CC BY
42
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Физико-математические пауки
УДК 577.1—539.25—53.087/.088
ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКИЕ И ФРАКТАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ В АСМ-ИССЛЕДОВАНИЯХ МИКРОГЕОМЕТРИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
O.A. Коновалова, М.Э. Сибгатуллип, А.Н. Моптач, Н.В. Калачева, Д.З. Галимуллип, М.Х. Салахов
Аннотация
Для количественной оценки структурных и морфологических изменений поверхности клеток, вступивших на путь апоптоза, рассчитаны феноменологические (Sy, Sa, Sq, энтропия) и фрактальные характеристики (характеристическая фрактальная размерность, размерность Ричардсона и показатель Херста). Их анализ показал, что с помощью феноменологических характеристик можно установить четкую тенденцию в изменении микрогеометрии клеточной мембраны, тогда как фрактальные характеристики позволяют получить дополнительную информацию об упорядоченности структуры поверхности мембран клеток. Установлено, что с помощью феноменологических и особенно фрактальных параметров можно выявить нарушения структуры клеточных мембран, которые визуально не определяются.
Ключевые слова: феноменологические и фрактальные характеристики, структура, клеточная поверхность.
Введение
Существующие на сегодняшний день методы описания морфологических особенностей наноразмерных структур имеют качественный характер и нередко являются визуальными. В связи с масштабным переходом науки и технологии к манипуляции объектами наиоразмера и усложнением методов анализа результатов проблема количественного определения степени упорядоченности систем таких объектов является в последние годы очень актуальной.
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ). в особенности атомно-силовая микроскопия (АСМ). позволяет получать в иаиометровом диапазоне трехмерные изображения поверхности образцов с разным типом проводимости, действуя при этом на воздухе, в жидкости и в вакууме. Последующая математическая обработка данных дает возможность глубокого анализа различных характеристик поверхности н открывает перспективу для широкого использования АСМ при изучении локальной структуры поверхности разнообразных объектов в электронике, кристаллографии. химии, биологии, медицине и т. п.
В настоящей работе на примере макрофагов, вступивших на путь апоптоза. проведена оценка эффективности применения некоторых феноменологических и фрактальных характеристик к АСМ-изображениям биологических объектов с целью получения дополнительной информации о структуре их поверхностей. Особый интерес представляют случаи, когда изменения мнкрогеометрнн клеточных мембран визуально не фиксируются. Тогда определение количественных параметров состояния клеточной поверхности, а именно феноменологических и фрактальных характеристик, поможет прогнозировать путь развития клетки.
1. Объект и методы исследования
В качество объекта исследования выбраны поритоноальныо макрофаги (контрольные образцы) и макрофаги, обработанные мономером (400 мкг/мл) и диме-ром (25 мкг/мл) РНКазы Bacillus intermedins (РНКаза В. intermedins) (опытные образцы). Диморную форму РНКазы получали описанным в работе [1] способом. Образцы для сканирования готовили по методике, приведенной в [2].
Визуализацию поверхностных слоев макрофага проводили на воздухе при комнатной температуре в полуконтактном режиме на ACM Solver Р47Н (ЗАО «НТ МДТ»), сканер 50 мкм. Были использованы стандартные кремниевые кантиловоры NSG11 (ЗАО «НТ МДТ»). радиус кривизны острия которых был менее 10 нм.
Для описания и детализации структуры поверхности применялись феноменологические характеристики [3]. которые определяют наиболее общие свойства, отражающие состояние рельефа всех видов поверхности, в том числе и биологических объектов. Для описания микрогеометрии поверхности снимали серию изображений с одинаковыми размерами (5x5 мкм) с различных участков поверхности и определяли параметры шероховатости по следующим формулам.
а) Среднеарифметическая шероховатость поверхности, которая определяет центр симметрии:
( м N
= ( "дРт' ) 'У ' \z(bj) ~ Ornean | 7 (1)
где z(i,j) - значение высоты рельефа в точке с координатами (i,j), измеренное с помощью ACM, N - количество точек в строке сканирования, zmean =
N
= 1/N2 J2 z(i,j) - среднее значение высоты рельефа на изображении. i,j= 1
б) Среднеквадратичная шероховатость поверхности, которая определяет дисперсию случайной величины и характеризует рассеяние отдельных ее значений от центра распределения:
(2)
в) Размах высот, который определяет разницу между наибольшим (гтах) и наименьшим (,гтт) значениями высот рельефа на изображении:
¿тах ¿тт •
Для количественной оценки степени упорядоченности наноразморных структур применялись 4 фрактальные характеристики: характеристическая фрактальная размерность, размерность Ричардсона, показатель Херста, относительная дисперсия [4]. Был проведен расчет для каждого типа клеток: контроль, макрофаги—мономер РНКазы В. пйегптЫш. макрофаги — димор РНКазы В. пйегптЫш. В качестве примера на поверхности контрольной клетки (рис. 1, о) показано характерное место, выбранное для математической обработки. Для подобных областей построчно рассчитывались значения фрактальных характеристик.
2. Эксперимент
Ранее нами было впервые показано, что мономер и димор РНКазы В. intermedins вызывают апоптоз перитонеальных макрофагов in vitro, а метод атомно-силовой микроскопии позволяет исследовать различные стадии апоптоза [о].
Рис. 1. АСМ-изображения макрофагов, размер кадра 30 х 30 мкм: а) контроль с указанием выбранной для обработки области: б) макрофаги I мономер РНКазы В. intermedins (400 мкг/мл); в) макрофаги I димер РНКазы В. intermedins (25 мкг/мл)
На рис. 1 представлены АСМ-изображения макрофагов, которые отражают морфологические изменения поверхности клеток с учетом расположения внутриклеточных органелл и их перераспределения в процессе апоптоза. По сравнению с контрольными образцами у макрофагов, обработанных мономером и димером РНКазы В. intermedins, можно отметить характерные для апоптоза морфологические изменения клетки (рис.1, б , в): высвобождение содержимого клетки (блеб-бинг), которое приводит к уменьшению объема цитоплазмы, инвагинации ядерной мембраны, фрагментации ядра. Однако на поверхности интактных клеток и клеток, обработанных препаратами РНКаз, имеются участки без четких различий в структуре и морфологии, в том числе участки в области ядра. Для количественной оценки структурных и морфологических изменений поверхности этих участков были рассчитаны феноменологические и фрактальные характеристики.
При анализе феноменологических характеристик (Sy, Sa, Sq, энтропия) наблюдается четкая тенденция последовательного увеличения значений всех параметров у клеток, обработанных мономером и димером, по сравнению с контрольными образцами макрофагов (табл. 1). Однако параметры шероховатости, определяемые по формулам (1), (2), не содержат информации о равномерности и упорядоченности рельефа поверхности.
Микрогеометрия поверхности клеток является динамической системой. Исследование динамической системы предполагает изучение ее свойств, которые определяются некоторыми инвариантами (например, энтропией и т. д.). Поэтому в этом случае использование классических геометрических параметров шероховатости является недостаточным. Более того, геометрические параметры не отображают такое важное свойство шероховатости динамической системы, как эволюция.
Табл. 1
Феноменологические характеристики поверхности макрофагов до и после взаимодействия с мономером и димером РНКазы В. глЛегтеЛгих
Параметр Контроль Макрофаги — мономер РНКазы В. ийегтеЛгих Макрофаги — димер РНКазы В. ийегтеЛгих
Яу. им 142.1 ±33.9 172.3 ±38.5 218.5 ± 65.1
За; ПМ 19.5 ±3.9 23.0 ±6.5 32.7 ± 19.6
пм 23.8 ±4.7 28.4 ± 7.1 39.3 ±9.4
Энтропия 10.1 ±0.3 10.3 ±0.3 10.5 ± 0.4
Таким образом, необходимы новые подходы в оценке микрогеометрии поверхности. и одним из таких подходов может быть использование теории фракталов. Применение теории фракталов позволит внести новые показатели для оценки шероховатости. прогнозировать изменения микрогеометрии клеточной поверхности в процессе их формирования.
Фрактальные измерения в отличие от феноменологических имеют своей целыо количественно оценить поверхность с точки зрения упорядоченности, определить меру хаотичности структуры. Изменение показателя энтропии в табл. 1 отчасти дает возможность судить также о степени хаотичности в структуре мембраны макрофагов, однако только в самом общем виде.
Был проведен сравнительный анализ значений вышеупомянутых 4 фрактальных характеристик, рассчитанных по данным АСМ-изображений поверхностей макрофагов для 3 групп клеток: контрольная группа, макрофаги — мономер РНКазы В. Шегте&из и макрофаги — димер РНКазы В. Шегте&ш (рис. 2).
Первая из характеристик характеристическая фрактальная размерность (СБО). дает оценку степени, с которой траектория в произвольном пространстве отличается от прямолинейного пути. СБИ больше или равна единице; равенство единице соответствует прямолинейному пути. В данном случае роль одномерного сигнала выполняет строка из матрицы АСМ-изображения. Приведенные на рис. 2 данные позволяют сделать вывод, что группа контрольных клеток имеет наиболее упорядоченную поверхность, так как соответствующее ей значение СБИ ближе всех к 1. далее идет группа клеток макрофаги — мономер РНКазы В. Шегте&из и самая неровная поверхность у группы клеток макрофаги — димер РНКазы В. тЬегпшНиз (рис. 2. А).
Вторая характеристика размерность Ричардсона (Б_К), которая подобно СБИ дает понятие о степени отклонения сигнала от прямой. Ее значения также показывают большую упорядоченность у поверхностей группы контрольных клеток и хаотичность у группы клеток макрофаги — димер РНКазы В. Шегте&из. Нужно заметить, что размерность Ричардсона оказывается более чувствительной к изменениям в структуре поверхности, чем СБИ (рис. 2. Б).
Показатель Херста (Н) указывает на степень перспстентностп или аитиперси-стеитиости и принимает значения от 0 до 1. Чем он ближе к 1. тем более иерси-стентное поведение у сигнала. В данном случае показатель Херста ближе всего к 1 для контрольных клеток. Следовательно, эта группа поверхностей имеет пай-большую упорядоченность и содержит меньше всего высокочастотных шумовых компонент. Чуть более хаотичными являются поверхности группы клеток макрофаги — мономер РНКазы В. Шегте&из, а еще более группы макрофаги — димер РНКазы В. гЫегпшНиз (рис. 2. В).
Последняя характеристика относительная дисперсия (Б_1Ш) говорит о величине разброса значений сигнала в зависимости от длины набора данных, и наименьший разброс наблюдается у контрольной группы клеток. Однако надо
Рис. 2. Фрактальные характеристики: А) характеристическая фрактальная размерность СГБ; Б) размерность Ричардсона Б_11; В) показатель Херста Н; Г) относительная дисперсия Обозначения: • - группа контрольных клеток, ▲ - макрофаги + мономер РНКазы, ♦ - макрофаги + димер РНКазы
заметить, что ее значения позволяют лишь отделить контрольную группу клеток от остальных (рис. 2, Г).
Таким образом, все фрактальные характеристики указывают на то, что самая упорядоченная поверхность наблюдается у группы контрольных клеток, даиее следует группа клеток макрофаги+мономер РНКазы В. тЬегтейтя и самой хаотичной оказывается группа клеток макрофаги+димер РНКазы В. тЬегтейтя.
Заключение
Для количественной оценки структурных и морфологических изменении поверхности макрофагов рассчитаны феноменологические (£у, Ба, энтропия) и фрактальные характеристики (характеристическая фрактальная размерность, размерность Ричардсона и показатель Херста). Установлено, что с помощью феноменологических характеристик можно показать четкую тенденции) в изменении микрогеометрии клеточной мембраны, тогда как фрактальные характеристики позволяют получить дополнительную информации) об упорядоченности структуры поверхности мембран клеток. Анализ значении этих характеристик показан следующие результаты: наиболее упорядоченная поверхность принадлежит контрольным клеткам. Поверхности макрофагов, взаимодействующих с мономером РНКазы В. тЬегтейтя, имеют менее упорядоченную структуру, в них присутствует больше высокочастотных составляющих. Структура поверхностей макрофагов, обработанных димером РНКазы В. тЬегтейтя, является самой хаотичной. Четвертая характеристика (относительная дисперсия) не выявила отличий в структурах мембран клеток, обработанных мономером и димером РНКазы.
Полученные результаты подтвердили структурные и морфологические изменения в макрофагах после их инкубации с мономером и димером РНКазы В. гпЬег-тейтя, характерные для апоптоза. Эти нарушения так же, как и визуальные,
выражены сильное у клеток после их взаимодействия с димерной формой РНКазы В. intermedins.
Рассмотренные феноменологические и фрактальные характеристики представляют большой интерес для изучения структуры различных поверхностей, в том числе биологических мембран, поскольку с их помощью можно выявить нарушения структуры клеточных мембран, которые визуально не фиксируются.
Summary
О.A. Konovalova, М.Е. Sibgatullin, A.N. Muntach, N.V. Kalaeheva, D.Z. Galimullin, M.Kh. Salakhuv. Plienomenological and Fractal Characteristics of Microgeomet.ry of Cellular Membranes in AFM-Images.
Plienomenol Sq, entropy) and fractal characteristics (characteristic
fractal dimension, the Richardson dimension and the Hurst exponent) were calculated to quantitatively estimate the structural and morphological changes of the surface of the cells undergoing apopt.osis. Their analysis showed that it is possible to establish an accurate tendency in the change of the microgeomet.ry of a cellular membrane by means of plienomenological characteristics. Whereas fractal characteristics allow one to obtain the additional information about the orderliness of the structure of membrane surface. It was established that plienomenological and especially fractal parameters make it possible to reveal structural infringements of cellular membranes, which cannot be visually defined.
Key words: plienomenological and fractal characteristics, structure, cell surface.
Литература
1. Калачеоа H.B., Курииеико Б.М. Влияние рибоиуклеаз и их модифицированных производных па функциональную активность перитопеальпых макрофагов крысы // Виомед. химия. 2005. Т. 51, № 3. С. 303 310.
2. Калачеоа Н.В., Коновалова О.А., Налимов Д.С., Салахов М.Х., Ильинская О.Н., Курииеико Б.М. Ипгибировапие фагоцитарной функции макрофагов in vitro димерной формой рибопуклеазы Baeilus intermedins // Цитология. 2008. Т. 50, Л' 6. С. 487 491.
3. Арутюнов П.А., Толстихииа А.Л. Сканирующая зопдовая микроскопия (туннельная и силовая) в задачах метрологии и папоэлектропики // Микроэлектроника. 1997. Т. 26, Л» 6. С. 426 439.
4. Rapp Р.Е., Watanabe Т.A.A., Faure P., Cellucci C.J. Nonlinear signal classification // Int.. J. Bifurcat. Chaos. 2002. V. 12, No 6. P. 1273 1293.
5. Коновалова О.А., Ефимова, И.P., Калачеоа H.B. Исследование поверхности перитопеальпых макрофагов после их взаимодействия с мономером и димером РНКазы В. intermedins методом АСМ // Тез. докл. третьей междупар. копф. «Современные достижения биопапоскопии». М., 2009. С. 34.
Поступила в редакцию 31.12.09
Коновалова Ольга Анатольевна кандидат физико-математических паук, доцепт кафедры оптики и папофотопики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-шаП: olga.konovalovaQbk.ru
Сибгатуллин Мансур Эмерович кандидат физико-математических паук, ассистент кафедры оптики и папофотопики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-шаП: агЬтапавгатЫег.ги
Монтач Анна Николаевна студент кафедры оптики и папофотопики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-шаП: monal3Qmail.ru
Калачева Наталия Васильевна кандидат химических паук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории инженерной эпзимологии биологического факультета Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-шаП: nvkalachevaQyandex.ru
Галимуллин Дамир Зиннурович кандидат физико-математических паук, ассистент кафедры оптики и папофотопики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-шаП: даИтиШп_ (LzQmail.ru
Салахов Мякзюм Хамимуллович доктор физико-математических паук, профессор. заведующий кафедрой оптики и папофотопики Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-шаП: Муакгуит.8а1акктQksu.ru
