CC BY
34
2012, Т. 2, № 1-2
Современное лабораторное обеспечение.
и сопредельных стран. Оперативное расследование вспышек заболевания для выявления источника инфекции и путей передачи возбудителя затруднительно без комплекса молекулярно-биологических методов, способных быстро и четко дифференцировать различные штаммы. Целью данного исследования являлось изучение генотипирование штаммов представительной коллекции коксиелл с помощью мультилокусного анализа VNTR (тандемных повторов варьирующей копийности).
Исследовано 14 штаммов из коллекции ФБУН НИИ Эпидемиологии и Микробиологии имени Пастера. Для VNTR-анализа были выбрано 6 локусов вариабельных тандемных повторов. В результате кластерного анализа 6 полученных генотипов были разделены на 2 кластера. Отмечено сходство генотипов российских штаммов (шесть из семи штаммов) с западноевропейским референс-штаммом (Henzerling), штаммом, выделенным на территории Монголии, и вакцинным штаммом М44. Указанные штаммы вошли в состав первого геномного кластера. В то же время, три штамма, выделенные на территории республик Средней Азии (Казахстан, Узбекистан), представляли три разных генотипа в составе двух кластеров. Из них один штамм (Казахстанский-4) относился к первому кластеру, объединяющему российские и западноевропейский штаммы, два штамма — к генетически дистанцированному второму кластеру. Второй кластер включает также единственный российский штамм (Ленинградский-2), выделенный в ходе вспышки Ку-лихорадки на текстильном предприятии, которая, по данным эпидемиологического анализа, имела завозной характер.
Согласно результатам VNTR-анализа, популяция C. burnetii, циркулирующая на территории России, представляет генетически мономорфную группу. В республиках Средней Азии выявлена генетическая гетерогенность популяции патогена, связанная с циркуляцией нескольких генотипов, в том числе сильно дистанцированных. В целом, для аллельных вариантов тандемных повторов характерна географическая привязанность. При высокой дискриминационной способности VNTR-анализа возможно выявление штаммов, проникших из удаленных регионов, что является важным аспектом молекулярно-эпидемиологического анализа.
ВЛИЯНИЕ ТРОФИЧЕСКОГО СТРЕССА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИЙ
Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, М.Л. Альтшулер, О.В. Никифорова
ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва
Некультивируемые формы бактерий образуются под действием неблагоприятных факторов окружающей среды. Актуальность изучения условий формирования и реактивации некультивируемых форм связана с необходимостью выявления источников инфекции в природе, возбудителей в клиническом материале, с оценкой микробной загрязненности воды, воздуха, пищевых продуктов и определением жизнеспособности клеток после анабиоза в вакцинных, пробиотических и других биопрепаратах. Цель работы — изучение жизнеспособности микроорганизмов при длительной инкубации в трофически скудной среде обитания. В опытах использованы штаммы Klebsiella pneumoniae 1954, Proteus vulgaris
HX 19222, Enterobacter aerogenes ГИСК 418, Alcaligenes faecalis 415, E. coli M17, E. coli (col IE1). Суточные культуры, выращенные при 37°C на питательном бульоне, пересевали на солевую среду с 0,1 г/л дрожжевого экстракта, использованную ранее для образования форм покоя у Azospirillum (Mulyukin A.L. et al., 2000). Через 24 час. культивирования бактерии переносили в ту же среду с 5-кратно сниженным источником азота и инкубировали в течение 1 года в условиях комнатной температуры. Общую численность бактерий определяли в камере Горяева, жизнеспособность вегетирующих клеток — по количеству коло-ниеобразующих единиц (КОЕ/мл). Тотальное число жизнеспособных клеток, включая некультивируе-мые, подсчитывали в люминесцентном микроскопе после окраски проб набором красителей Live/Dead. Количество некультивируемых клеток, неспособных формировать колонии на традиционных средах, оценивали, сопоставляя результаты. Аналогично определяли показатели для E. coli M17 и (colIE1), инкубированных в течение 10 месяцев в искусственной морской воде при +4°C. Максимум КОЕ/мл (в зависимости от вида) на солевой среде был 107—109 (исходный уровень 105—107). Изменение количества микроорганизмов характеризовалось сукцессионной сменой популяций, выражавшейся в чередующихся периодах отмирания большей части клеток и роста. Через 1 год инкубации в солевой среде жизнеспособность клеток всех видов составила 103—106 КОЕ/ мл. Наибольшую выживаемость (около 99%) имели E. aerogenes и P. vulgaris. Количество жизнеспособных клеток K. pneumoniae и A. faecalis составляло 66,4 и 68,6%, соответственно. Общее число жизнеспособных клеток E. coli в искусственной морской среде через 10 мес. составило 64,6% для колициногенной культуры E. coli (colIE1) и 89,1% для пробиотического штамма E. coli M17. Возможно, спонтанный синтез колицина снижал число клеток продуцента. Таким образом, при инкубации бактерий в течение 1 года в среде с низким содержанием азота или в морской воде через 10 мес. процент живых клеток, не всегда способных формировать колонии на традиционных средах, оставался достаточно высоким.
ФЕНОМЕН МИКРОБНОГО РАСПОЗНАВАНИЯ «СВОЙ-ЧУЖОЙ» В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ ЧЕЛОВЕКА
Н.Б. Перунова
Федеральное государственное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук, г. Оренбург
Микросимбиоценоз, являясь одним из векторов ассоциативного симбиоза человека, представляет собой открытую единую саморегулирующуюся систему, представляющую совокупность популяций микроорганизмов различных (автохтонных и аллох-тонных) видов, находящихся в сложных взаимосвязях, исход которых определяет гомеостаз хозяина (Бухарин О.В., 2011). Формирование микросимбио-ценоза обусловлено наличием системообразующего фактора, который, как показано ранее, определяется универсальными физиологическими функциями микросимбионтов: рост/размножение и персистен-ция (Бухарин О.В., Перунова Н.Б., 2010).
Изучение механизмов функционирования ми-кросимбиоценоза под контролем его системообразующего фактора, позволило выявить феномен
Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.
Инфекция и иммунитет
микробного распознавания «свой-чужой» в ми-кросимбиоценозе кишечника человека, основанный на экспериментально установленной оппо-зитности (усиление/подавление) взаимодействия микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант». Использование экзометаболитов микроорганизмов и применение в качестве индикаторной культуры би-фидобактерий вида B. longum позволило определить «свои» виды микроорганизмов (лактозоположитель-ные негемолитические E. coli и E. faecium), у которых происходило усиление функций (рост/размножения, антилизоцимной активности и биопленкообразо-вания) под действием бифидобактерий, а у «чужих» микросимбионтов (лактозоотрицательные гемолитические E. coli, K. рпеитошае, S. aureus и C. albicans) изученные свойства подавлялись.
Таким образом, полученные результаты показали, что при ассоциативном симбиозе не только сам хозяин в состоянии организовать собственную защиту от ассоциантов, различая «чужаков» при помощи рекогносцировочных механизмов врожденного иммунитета (ПРР клеток), но и при помощи своей нормофлоры, которая способна реализовать принцип «микробного распознавания» ассоциантов в системе «свой — чужой», являясь «первой линией» колонизационной защиты хозяина. Можно предположить, что выявленный феномен микробного распознавания базируется на участии метаболитов нормофлоры, образуемых ею после соинкубирова-ния с супернатантами ассоциантов, роль которых активно обсуждается в настоящее время (Shank A.E., Kolter R., 2009).
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ПРИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Г.А. Петрушанская, Л.В. Черкасова, Р.А. Бурханов
Филиал ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» в САО города Москвы, Москва
Развившаяся в 1986 г. в Великобритании эпизоотия губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота спровоцировала увеличение числа болезни Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), вызванной заражением молодых людей через инфицированное мясо больных коров. На БКЯ приходится 90% всех прионных заболеваний.Способность инфекционного прионного белка преодолевать видовые барьеры доказана и в лабораторных условиях. По мнению эпидемиологов в ближайшее время следует ожидать дальнейшего подъема заболеваемости. В этой связи становиться весьма актуальной разработка и внедрение в практику методов определения инфекционного прионного белка в мясных продуктах, а также методов лабораторной клинической диагностики. Поскольку заражение животных может произойти в результате скармливания пищевыми добавками, приготовленных на основе мяса больных животных, представляется важным лабораторный контроль кормов и кормовых добавок на предмет содержания в них прионных белков. Сложность создания тест-систем обусловлена схожестью аминокислотного состава нормального и инфекционного прионного белка. Путем сложных иммунохи-мических методов очистки удалось получить строго специфические препараты для достоверной идентификации специфических эпитопов инфекционного прионного белка. На этой основе с помощью
иммуноферментного анализа (ИФА) и полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) созданы тест системы, позволяющие определять прионный белок и его ген в следовых количествах.
Итальянские исследователи разработали вариант ПЦР в режиме реального времени, позволяющий определить ген прионных белков в кормах в количестве 10 пг при содержании различных животных добавок (ткани овец, свиней, коз, кур и рыб) в количестве 0,1% от общей массы корма (Bellagamba F. с соавт., 2006 г.). Использование митохондриальной ДНК позволяет повысить этот показатель до 0,01%. Высокая чувствительность и специфичность тест-систем достигается при совместном применении технологии ИФА и ПЦР в одном формате. Так, бельгийские и немецкие исследователи разработали вариант ПЦР-ИФА для количественного определения про-теазорезистентного прионного белка в ткани мозга больных БКЯ. Разработанный вариант оказался в 10 раз чувствительнее ИФА. Специфичность анализа составила 100% (Gofflot Sx соавт. 2005 г.).
ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ НА ТЕРРИТОРИИ г. ШАХТЫ
С.Г. Плясовица, Н.А. Вяткина, И.В. Шумских, А.М. Орехова, Л.А. Аладышева
Филиал ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области» в городе Шахты
За последние 15 лет (период 1997—2011 гг.) эпидемиологические проявления заболеваемости сальмо-неллезом в городе претерпевают существенные изменения и имеют тенденцию к росту.
В динамике заболеваемости сальмонеллезом цикличность выражена нечетко. С 1997 по 2011 гг. прослеживаются периоды подъема и снижения заболеваемости с интервалами 1—3 года. Наименьший уровень заболеваемости — в 2004 г. (8,31 на 100 тыс.). 2005 г. — начало очередного подъема заболеваемости, затем период относительной стабильности в 2006— 2008 гг., (23,38—24,62 на 100 тыс) и период роста заболеваемости в 2009-2011 гг. (43,78-67,95 на 100 тыс.).
Возрастная структура заболеваемости саль-монеллезом имеет тенденцию к «повзрослению». В 1998-2000 гг. наиболее высокие уровни заболеваемости среди детей (58,7-60,3%), период стабильности заболеваемости (2006-2008 гг.) — заболеваемость детей — 32,8-38%, в годы подъема заболеваемости (2009-2011 гг.) доля детей — 23,4-46,7%.
В этиологической структуре заболеваемости доминируют сероварианты сальмонелл серогруп-пы Д — сальмонелла энтеритидис, биохимический вариант Jena и серогруппы В — сальмонелла тифи-муриум, биовариант а и b.
Доля сероварианта группы В (Salmonella typhimurium) только в 1998-2000 гг. превышала уровень других вариантов сальмонелл и составляла в структуре заболеваемости 49,5-57,1%.
Число циркулирующих серовариантов других групп сальмонелл в последние годы отличается многообразием (более 16). Эпидемиологическая значимость этих сероваров невелика, их доля в этиологической структуре заболеваемости 1,48-17% в разные годы.
Полиэтиологичность сальмонеллезов на территории города, циркуляция нескольких серовари-антов сальмонелл, свидетельствует о действии хронического полифакторного децентрализованного
