CC BY
102
УДК: 616.9:547.869.2
ФЕНОТИАЗИНОВЫЕ КРАСИТЕЛИ — НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ В БОРЬБЕ С ХИРУРГИЧЕКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
А.М.ХАДЖИБАЕВ, К.Р.КАСЫМОВА, Р.Р.САДЫКОВ
Phenothiazinium dyes — new expectancy against surgical infections
A.M.KHADJIBAEV, K.R.KASIMOVA, R.R.SADIKOV
Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи
Изучена фототоксичность 7 коммерчески доступных фенотиазиновых красителей на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, имеющие схожую химическую структуру. Метиленовый синий, являясь катионным фотосенсибилизатором, обладал гидрофобными свойствами. Диметилметиленовая синь характеризуется липофильностью. Азуры А,В,С по сравнении с метиленовой синью обладают большей антибактериальной активностью и менее активны по сравнению с диметилметиленовым синим, новым мети-леновым синим и толуидиновым синим. Диметилметиленовый синий, новый метиленовый синий при меньших концентрациях проявляли максимальный фотодинамический эффект в отношении грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий.
Ключевые слова: хирургическая инфекция, лечение, фенотиазиновые красители, метиленовый синий, диметилметиленовая синь, азур, фотодинамический эффект.
The purpose of investigations was to study phototoxity of 7 commercial available phenothiazinium dyes on gram positive and gram negative microorganisms. All 7 dyes have similar chemical structure. Methylene blue is cationic dye and has possessed hydrophilic property. 1,9 Dimethyl Methylene Blue has had a lipophilic property. Azure A,B,C have possessed with the highest antimicrobial activity wherewith Methylene Blue. Dimethyl Methylene Blue and New Methylene Blue have showed maximal antimicrobial activity with the less concentration against as grampositive and gram-negative microorganisms.
Key-words: surgical infection, treatment, phenothiazinium dyes, methylene blue, dimethyl methylene blue, azure, photodynamic effect.
В основе противоопухолевой и антимикробной фотодинамической терапии (АФДТ) лежит фотосен-сибилизированная реакция, которая находит все более широкое применение в медицинской практике [1,2,4,6,7,10,11,13,20]. В связи с ростом количества антибиотикорезистентных штаммов патогенных микробов АФДТ, которая «работает» в отношении патогенных грибов и вирусов и не вызывает устойчивости к фотосенсибилизированному воздействию, приобретает большую актуальность в лечении локализованной раневой инфекции [6,8,9,18,29, 23,25,28]. Метод АФДТ является безвредным для организма человека и одинаково эффективно может применяться многократно [3,8,15,21].
При проведении фотодинамической терапии используют фотосенсибилизаторы с длиной абсорбции в пределах от 400-700 нм. Эти длины волн в меньшей степени воздействуют на ткани организма, обладая при этом наибольшей проникающей способностью в мягкие ткани [9,17,22,26]. В качестве фотосенсибилизаторов для АФДТ набольший интерес представляют фнотиазиновые красители [4,7,10,14].
Цель. Исследование фототоксичности коммерчески доступных фенотиазиновых красителей на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.
Материал и методы
Исследования проведены с метиленовой синью (МС) и её аналогами, обладающими спектром поглощения в пределах от 620-660 нм [12,16,19], которые имеют схожую химическую структуру, что в будущем позволит определить направления исследований для химического синтеза новых фотосенсибилизаторов с повышенной антимикробной активностью.
В исследовании использованы штаммы Staphylococcus aureus 8325-4, а также Escherichia Coli K-12 (оба внебольничные штаммы). Бактерии культивировали при температуре +37°С, питательной основой жидких сред служил сердечно-мозговой экстракт 1,5% (Fisher Scientific, Waltham, MA). Фосфатный буфер (Fisher Scientific, Waltham, MA) использовался для мытья микробных клеток и последовательного разбавления. Все жидкие среды автокла-вировали при 120°C в течение 15 минут перед использованием.
Исследовали метиленовую синь (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури), азур А, азур Б, азур С (Sigma-Aldrich), новый метиленовый голубой N цинк хлористый, 1,9-диметил-метиле-новый синий, толуидиновый синий (Sigma-Aldrich). Каждый фотосенсибилизатор был приготовлен в виде водного раствора в первичной концентрации 1 мМ и оставался стабильным в течение 3-4 дней при температуре +40°C.
Светоизлучателем служила лампа с некогерентным белым излучением, доставленным для объекта исследования через волоконно-оптический световод, оснащенный фильтром (LumaCare, Ньюпорт Бич, Калифорния). Для серийных разведений использовали одноразовые пластмассовые микроцентрифужные кюветы вместимостью 1,5 мл (FisherScientific, Waltham, MA). Использовали взвесь бактерий с плотностью клеток 108 КОЕ/мл. Абсорбцию фотосенсибилизаторов измеряли с помощью спектрофотометра. Клеточный осадок выделяли центрифугированием (13690 об/мин в течение 5 мин) и ресуспендировали в стерильном фосфатном буферном растворе до желаемой плотности (обычно 108 КОЕ/мл). Для построения кри-
Таблица. Химическая структура фенотиазиновых красителей
Липофильность Краситель Химическая формула Пик абсорбции в диапазоне 500-700 нм Спектр флюоресценции
Метиленовый синий
Азур А (АА)
Азур В (АВ)
Азур С (АС)
Новый метиленовый синий N цинк хлористый
1,9-диметил мети-леновый синий
Толуидиновый синий
-0,10
+0,70
-0,09
-0,40
+1,20
-0,21
-0,21
667
622
647
620
628
649
617
684
652
671
644
653
671
666
вой концентрации фотосенсибилизаторов и дозы облучения проводилось серийное разведение. Каждую аликвоту микробной суспензии индивидуально подвергали пять раз десятикратному разведению в стерильном фосфатном буфере. Результаты считали после 24-часовой инкубации.
Результаты
Химическая структура исследуемых фенотиазиновых красителей приведена в таблице. Они обладают схожей химической структурой, спектр поглощения — 620-660 нм. Приведенные в таблице данные о гидрофильности и гидрофобности соединений показывают, что толуиди-новый синий, метиленовый синий и азур Б могут быть представлены как гидрофильные, а диметилметилено-вый синий и новый метиленовый голубой N цинк хлористый — как липофильные соединения [7,24].
Изучение световой токсичности фотодинамического излучения выявило отсутствие антимикробного эффекта как на грамположительные, так и на грамот-рицательные микроорганизмы. Время инкубации изучалось при различных временных интервалах. Минимальное время экспозиции, при котором после облучения достигался максимальный эффект, составило 15 минут. При экспозиции больше 20 минут были получены результаты, идентичные таковым при 15-минутной
экспозиции. В последующем для всех 7 фенотиазино-вых красителей была выбрана 15-минутная экспозиция образцов.
Темновая токсичность фенотиазиновых красителей изучалась в концентрациях 1, 3, 5, 7, 10, и 50 иМ, а также 1 мМ. Наиболее достоверные результаты исследований получены при концентрации ФК 1 иМ до 10 иМ. Эти концентрации оказались не только малотоксичными, но и высокоэффективными для ФДТ.
Грамположительные бактерии поддаются ФДТ деструкции легче, чем грамотрицательные. Метиленовый синий проявил антимикробную активность в концентрации выше 10 иМ и при дозе облучения 10 .1/см2. Грамотрицательные виды бактерий гораздо тяжелее подвергались фотодинамической инактивации. При концентрации 1 мМ эффективность метиленовой сини снижалась. Это связано с тем, что высокая концентрация МС, связываясь с бактериями, создает оптический барьер, что резко снижает глубину проникновения светового излучения, и эффективность ФДТ падает.
Исследования показали, что 1,9-диметилметиле-новый синий и новый метиленовый синий обладают бактерицидным действием уже в малых концентрациях (рис. 9-12). При изучении темновой токсичности фотосенсибилизаторы были менее эффективны против бактерий (ЕС и БА). Но при световом воздействии
Рис. 1. Действие азура А на E. соН in vitro.
Рис. 2. Действие азура А на Staph. аигвиэ in vitro.
жт
1.00Е+00
1.00Е-01
êl,00E-02 о
|l,00E-03
sl.OOE-04 *
2Ü.00E-05 ùù
1.00E-06 l,00E-07
13 5 7 Концентрация |uM)
—*— темно в m токсичность
световая токсичность (10J/cm2) Рис. 3. Действие азура Б на E. соН in vitro.
—
>
10
L00E+00 i.OOE-Oi ёк00Е-02
a
iU00E-03 li,00E-04 ll,00E-05
ей
1.00E-06
1.00E-07
1 3 5 7 10 Концентрация (uM]
■—A—'темновая токсичность
световая токсичность (10J/cm2) Рис. 4. Действие азура Б на Staph. аигвив in vitro.
Рис. 5. Действие азура С на E. соН in vitro.
активность этих фотосенсибилизаторов, в отличие от метиленовой сини (рис. 7-8), увеличивалась в 4 раза, за исключением диметилметиленовой сини и нового метиленового синего, чья активность была намного выше остальных красителей (рис. 1-6, 9-14).
■■■ световая токсичность (10J/cm2) Рис. 6. Действие азура С на Staph. аигвив in vitro.
Исследования с различными бактериями показали отсутствие световой токсичности в дозе, которая была использована в работе. Изменения в химической структуре фенотиазиновых красителей существенно влияет на активность и фотоактивность фе-
■ темновая токсичность световая токсичность (10J/cm2} Рис. 7. Действие метиленовой сини на E. coli.
- световая токсичность (10J/cm2} Рис. 8. Действие метиленовой сини на S^ureus.
■ темновая токсичность световая токсичность {10J/cm2) Рис. 9. Действие новой метиленовой сини на E. coli.
темновая токсичность световая токсичность (10J/cm2) Рис. 10. Действие новой метиленовой сини на S^ureus.
3 5 7 10 Концентрация (uM)
•темновая токсичность световая токсичность (1GJ/cm2) Рис. 11. Действие 1,9 диметил метиленовой сини на E. coli.
нотиазиновых красителей против ряда патогенных бактерий. Так, присутствие метильной группы в положении 1,9 (табл.) в хромофоре диметилметиленовой
Рис. 12. Действие 1,9 диметил метиленовой сини на S^ureus.
сини значительно увеличивает фотоактивность этого соединения по сравнению с метиленовой синью и азурами А,Б и С (рис. 1-6, 9-12).
•темновая токсичность световая токсичность (10J/cm2) Рис. 13. Действие толуидинового синего на E. coli.
Обсуждение
Нами была изучена антибактериальная и фотосен-сибилизированная активность 7 фенотиазиновых красителей со сходной химической структурой. Можно предположить более высокую активность диметилме-тиленовой сини по сравнению с метиленовой синью за счет липофильности этого соединения. В отличие от МС, обладающей гидрофобными свойствами, ДММС обладает липофильностью, что может свидетельствовать о различии их способности связываться с клетками живого организма. Новый метиленовый синий, толуидиновый синий и азур имеет способность формировать нейтральный хинонимин. Изменение pH в бактериальной среде может провоцировать поглощение нейтральных красителей бактериями с последующей фотоактивацией катионов-красителей (при меньших концентрациях). Азур обладает большей антибактериальной активностью, по сравнению с остальными фенотиазинами (ДММС, новый метиленовый синий, толуидиновый синий). Наиболее эффективными ФК оказались ДММС и новый метиленовый синий. Исследования выявили отсутствие темновой токсичности ФК в изученных концентрациях. Наши данные свидетельствуют о возможности применения ФК для антимикробной фотодинамической терапии при лечении локальной инфекции в качестве альтернативы анти-биотикотерапии.
Выводы:
1. Фенотиазиновые красители могут использоваться в качестве фотосенсибилизаторов, так как они обладают низкой темновой токсичностью и проявляют высокий фотодинамический эффект в малых концентрациях.
2. Азуры А, В и С по сравнению с метиленовым синим имеют большую антибактериальную активность.
3. Диметилметиленовый синий, новый метиленовый синий в меньших концентрациях проявляют максимальный фотодинамический эффект в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Литература
1. Dougherty T.J., Gomer C.J.
Photodynamic therapy. J
темновая токсичность световая токсичность (10J/cm2)
Рис. 14. Действие толуидинового синего на S.aureus.
Natl Cancer Inst 1998;90:889-905.
2. Marmur E.S., Schmults C.D. A review of laser and photodynamic therapy for the treatment of nonmelano-ma skin cancer. Dermatol Surg 2004;30:264-271.
3. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours. J Photochem Photobiol 1997;39:1-18.
4. Soncin M., Fabris C., Busetti A., Dei D. Antibiotic resistance in staphylococci. Int J Antimicrob Agents 2001; 16: 3-10.
5. Hogan D., Kolter R. Why are bacteria refractory to antimicrobials? Curr Opin Microbiol 2002; 5: 472-477.
6. Phoenix D.A., Chatffield L.K. Antimicrobial therapy: New solutions to an old problem. J Europ Coll Qual L 2003; 1: 44-61.
7. Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J Antimicrob Chemother 1998; 42: 13-28.
8. Agostinis P., Vantieghem A., Merievede W., de Witte P.A.M. Hypercin in cancer treatment: more light on the way. Int J Biochem Cell Biol 2002; 34: 221-241.
9. Hopper C. Photodynamic therapy: a clinical reality in the treatment of cancer. Lancet Oncol 2000; 1: 212-219.
10. Schmidt-Erfurth U., Hasan T. Mechanisms of action of photodynamic therapy with verteporffirin for the treatment of age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol 2002; 45: 195-214.
11. Kurwa H.A., Barlow R.J. The role of photodynamic therapy in dermatology. Clin Exp Dermatol 1999; 24: 143-148.
12. Dougherty T.J., Gomer C.J. etc. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 889-905.
13. DeRosa M.C., Crutchley R.J. Photosensitised singlet oxygen and its applications. Coord Chem Rev 2002; 351-371.
14. Foote C.S. Definition of type I and type II photosensi-tisedoxidation. Photochem Photobiol 1991; 54: 659.
15. Foote C.S. Future directions and applications in photo-dynamic therapy. SPIE Inst Ser 1S6 1990; 115-126.
16. Girotti A.W. Photosensitised oxidation of membrane lipids: reaction pathways, cytotoxic effects and cyto-protective mechanisms. J Photochem Photobiol Biol 2001; 63: 103-113.
17. Davies M.J., Truscott R.J.W. Photo-oxidation of proteins and its role in caractogenesis. J Photochem Pho-tobiol Biol 2001; 63: 114-125.
18. Kawanishi S., Hiraku Y. Oikawa S. Mechanism of gua-nine-specific DNA damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and ageing. Mutat Res 2001; 488: 65-76.
19. Merchat M., Bertolini G., Giacomini P. et al. Meso-substituted cationic porphyrins as effcient photosensi-tizers of Gram-positive and Gram-negative bacteria. J Photochem Photobiol Biol 1996; 32: 153-157.
20. Minnock A., Vernon D.I., Schoffield J. et al. Photoinac-tivation of bacteria. Use of a cationic water-soluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both Gramnegative and Gram-positive bacteria. J Photochem Photobiol Biol 1996; 32: 159-164.
21. Szocs K., Gabor F., Csik G., Fidy J. N-aminolaevulinic acid-induced porphyrin synthesis and photodynamic inactivation of Escherichia coli. J Photobiochem Photobiol Biol 1999; 50: 8-17.
22. Van der Meulen F.W., Ibrahim K. et al. Photodynamic destruction of Haemophilus parain Juenzae by endog-enously produced porphyrins. J Photochem Photobiol Biol 1997; 40: 204-208.
23. Lasocki K., Szpakowska M., Grzybowski J., Graczyk A. Examination of antibacterial activity of the photoacti-vated arginine haematoporphryn derivative. Pharmacol Res 1999; 39: 181-184.
24. Wainwright M. The emerging chemistry of blood product disinfection. Chem Soc Rev 2002; 31: 128-136.
25. Wilson M., Burns T., Pratten J. Killing of Streptococcus sanguis in biofilms using a light-activated antimicrobial agent. J Antimicrob Chemother 1996; 37: 377-381.
26. Phoenix D.A. et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology 2003; 39: 17-22.
27. Wainwright M., Phoenix D.A., Gaskell M., Marshall B. Photobactericidal activity of methylene blue deriva-
tives against vancomycin-resistant Enterococcus spp. J Antimicrob Chemother 1999; 44: 823-825.
28. Komeric N., Wilson M., Poole S. The effect of photody-namic action on two virulence factors of Gram-negative bacteria. Photochem Photobiol 2000; 72: 676-680.
29. Szpakowska M., Reiss J., Graczyk A. et al. Susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to a photodynamic e! ect of the arginine hematoporphyrin derivative. Int J Antimicrob Agents 1997; 8: 23- 27.
ФЕНОТИАЗИНЛИ БУЁКЛАР — ХИРУРГИК ИНФЕКЦИЯ БИЛАН КУРАШИШДАГИ ЯНГИ ИМКОНИЯТЛАР
А.М.Хаджибаев, К.Р.Касымова, Р.Р.Садыков Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази
Нархи юкори булмаган ва бир-бирига ухшаш кимёвий тузилишга эга 7 хил фенотиазинли буёкларнинг граммусбат ва грамманфий микроорганизмларга нисбатан фототоксик таъсири урганилган. Катионли фотосенсибилизатор булмиш метиленли кук гидрофоб хусусиятга эга булиб, диметилметиленли кук эса липофилли моддадир. А, В ва С азурлар метиленли кукка нисбатан кучлирок антибактериал фаолликка эга, аммо янги метиленли кукка, диметилметиленли кукка ва толуидинли кукка нисбатан эса сустрок фаоллилиги аникланди. Граммусбат ва грамманфий бактериаларга нисбатан диметилметиленли кук ва янги метиленли кук камрок концентрацияда максимал фотодинамик таъсирга эга эканлиги намойиш этилган.
Контакт: Садыков Р.Р., отделение баклаборатории РНЦЭМП. 100115, Ташкент, ул. Фархадская, 2. Тел.: +99890-9594365 E-mail: srrdoktor@yahoo.com
