CC BY
42
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.852.11+579.873.21]:579.22
Огарков О.Б.1'2'3, Бадлеева М.В.4, Белькова Н.Л.1'5, Адельшин Р.В.6,Цыренова Т.А.7, Хромова П.А.1, Синьков В.В.1'8, Костюнин К.Ю.8, Дашацыренова С.Б.9, Кощеев М.Е.7, Зарбуев А.Н.9,
Жданова С.Н.1
ФЕНОМЕН ОБРАзОВАНИЯ БИОПЛЕНОК ШТАММАМИ BREVIBACILLUS SPP. И BACILLUS SPP. В ПРИСУТСТВИИ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
'ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», 664003, Иркутск; 2ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет», 664003, Иркутск; 3ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования», 664079, Иркутск; 4ФГБОУ ВО «Бурятский государственный университет», 670000, Улан-Удэ; 5ФГБУН «Лимнологический институт СО РАН», 664033; 6ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт», 664047, Иркутск; 7ОГБУЗ «Иркутская областная клиническая туберкулёзная больница», 664039, Иркутск; 8ОГАУЗ «Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр», 664047, Иркутск; 9ГБУЗ «Республиканский клинический противотуберкулёзный диспансер». 670004, Улан-Удэ, Россия
Проведено исследование образования биоплёнок M. tuberculosis на среде Школьниковой (синтетическая среда, аналог Sauton's medium). Изучено 150 клинических и 20 лабораторных штаммов M. tuberculosis. Ни один из 150 штаммов, выделенных от людей, не продуцировал биоплёнки (pellicle), но все давали обильный планктонный рост. 20 референтных штаммов M. tuberculosis продуцировали как биопленки (pellicle), так и планктонный рост. Обнаружен феномен образования биопленок микст-культурами при посеве мокроты от больных туберкулезом, обработанной NALC-NaOH. Получено 63 микст-биоплёнки. В 30,2% (19/63) случаев биоплёнки содержали ДНК возбудителя туберкулеза. Методом ПЦР-РВ отобрано 6 образцов, имеющих наибольшую концентрацию микобактериальной ДНК. Проведено молекулярное клонирование фрагмента гена 16S рРНК одной из биоплёнок и его секвенирование. Нуклеотидная последовательность имела 99% гомологию с видом Bacillus thermoamylovorans. Из полученных микст-биоплёнок выделено три штамма спорообра-зующих бацилл. Штаммы идентифицированы секвенированием по Сэнгеру гена 16S рРНК, один как Bacillus licheniformis, и два остальных как Brevibacillus spp. Проведено исследование устойчивости выделенных штаммов споровых бацилл к 12 противотуберкулёзным препаратам 1-го и 2-го рядов. Все три штамма были устойчивы к максимальным концентрациям изониазида, стрептомицина, этионамида и этамбутола. Штаммы Brevibacillus spp. были дополнительно устойчивы к ПАСК и канамицину. В модельном эксперименте показана возможность совместного роста клинических штаммов M. tuberculosis и B. licheniformis при длительной совместной инкубации на среде Школьниковой. В первые несколько суток роста B. licheniformis продуцировал биоплёнку, которая оставалась стабильной весь период наблюдения — 45 суток. Постулирована гипотеза, предполагающая возможность кратковременной персистенции некоторых «са-профитических» видов бацилл в казеозном содержимом очагов некроза на поздних стадиях туберкулёза лёгких.
Ключевые слова: M. tuberculosis; Brevibacillus spp.; Bacillus spp.; формирование биоплёнок.
Для цитирования: Огарков О.Б., Бадлеева М.В., Белькова Н.Л., Адельшин Р.В., Цыренова Т.А., Хромова П.А., Синьков В.В., Костюнин К.Ю., Дашацыренова С.Б., Кощеев М.Е., Зарбуев А.Н., Жданова С.Н. Феномен образования биоплёнок штаммами Brevibacillus spp. и Bacillus spp. в присутствии клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017;35(3):98-103. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-98-103.
По оценкам ВОЗ около трети человеческой популяции инфицировано Mycobacterium tuberculosis (МБТ), при этом Российская Федерация входит в число 22 стран с наиболее неблагоприятной ситуацией по туберкулёзу
Для корреспонденции: Огарков Олег Борисович e-mail: [email protected]
[1]. Патогенез туберкулёза, особенно на поздних стадиях, по-прежнему остается малоизученным. Известно, что возбудитель туберкулёза, наряду с другими патогенными микроорганизмами, способен продуцировать биоплёнки (pellicle) на поверхности синтетических жидких питательных сред [2]. Однако до настоящего времени остается не ясным, какова роль этого процесса в патогенезе туберкулёза. Предполагается, что процесс образования биоплёнок в лёгких на поздних стадиях может быть важным фактором патогенеза этой инфекции [3]. Относительно немного известно об условиях продукции и химическом составе биопленокM.tuberculosis. По всей вероятности биопленки, продуцируемые МБТ, во многом повторяют состав полимеров клеточной стенки. Известно, что в состав биоплёнки, продуцируемой M. tuberculosis, входят полимеры PDIM (phthiocerol/phthio-diolone dimycocerosate) и PG (phenolic glycolipids) [4]. Мутанты, не способные синтезировать кето-миколовые кислоты (keto-mycolic acids), не могут также продуцировать биопленки [2]. Аналогично, мутанты, дефектные по полиглутамат-синтетазе Rv0574c, тоже не продуцируют биопленки [5]. Следует отметить, что а-полиглутаматы (a-polyglutamate), составляют до 8% состава клеточной стенки патогенных микобактерий [6]. Важно, что а - и у-полиглутаматы являются биополимерами, широко встречающимися в капсулах у бактерий, бацилл и ар-хеобактерий [6]. В данном исследовании нами показано, что в некоторых случаях на поздних стадиях хронического туберкулёза в образцах, полученных от больных, содержатся штаммы различных видов Bacillus spp. и Brevibacillus spp., считающихся «сапрофитическими». Мы предполагаем, что у-полиглутаматный матрикс биопленки, продуцируемого спорообразующими бациллами, может использоваться МБТ в качестве защитного субстрата вместо или вместе с собственной биоплёнки при росте in vitro, и возможно, in vivo.
Материал и методы
Соблюдение этических норм. Настоящее исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ.
Штаммы микобактерий. Штаммы были получены с твердой питательной среды Левенштейна—Йенсена. Среду Школьниковой готовили согласно действующим рекомендациям [7], для получения биоплёнок штаммы МБТ выращивали в 5 мл среды в стеклянных пробирках с добавлением до 10% инактивированной при 56°C
сыворотки крови человека [8] или без добавления сыворотки.
Оценку устойчивости выявленных штаммов к 12-ти противотуберкулёзным препаратам (ПТП) 1-го и 2-го ряда проводили в жидкой среде Middlebrook 7Н9 с помощью тест-системы Sensititre Myco TB (Thermo Scientific, США).
Модельный эксперимент по исследованию совместного роста B. licheniformis с клиническими штаммами МБТ проводили в стеклянных пробирках с 5 мл среды Школьниковой без сыворотки. Посевная доза для каждого из микроорганизмов составляла 100 мкл культуры, приготовленной по стандарту мутности 0,5 ед. и разведённому в 100 раз. В первые 10 дней рост происходил в аэробных условиях (пробирки закрывались ватно-марлевыми пробками), в последующие дни эксперимента во избежание высыхания среды пробки заменялись пластиковыми.
Выделение геномной ДНК из биоплёнок. Экстракцию ДНК штаммов МБТ проводили из образцов, убитых прогреванием при 100°C в течение 30 мин. Для удаления ингибиторов ПЦР проводили предварительную обработку биоплёнок протеиназой K (AppliChem) и хлороформом. Фермент добавляли в количестве 2 ед. на образец в равном образцу объеме 0,5-кратного лизирующего буфера [9] из набора ДНК-сорб-B («Интерлабсервис», Россия), интенсивно встряхивали и прогревали при 55°С 30 мин. В дальнейшем к образцу добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали на макси-
мальных оборотах. Полученный супернатант отбирали в чистый виал и выделяли ДНК, используя ДНК-сорб-B («Интерлабсервис»), согласно протоколу производителя.
Выделение геномной ДНК из культур МБТ и клинических образцов. Для инактивации одну или несколько колоний со среды Левенштейна—Йенсена или 100 мкл клинического образца ресуспендировали в 500 мл 1% смеси N-acetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide (CTAB) в 50% изопропаноле, как описано ранее [10]. Перед выделением образец центрифугировали, су-пернатант сливали, ДНК выделяли из осадка с помощью набора ДНК-сорб-B («Интерлабсервис», Россия) согласно протоколу производителя.
ПЦР проводили в варианте с электрофорезной детекцией на термоциклерах фирмы БИС-М (Россия) или с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплифи-каторе LightCycler Nano («Roche»). Олигонуклеотидные праймеры и зонды синтезированы НПФ «Синтол», реагенты для ПЦР приобретали в компании Интерлабсер-вис. Молекулярное клонирование ПЦР продуктов проводили с помощью набора Clon JET PCR Cloning Kit («Thermo Scientific», США). Секвенирование по Сэнге-ру выполняли на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3500xL.
Результаты и обсуждение
Первоначальной задачей исследования являлось изучение процесса образования биопленок у различных генотипов Mycobacterium tuberculosis. Однако это яв-
Таблица 1
Список праймеров и зондов, использованных для идентификации микробиоты в микст-биоплёнках*
Название
Структура олигонуклеотида 5'->3'
Ссылка
Примечание
NS3/ NS6 (1BS эука-риоты)
EUB33BL/ALF6B5R (16S a-протеобактерии)
EUB33BL/BET6B2R (16S ß-протеобактерии)
GAM395L/GAMB71R (16S у-протеобактерии)
EUB27L/EUB1492R (16S универсальные)
W139F Rv2665R TnsR Probe 37
Probe 4B
935L(16S)
1070R (16S)
1010Bl(16S)
1010Bt(16S)
GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
TCTACGRATTTCACCYCTAC
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
ACGCATTTCACTGCTACACG
CMATGCCGCGTGTGTGAA
ACTCCCCAGGCGGTCDACTTA
AGAGTTTGATCATGGCTCAG
GGTTACCTTGTTACGACTT
GCGACCCGCCGTCTCCTGA
TCGGCCGTACGGACGACGAT
CGAGGCTGCCTACTACGCTC
(FAM)-TT (C-LNA)CTCTGACAGCAACA (C-LNA)CAGTT-(RTQ1)
(R6G)-AGACTCTCTGATCT(G-LNA)AGAC (C-LNA)TCA-(BHQ2)
AGCAACGCGAAGAACCTTACCA
GTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCA
(FAM)-CTAGAGATAGGG(C-LNA)TT(C-LNA)CCCTTC-(RTQ1)
(R6G)-TGGAGACAGG(G-LNA)T(C-LNA) Настоящее исследование TTCCCTTC-(BHQ2)
Примечание. *Нуклеотидные последовательности, определённые в рамках исследования, KY322510, KY317956)
[11] [11] [12]
[13] [12]
[14] [13] [13]
[15]
[16]
Настоящее исследование Настоящее исследование Настоящее исследование Настоящее исследование
Настоящее исследование
Настоящее исследование
Настоящее исследование
Настоящее исследование
Для индикации штаммов поп-В0^148
Для индикации штаммов поп-В0^148
Для индикации штаммов поп-В0^148
Для индикации штаммов поп-В0/ W148
Для индикации штаммов кластера В0АШ48
Для индикации B. licheniformis /B. thermoamylovorans —
Для индикации B. licheniformis /B. thermoamylovorans —
Для индикации B. licheniformis — Для индикации B. thermoamylovorans размещены в ДБ GenBаnk (КУ322511,
Таблица 2
Оценка устойчивости выявленных штаммов бацилл к 12 противотуберкулезным препаратам
Штамм Препараты (*MIC мкг/мл)
Of Mfx R A S Rbn PAS Eto Cs H Km E
B. licheniformis 0.25< 0.06< 0.12< 0.25 16 0.12< 1 >40 2.0< >4.0 2.5 >32
Brevibacillus spp. 61 l 0.12 0.12< 4 4 0.12< >64 >40 2.0< >4.0 >40 >32
Brevibacillus spp. 109 0,25< 0.12< 0.12< 8 8 0.12< >64 >40 64 >4.0 >40 >32
Примечание. *MIC — минимальная ингибирующая концентрация, Of (ofloxacin) — офлоксацин, Mfx (Moxifloxacin) — моксифлок-сацин, R (rifampin) — рифампицин, A (amikacin) — амикацин, S (streptomycin) — стрептомицин, Rbn (rifabutin) — рифабутин, PAS — ПАСК, Eto (ethionamide) — этионамид, Cs (cycloserine) — циклосерин, H (isoniazid) — изониазид, Km (kanamycin) — канамицин, E (ethambutol) — этамбутол. Жирным выделена MIC, обозначающая устойчивость к терапевтическим дозам ПТП.
ление не было обнаружено при работе с клиническими штаммами M. tuberculosis, т. е. с изолятами, выделенными от больных туберкулёзом. После отбора 150 клинических штаммов M. tuberculosis различных генотипов был произведен посев на синтетическую среду Школь-никовой (аналог Sauton's medium) [7]. Во всех пробирках был выявлен планктонный рост при отсутствии явления образования биоплёнок. Анализ литературы выявил, что на среде Школьниковой рост возбудителя в виде плёнки стимулируется при добавлении инакти-вированной сыворотки крови человека до 10% [8], что было воспроизведено в дальнейшем, но только с референтными (лабораторными) штаммами, полученными в рамках работы с ФСВОК. В процессе поиска решения было обнаружено, что посев мокроты от больных туберкулёзом, после стандартной обработки NALC/ NaOH, на среду Школьниковой без сыворотки в половине случаев сопровождался образованием биоплёнок за счет размножения сателлитных микроорганизмов. При исследовании 120 образцов мокроты выявлено 63 случая образования биоплёнок (отбор материала производился на 25-е сутки роста). Для определения наличия возбудителя туберкулёза в составе биоплёнок была применена ПЦР-РВ, позволяющая одновременно оценить концентрацию ДНК МВТ в образце и выявить присутствие эпидемического штамма B0/W148 или иного генотипа (табл. 1). Для этого были сконструированы праймеры и зонды, выявляющие специфическую вставку IS6110 элемента [17] и отсутствие этой инсер-ции (probe 48 и probe 37 соответственно).
В 30,2% (19/63) биоплёнок была обнаружена ДНК возбудителя туберкулёза. Все МВТ+ биопленки были исследованы в ПЦР с группо-специфическими прай-мерами на эукариотическую ДНК (грибы) гена 18S рРНК и аналогичными олигонуклеотидами гена 16S рРНК на классы a-протеобактерий, ß-протеобактерий и у-протеобактерий (см. табл. 1). Вольшинство образцов было положительно на ß-протеобактерии и отрицательно в остальных реакциях. Методом ПЦР-РВ с зондами probe 37 и probe 48 было отобрано 6 образцов, имеющих наибольшую концентрацию микобактериальной ДНК. ПЦР продукт, полученный с праймерами на 16S рРНК ß-протеобактерий одной из шести биоплёнок, был клонирован и секвенирован по Сэнгеру. Несмотря на ожидаемую специфичность (ß-протеобактерии), последовательности всех трёх исследованных клонов были практически идентичны и показали 99% гомологию с видом Bacillus thermoamylovorans на протяжении 364 п.н. (GenBank: KY317956). Для проверки полученного результата все отобранные образцы были посеяны на триптиказно-соевый бульон с целью выделения бациллярной флоры. В трех случаях обнаружены культуры, способные в течение 1—3 дней образовывать
биоплёнки на триптиказно-соевом бульоне и голодной среде Школьниковой (без сыворотки). Все три штамма отличались слизистыми колониями, гемолитической активностью (ß-гемолиз) и ползучим ростом на твёрдых питательных средах. Вследствие невозможности получения изолированных колоний, чистая культура была получена в 96 луночном планшете с триптиказно-соевым бульоном путем предельных разведений.
Для идентификации выявленных штаммов проведена амплификация фрагмента гена 16S рРНК с универсальными бактериальными праймерами EUB27L/ EUB1492R с последующим секвенированием ам-пликонов с этими же праймерами. Один штамм был идентифицирован как Bacillus licheniformis, гомология составляла более 99% (GenBank: KY322510). Два других штамма имели 97% гомологии с Brevibacillus agri (GenBank: KY322511) и другими видами этого рода, и были определены как Brevibacillus spp. Проведена оценка устойчивости выявленных трёх штаммов бацилл к 12-ти противотуберкулёзным препаратам (ПТП) 1-го и 2-го рядов в жидкой среде Middlebrook 7Н9 с помощью тест-системы Sensititre MycoTB.
Все штаммы были устойчивы к стрептомицину (MIC 32 мкг/мл), этионамиду (MIC > 40 мкг/мл), изониази-ду (MIC > 4 мкг/мл) и этамбутолу (MIC > 32 мкг/мл). Штаммы Brevibacillus spp. были так же устойчивы к ка-намицину и ПАСК (табл. 2).
Модельный эксперимент по исследованию совместного роста B. licheniformis с клиническими штаммами МБТ проведен в два этапа. Первоначально исследована возможность совместного роста B. licheniformis со случайно отобранными клиническими штаммами МБТ. С помощью ПЦР-РВ обнаружено, что только 50% (5/10) штаммов МБТ через 25 дней инкубации способны к росту (данные не приводятся). По всей видимости, наблюдалось подавление роста отдельных штаммов МБТ, чувствительных к антибиотику, продуцируемому B. licheniformis [18]. При этом корреляции с лекарственной устойчивостью исходных штаммов к известным антибиотикам не обнаружено. Для дальнейшего эксперимента отобрано три клинических штамма, один — генотипа B0/W148 и два иных генотипа.
В модельном эксперименте показано, что клинические штаммы M. tuberculosis при длительной совместной инкубации с B. licheniformis на среде Школьниковой сохраняют способность к росту численности микробной популяции (табл. 3) и изменяют морфологию биоплёнки, образованной бациллами (см. рисунок). Однако окраска по Цилю-Нильсену отпечатков биопленок из модельного эксперимента (рисунок не приводится) не показала выраженного нарастания концентрации МБТ. Сравнительное определение концентрации микобакте-риальной ДНК в бациллярной биоплёнке (табл. 3) также
loo
Таблица 3
Концентрация ДНК M. tuberculosis и B. licheniformis в модельном эксперименте совместного роста
День эксперимента/концентрация в геном-эквивалентах
10
20
35
Концентрация ДНК M. tuberculosis в положительном контроле 2,29 х 104 ± 7,12 х 102 1,83 х 106 ± 7,0 х 104 1,81 х 106 ± 7,0 х 104 (чистая культура), планктонный рост*
Концентрация ДНК M. tuberculosis в модельном эксперименте 1,24 х 104 ± 7,12 х 102 4,22 х 105 ± 7,04 х 103 6,23 х 105 ± 7,04 х 103 планктонный рост под биоплёнкой*
Концентрация ДНКM. tuberculosis в биоплёнке в модельном 2,3 х 103 ± 7,03 х 101 2,03 х 103 ± 7,03 х 101 2,80 х 103 ± 7,03 х 101 эксперименте*
Концентрация ДНК B. licheniformis в биоплёнке в модельном > 1,0 х 108 > 1,0 х 108 > 1,0 х 108 эксперименте
Концентрация ДНК B. licheniformis в среде под биоплёнкой в > 1,0 х 109 > 1,0 х 109 > 1,0 х 109 модельном эксперименте
Примечание. * усреднённые данные по трём штаммам на 1 мл среды или на 1 г биофильма.
не выявило признаков очевидной «колонизации» бациллярной биоплёнки микобактериями.
Для оценки распространённости спорообразующей бациллярной флоры сконструированы праймеры (табл. 1), комплементарные консервативным участкам, фланкирующим область 1010 нуклеотида гена 16SрРНК. Ожидаемая специфичность праймеров охватывает широкий круг таксонов семейства Bacillaceae. В предварительных исследованиях праймеры давали положительный результат с ДНК всех имеющихся штаммов из родов Brevibacillus и Bacillus. Вариабельная область 1010 нуклеотида гена 16S рРНК использована для дизайна зондов специфичных для отдельных видов бацилл. Зонд 1010B1 (FAM) высокоспецифичен для последовательности B. licheniformis, а зонд 1010Bt (R6G) — для последовательности B. thermoamylovorans. Проведено исследование чувствительности и специфичности полученного ПЦР-РВ теста на ДНК имеющихся штаммов B. licheniformis, B. thermoamylovorans, Brevibacillus spp. и рефернтных ДНК штаммов M. tuberculosis и нескольких видах нетуберкулёзных микобактерий (данные не приводятся). Обнаружена высокая специфичность и чувствительность разработанных праймеров и зондов
к ДНК B. licheniformis и B. thermoamylovorans, как при режиме видовой идентификации (отжиг при 65°С), так и в режиме поиска близкородственных видов (отжиг при 55°С). При этом ни в одном из режимов не наблюдалось гибридизации разработанных зондов с ДНК Brevibacillus spp. и ДНК микобактерий.
Исследована ДНК 87 случайно отобранных клинических образцов, положительных в ПЦР на M. tuberculosis. Выявлено 3 случая присутствия бациллярной ДНК близкородственной B. licheniformis (отжиг 55°С, зонд FAM) с ориентировочной концентрацией 104—106 геном-эквивалентов на грамм образца. В одном случае образец являлся гнойным содержимым лимфатического узла, в двух других образцы получены из плеврального синуса при гнойной эмпиеме.
По всей видимости, в модели in vitro МБТ не имеют возможности активно размножаться внутри биоплёнки, продуцируемой B. licheniformis, по причине её относительной токсичности для возбудителя туберкулёза [18]. Тем не менее, сама возможность симбиотического сосуществования некоторых штаммов M. tuberculosis и B. licheniformis и, вероятно, МБТ других видов бацилл, выраженный рост концентрации микобактериальной ДНК
Результаты модельного эксперимента по совместному росту штаммов M. tuberculosis и B. licheniformis после
30 дней инкубации на среде Школьниковой. Верхний ряд: пробирка слева — контрольная пробирка, чистая культураM. tuberculosis, биоплёнка отсутствует (наблюдается планктонный рост); пробирка посредине — совместная инкубация M. tuberculosis и B. licheniformis; пробирка справа — контрольная пробирка с чистой культурой B. licheniformis. Нижний ряд: для сравнения приведены примеры морфологии микобактериальных биоплёнок, выращенных в аналогичных условиях.
в бульоне под плёнкой при проведении модельного эксперимента позволяет предполагать, что такие процессы, могут происходить in vivo. Мы предполагаем, что такого рода патологический симбиоз в виде кратковременной персистенции «сапрофитических» бацилл в казеозном содержимом может возникать на поздних стадиях туберкулёза легких. Наиболее вероятным источником спор бацилл является табачный дым, поскольку B. licheniformis и ряд других спорообразующих бацилл являются мажорной микрофлорой табака [19]. Можно ожидать, что споры бацилл могут длительное время находиться в живой ткани лёгких без вегетации. Сигналом к размножению бацилл должно служить образование вокруг спор казеозной, т. е. некротизированной ткани, и возникновение аэробных условий. Такие события происходят на поздних стадиях туберкулеза достаточно часто, когда растущий очаг некроза открывается в просвет бронха. Дальнейшее исследование этого феномена может значительно изменить наше представление о патогенезе поздних стадий туберкулёза легких.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-04-00160 А.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2015. Geneva: World Health Organization; 2015.
2. Sambandan D., Dao D.N., Weinrick B.C., Vilcheze C., Gurcha S.S., Ojha A. et al. Keto-mycolic acid-dependent pellicle formation confers tolerance to drug-sensitive Mycobacterium tuberculosis. MBio. 2013; 4: @e00222—e00213.
3. Orme I.M. A new unifying theory of the pathogenesis of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2014; 94(1): 8—14.
4. Flentie K.N., Stallings C.L., Turk J., Minnaard A.J., Hsu F.-F. Characterization of phthiocerol and phthiodiolone dimycocerosate esters ofM. tuberculosis by multiple-stage linear ion-trap MS. J. Lipid Res. 2016; 57: 142—55.
5. Garg R., Tripathi D., Kant S., Chandra H., Bhatnagar R., Banerjee N. The conserved hypothetical protein Rv0574c is required for cell wall integrity, stress tolerance, and virulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect. andlmmun. 2015; 83(1):120—9.
6. Barton L. Structural and Functional Relationships in Prokaryotes. New York: Springer; 2005: 202—10.
7. Приказ № 109 от 21 марта 2003 г. Министерства здравоохранения Российской Федерации «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». М.; 2003. Avaible at: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_ LAW_100829/
8. Приказ Минздрава СССР от 8 июня 1978 г. N 558 «Обунификации микробиологических методов исследования при туберкулёзе». М.; 1978. Avaible at: http://base.garant.ru/4176008/
9. Hilz H., Wiegers U., Adamietz P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur. J. Biochem. 1975; 56(1):103—8.
10. Ogarkov O., Zhdanova S., Savilov E., Mokrousov I., Sinkov V., Antipina S. Lethal combination of mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and human CD209 -336G allele in Russian male populaion Infection. Genet. andEvolut. 2012; 12(4): 732—6.
11. White, T.J., Bruns, T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications / Eds. M.A. Innis, D.H. Gefand, J.J. Sninsky, T.J. White. SanDiego: AcademicPress; 1990: 315—22.
12. Amann R.I., Binder B.J., Olson R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D.A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ. Microbiol. 1990; 56(6):1919—25.
13. Muhling M., Woolven A., Murrel J.C.. Joint I. Improved group-specific PCR primers for denaturing gel electrophoresis analysis of the genetic diversity of complex microbial communities. ISME 2008; J 2: 379—92.
14. Ashelford K.E., Weightman A.J., Fry J.C. PRIMROSE: a computer
program for generating and estimating the phylogenetic range of 16S rRNA oligonucleotide probes and primers in conjunction with the RDP-II database. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 3481—9.
15. Hicks R.E., Amann R.I., Stahl D. Dual staining of natural bacterioplankton with 4',6-diamidino-2-phenylindole and fluorescent oligonucleotide probes targeting kingdom-level 16S rRNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 1992; 58(7): 2158—63.
16. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics / Eds. E. Stackebrandt, M. Goodfellow. New York: Wiley ; 1991: 115—47.
17. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Otten T., Jiao W.W., Gomes L.L. et al. Russian «successful» clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(11): 3757—9.
18. Callow R.K., Glover R.E., Hart P.D., Hills G.M. Licheniformin, an antibiotic substance from bacillus licheniformis, active against Mycobacterium tuberculosis. Br. J. Exp. Pathol. 1947; 28(6): 418— 40.
19. Han J.. Sanad Y.M., Deck J., Sutherland J.B., Li Z., Walters M.J. et al. Bacterial populations associated with smokeless tobacco products. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(20): 6273—83.
REFERENCES
1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2015. Geneva: World Health Organization; 2015.
2. Sambandan D., Dao D.N., Weinrick B.C., Vilcheze C., Gurcha S.S., Ojha A. et al. Keto-mycolic acid-dependent pellicle formation confers tolerance to drug-sensitive Mycobacterium tuberculosis. MBio. 2013; 4: @e00222—e00213.
3. Orme I.M. A new unifying theory of the pathogenesis of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2014; 94(1): 8—14.
4. Flentie K.N., Stallings C.L., Turk J., Minnaard A.J., Hsu F.-F. Characterization of phthiocerol and phthiodiolone dimycocerosate esters of M. tuberculosis by multiple-stage linear ion-trap MS. J. Lipid Res. 2016; 57: 142—55.
5. Garg R., Tripathi D., Kant S., Chandra H., Bhatnagar R., Banerjee N. The conserved hypothetical protein Rv0574c is required for cell wall integrity, stress tolerance, and virulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect. andlmmun. 2015; 83(1):120—9.
6. Barton L. Structural and Functional Relationships in Prokaryotes. New York: Springer; 2005: 202—10.
7. Order of the Russia Ministry of Health on March 21, 2003 N 109. Moscow; 2003. Avaible at: http://www.consultant.ru/document/ cons_doc_LAW_100829/ (in Russian)
8. Order of the USSR Ministry of Health on June 8, 1978 N 558. Moscow; 1978. Avaible at: http://base.garant.ru/4176008/ (in Russian)
9. Hilz H., Wiegers U., Adamietz P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur. J. Biochem. 1975; 56(1):103—8.
10. Ogarkov O., Zhdanova S., Savilov E., Mokrousov I., Sinkov V., Antipina S. Lethal combination of mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and human CD209 -336G allele in Russian male populaion Infection. Genet. and Evolut. 2012; 12(4): 732—6.
11. White, T.J., Bruns, T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications / Eds. M.A. Innis, D.H. Gefand, J.J. Sninsky, T.J. White. SanDiego: AcademicPress; 1990: 315—22.
12. Amann R.I., Binder B.J., Olson R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D.A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ. Microbiol. 1990; 56(6):1919—25.
13. Muhling M., Woolven A., Murrel J.C.. Joint I. Improved group-specific PCR primers for denaturing gel electrophoresis analysis of the genetic diversity of complex microbial communities. ISME 2008; J 2: 379—92.
14. Ashelford K.E., Weightman A.J., Fry J.C. PRIMROSE: a computer program for generating and estimating the phylogenetic range of 16S rRNA oligonucleotide probes and primers in conjunction with the RDP-II database. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 3481—9.
15. Hicks R.E., Amann R.I., Stahl D. Dual staining of natural bacterioplankton with 4',6-diamidino-2-phenylindole and fluorescent oligonucleotide probes targeting kingdom-level 16S rRNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 1992; 58(7): 2158—63.
16. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in
Bacterial Systematics / Eds. E. Stackebrandt, M. Goodfellow. New York: Wiley ; 1991: 115—47.
17. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Otten Т., Jiao W.W., Gomes L.L. et al. Russian «successful» clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(11): 3757—9.
18. Callow R.K., Glover R.E., Hart P.D., Hills G.M. Licheniformin, an antibiotic substance from bacillus licheniformis, active against Mycobacterium tuberculosis. Br. J. Exp. Pathol. 1947; 28(6): 418—40.
19. Han J.. Sanad Y.M., Deck J., Sutherland J.B., Li Z., Walters M.J. et al. Bacterial populations associated with smokeless tobacco products. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(20): 6273—83.
Ogarkov OB.1-2-3, Badleeva M.V.4, BelkovaNL.15, AdelshinR.V.6, Tsyrenova TA.7, Khromova PA.1, Sinkov V.V.18, Kostjunin K.Yu.8, Dashatsyrenova SB?, Koshcheyev ME.7, Zarbuev AN?, Zhdanova S N.1
THE PHENOMENON OF BIOFILM FORMATION
BY BREVIBACILLUS SPP. AND BACILLUS SPP. WITH THE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CLINICAL ISOLATES PRESENCE
'Scientific Centre of the Family Health and Human Reproduction Problems, 664003, Irkutsk, Russia; 2Irkutsk State University, 664003 Irkutsk, Russia; 3Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education, 664079, Irkutsk, Russia; 4Buryat State University, 670000, Ulan-Ude, Russia; 5Limnological institute, 664033, Irkutsk, Russia; 6Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, 664047, Irkutsk, Russia; 7Irkutsk Clinical Tuberculosis Hospital, 664039, Irkutsk, Russia;
8Irkutsk Diagnostic Center, 66047, Irkutsk, Russia; 9Buryat Republican Clinical Tuberculosis Dispensary, 670004, Ulan-Ude, Russia.
Biofilms formation by M. tuberculosis on the synthetic Shkolnikova's medium (analog of Sauton's medium) was studied. One hundred fifty clinical and twenty reference laboratory strains of M. tuberculosis were investigated. None of the 150 isolates from people produced biofilms (pellicle), but showed abundant planktonic growth. All of 20 reference strains of M. tuberculosis produced both pellicle and
planktonic growth. The phenomenon of the pellicle formation by the mixed cultures from sputum treated with NALC-NaOH was found. Sixty three mixed pellicles were retrieved. Biofilms contained DNA of M. tuberculosis made up 30.2% of total number (19/63). Six samples with the highest concentration of mycobacterial DNA were revealed by the RT-PCR method. A molecular cloning and sequencing of 16S rDNA fragment of one pellicle was done. The nucleotide sequences showed 99% identity with Bacillus thermoamylovorans. Three strains of spore-forming bacilli were isolated from these mixed biofilms. Strains were identified by Sanger sequencing of 16S rDNA, one as Bacillus licheniformis and two others as Brevibacillus spp. Susceptibility of these bacilli to 12 first- and second-line antituberculosis drugs was studied. All three strains were resistant to the maximum concentrations of isoniazid, streptomycin, ethambutol, and ethionamide. Strains of Brevibacillus spp. were additionally resistant to kanamycin and PAS. The possibility of combined growth of clinical strains ofM. tuberculosis and B. licheniformis in long-term co-incubation in a Shkolnikova's medium was shown in vitro model. B. licheniformis produced a pellicle in the first few days of growth, which remained stable during the whole observation period — 45 days. Hypothesis was postulated on the possibility of short-term persistence of some species of «saprophytic» bacilli in lung during later stages of pulmonary tuberculosis within caseous necrosis. Keywords: M. tuberculosis; Brevibacillus spp.; Bacillus spp.; pellicle formation
For citation: Ogarkov O.B., Badleeva M.V., Belkova N.L., Adelshin R.V., Tsyrenova T.A., Khromova P. A., Sinkov V.V., Kostjunin K.Yu., Dashatsyrenova S.B., Koshcheyev M.E., Zarbuev A.N., Zhdanova S.N. The phenomenon of biofilm formation by Brevibacillus spp. and Bacillus spp. with the Mycobacterium tuberculosis clinical isolates presence. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(3): 98103 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-98-103.
For correspondence: Oleg B. Ogarkov. E-mail: obogarkov@gmail. com
Acknowledgments. This work was supported by the Russian Science Foundation (16-04-00160 А.).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 09.02.17 Accepted 27.05.17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
УДК 616.314.17-002-08-07:616.316-008.87:577.21.08
Баймиев Ал.Х.1,2, Швец К.Ю.1, Мавзютов А.Р.1, Тамарова Э.Р.1, Булгакова А.И.1
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИз МИКРОБИОТЫ ПАРОДОНТАЛьНЫХ КАРМАНОВ И СЛЮНЫ МЕТОДОМ ПЦР в режиме реального времени до И ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ ПАРОДОНТИТА
'ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 450008, Уфа, Россия; 2ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, 450054, Уфа, Россия.
Резюме. Проведена работа по стандартизации выявления и количественного определения пародонтопатогенных микроорганизмов в клиническом материале (содержимое пародонтального кармана, слюна) методом ПЦР в режиме реального времени. Для оптимизации условий проведения анализа разработан способ получения клинических образцов известного объёма, а также сконструирован калибровочный образец для получения достоверных результатов при диагностике пародонтита. Ключевые слова: пародонтит, ПЦР в режиме реального времени, ранняя диагностика, оценка эффективности лечения.
Для цитирования: Баймиев Ал.Х., Швец К.Ю., Мавзютов А.Р., Тамарова Э.Р., Булгакова А.И. Количественный анализ микро-биоты пародонтальных карманов и слюны методом ПЦР в режи-
ме реального времени до и после лечения пародонтита. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017;35(3):103-108. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-3-103-108.
Воспалительные заболевания пародонта имеют высокую распространённость среди населения и представляют серьезную проблему, особенно среди взрослых, где отмечается тенденция к росту заболеваемости, достигающей 98% случаев [2, 4]. Важнейшим пусковым фактором в инициации деструктивного процесса в тканях пародонта является формирование зубной бляшки как многослойной микробной биоплёнки с участием пародонтопатогенных микроорганизмов Porphyromonas gingivalis и Treponema denticola, а также представителей резидентной микрофлоры полости рта Streptococcus sobrinus, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus
Для корреспонденции: Баймиев Алексей Ханифович (Baymiev AlekseyHanifovich), [email protected];
