделяется из организма и может передаваться как по горизонтали, в том числе половым путем, так и по вертикали - в процессе внутриутробного развития плода. Опасность представляет также отсутствие четких дифференцирующих клинических признаков, нередко наблюдаемое при манифестации инфекций, вызванных ГВ. Проведено сравнение четырех методов выявления ВПГ в соскобах уретры: иммуноцитохимического метода выявления антигена ВПГ в мазках; быстрого культурального метода (БКМ); иммуноферментного метода определения антигена ВПГ и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученные результаты показали, что с помощью БКМ обнаруживали ВПГ в инфицированных образцах на всех стадиях заболевания, причем на стадии обострения даже в большем количестве, чем ПЦР. Приведенные данные свидетельствуют об актуальности усовершенствования лабораторной диагностики ГВ-инфекции, которая необходима для надежного установления диагноза, определения формы и стадии заболевания, своевременного начала лечения и мониторинга терапии.
Ключевые слова: вирус простого герпеса, диагностика, культура клеток
A.N. Vasiliyev, N.Ye. Fedorova, R.R. Klimova, A.A. Adiyeva THE DEVELOPMENT OF DIAGNOSTICS OF HERPES VIRAL INFECTIONS The representatives of herpesviruses family (Herpesviridae - virus of herpes sim-plex and human cytomegalovirus) are largely widespread in human population. The.se herpesviruses bring on severe disorders of embryonic development up to fe-tal death, newborn diseases, neurologic disturbances, deafness, and blindness and in transplantation patients the severe internal organs affections and transplanted organs rejection. Both herpesviruses are able to affect the central nervous system and result in encephalitis with lethal outcome. The particular attention deserve the asymptomatic forms in case of which virus is excreteв and can be transmitted both by horizontal line (sexual way included) and by vertical line (in the process of in-trauterine development of fetus). The lacking of clear differentiating clinical symp-toms frequently observed under manifestations of herpesviruses infections brings another danger. The comparison is made of four methods of detection of herpes simplex in urethra scrapes: the immunocytochemical method of detection of herpes simplex antigen in smears; the rapid cultural method; the immune-enzyme method of detection of herpes simplex antigen; the polymerase chain reaction. The results demonstrated that the rapid cultural method detected herpes simplex in infected samples on all stages of disease and in even more quantity at the stage of exacerba-tion as compared with the polymerase chain reaction. The presented data testify the actuality of development of of laboratory diagnostics of herpesviruses infection to relevant diagnosis, determination of form and stage of disease, timely initiation of treatment and monitoring of therapy.
Key words: virus of herpes simplex, diagnostics, cell culture
