CC BY
133
DOI http://dx.doi.org/10.18551/rjoas.2016-06.09
ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ ВИДА MANNHEIMIA HAEMOLYTICA
FEATURES OF BIOCHEMICAL IDENTIFICATION AND DIFFERENTIATION OF MANNHEIMIA HAEMOLYTICA
Лаишевцев А.И., научный сотрудник Laishevtcev A.I., Researcher Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко, Москва, Россия
All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Y.R. Kovalenko, Moscow, Russia E-mail: a-laishevtsev@bk.ru
АННОТАЦИЯ
В работе отражены результаты биохимической идентификации полевых изолятов и коллекционных штаммов Mannheimia haemolytica в сравнительном аспекте с Pasteurella multocida. Полученные результаты подтверждают высокую степень схожести биохимических профилей данных видов микроорганизмов. Среди основных биохимических тестов рекомендуемых для проведения дифференциации Mannheimia haemolytica от Pasteurella multocida стоит считать тест на индол, сорбитол, мальтозу, орнитиндекарбоксилазу, o-nitrophenyl-р, D-galactoside (ONPG). Дифференциация бактерий Mannheimia haemolytica от схожего по биохимическим свойствам вида Bibersteinia trehalosi стоит проводить с использованием тестов на ферментацию арабинозы, трегалозы, ксилозы, лактозы, гидролиза эскулина, разжижение желатина.
ABSTRACT
The work shows the results of biochemical identification of field isolates and collection strains of Mannheimia haemolytica in comparison with Pasteurella multocida. The results obtained confirm the high degree of similarity between the biochemical profiles of these species of microorganisms. Among major biochemical tests recommended for the differentiation Mannheimia haemolytica from Pasteurella multocida should be considered a test for indole, sorbitol, maltose, ornithindecarboxilase, o-nitrophenyl urea-p, D-galactoside (ONPG). Differentiation of bacteria Mannheimia haemolytica from similar in biochemical properties, species Bibersteinia trehalosi should be carried out using tests of arabinose, trehalose, xylose, lactose, hydrolysis of esculin, liquefaction of gelatin.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Идентификация, манхеймиоз, биохимические свойства. KEY WORDS
Identification, mannheimiosis, biochemical properties.
Лабораторная диагностика является основной частью постановки окончательного диагноза на инфекционное заболевание. Полнота и достоверность полученных результатов имеет прямую связь с рядом факторов, к которым можно отнести: достаточное лабораторное обеспечение, наличие квалифицированных кадров, сложность воспроизведения выбранного метода лабораторной диагностики и т.д. Кроме того, не смотря на широкое распространение более современных методик индикации и идентификации возбудителей, таких как генетические методы и масс-спектрометрия основу диагностики составляют рутинные микробиологические методы, так как они являются наиболее воспроизводимыми в условиях районных и областных ветеринарных лабораториях. В этой связи расширение научной информационной базы
сотрудников диагностической лаборатории должно являться приоритетной задачей как для руководства лаборатории, так и непосредственно для самих исполнителей [10-12].
Основной причиной необходимости постоянного профессионального совершенствования для микробиолога является изменчивость микроорганизмов, а также появление несвойственных для территории возбудителей [18]. Ярким примером данной ситуации является сложность межродовой и межвидовой идентификации возбудителей, основываясь на сахаролитических и протеолитических свойствах. Для примера, хочется привести ситуацию связанную с идентификацией бактерий семейства Pasteurellaceae, в состав которой входит род Pasteurella spp. со своими видами, имеющие весьма схожие фенотипические свойства. И все инфекции вызванные видами данного рода считались пастереллезом, в связи с чем в лабораториях диагностика зачастую приводилась до рода Pasteurella без идентификации вида [16]. В настоящее же время вид Mannheimia spp., ранее входивший в состав рода Pasteurella spp., реклассифицирован в отдельный род микроорганизмов ввиду своей специфичности [2]. Данная ситуация является абсолютно оправданной, исходя из эпизоотологических данных и биологических свойств возбудителя. В настоящее время стоит рассматривать заболевание, вызванное данным микроорганизмом, как отдельную нозологическую единицу. В дальнейшем, произошло очередное отделение вида рода Mannheimia spp. в отдельный род Bibersteinia spp [8].
Все три рода микроорганизмов имеют достаточно схожие культуральные, морфологические и биохимические свойства, ввиду чего при проведении лабораторно диагностических работ возбудителей относят к роду Pasteurella spp., не углубляясь в определение видовой принадлежности, что в свою очередь влияет на выбор биологического препарата для специфической профилактики заболевания [13, 17].
Наличие на Российском рынке достаточного количества вакцин против пастереллеза является преимуществом лишь для тех предприятий, где диагноз установлен достоверно. В случае возникновения в хозяйстве инфекции, вызванной Mannheimia haemolytica, данные препараты будут неэффективны. В этой связи встает актуальным вопрос достоверной диагностики с целью оптимального подбора лечебно-профилактических средств и методов для достижения оздоровительной эффективности [19-21].
Целью настоящей работы стало сравнительное изучение биохимических свойств полевых изолятов и музейных штаммов Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida, как наиболее эпизоотически значимых видов бактерий, вызывающий пастереллез. Кроме того, актуальной является необходимость определения принципов бактериологической дифференциации Mannheimia haemolytica от Bibersteinia trehalosi, так как данные виды микроорганизмов являются наиболее близкими по фенотипическим свойствам [1,3,4].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследование проводили на базе ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко».
Материалом для исследования послужили 20 коллекционных штаммов бактерий из коллекции типовых культур ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко, относящихся к виду Pasteurella multocida (№68 от 10.02.1970, №713 от 13.00.1989, №2241 от 13.01.1989, №903 от 12.02.1985, №1041 от 13.01.1989, №24 от 20.10.1987, №1281 от 20.10.1987, №2241 от 26.05.1988, №749 от 20.10.1977, №1041 от 26.05.1988, №506 от 27.01.1988, №308 от 20.10.1987, №4519 от 18.05.2002, №713 от 26.05.1988, №115 от 30.04.2001, №1662 от 17.04.1981, №1581 от 17.04.1989, №1591 от 17.04.1989, №2225 от 17.04.1989, №22 от 02.04.1987). Помимо коллекционных штаммов в работе были использованы 7 полевых изолятов бактерий рода Pasteurella spp., выделенных из неблагополучных предприятий в 2015-2016 гг. Бактерии вида Mannheimia haemolytica в исследовании были представлены производственными и эталонными штаммами
№169, №33396, №В158, а также изолятом № КАВ mh-1, выделенным в 2016 году из поврежденных легочных тканей крупного рогатого скота. Анализ свойств Bibersteinia trehalosi проводили в сопоставлении с литературными данными, ввиду отсутствия данных штаммов на момент проведения исследования.
В ходе выполнения работы применяли микроскопические, бактериологические, статистические методы исследований.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В настоящее время индикацию возбудителя пастереллеза на территории РФ проводят в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц» утвержденным Министерством сельского хозяйства Российской Федерации №22-7/82 от 20.08.1992, но ввиду расширения научной базы данного вопроса, а также с целью актуализации методики проведения исследования стоит рассмотреть необходимость и возможность обновления данного методического указания.
Наиболее воспроизводимыми методами видовой идентификации Mannheimia haemolytica стоит считать идентификацию, основанную на определении сахаролитических и протеолитических свойств возбудителя. Определение сахаролитических свойств возбудителя подразумевает под собой выявление способности бактерий к утилизации углеводов с образованием органических кислот или кислот в комплексе с газом. Определение протеолитических свойств подразумевает выявление возможности продуцирования протеаз, способствующих расщеплению белка.
Количество тестов, при использовании которых возможно произвести родовую идентификацию микроорганизма достаточно большое, тем не менее для близкородственных по фенотипическим свойствам видам бактерий лишь некоторые из этих свойств будут дифференцирующими. Так, Mannheimia haemolytica, ранее именуемая, как Pasteurella haemolytica, считалась видом рода Pasteurella spp. В последующем при изучении фенотипических свойств данных бактерий G.R. Smith предложил разделить вид Pasteurella haemolytica на два биотипа - к биотипу А относили микроорганизмы, способные к ферментации арабинозы, к биотипу Т -способные к ферментации трегалозы. В последующем биовар Т был обособлен в отдельный вид Pasteurella trehalosi, а в дальнейшем Bibersteinia trehalosi [14]. Перечисленные микроорганизмы имеют целый ряд схожих ферментативных реакций, что и сам род Pasteurella spp., основными из которых являются положительные реакции у обоих возбудителей на ферментацию оксидазы и каталазы. Определение значения данных тестов должно стоять на первом месте после получения культуры на питательной среде и изучения её морфологических свойств. Стоит отметить, что данные бактерии являются грамотрицательными короткими, возможно кокковидными палочками [7, 15]. Кроме того штаммы Mannheimia haemolytica вызывают гемолиз эритроцитов, который можно увидеть на рисунке №1. На рисунке 2 отображен рост колоний штамма Mannheimia haemolytica В158 на кровяном агаре.
В случае получения положительной реакции в тестах на оксидазу и каталазу и выявления морфологических признаков бактерий рода Pasteurella spp. проводится определение биохимических свойств культуры, приведенное в таблице 1. В виду того, что вариабельность внутривидовых биохимических свойств отмечается у всех видов микроорганизмов, данный нюанс стоит учитывать при проведении идентификации. Так положительный результат образования кислоты из трегалозы Bibersteinia trehalosi является важным дифференцирующим свойством возбудителя от Mannheimia haemolytica, хотя в то же время данной способностью обладает подвид Pasteurella multocida subsp. Septica [5].
Рисунок 1 - Гемолитические свойства Рисунок 2 - Рост колоний штамма
штамма Mannheimia haemolytica В158 Mannheimia haemolytica В158
на кровяном агаре на кровяном агаре
Таблица 1 - Биохимические свойства бактерий вида Mannheimia haemolytica, Bibersteinia
trehalosi и Pasteurella multocida
Тест Сокращенное Mannheimia Bibersteinia Pasteurella
название haemolytica trehalosi multocida
1 2 3 4 5
Не дифференцирующие тесты
Acetoin production (Voges-Proskaïier reaction) Vp - - -
D-галактоза GA + + +
D-глюкоза GLU + + +
D-маннитол MAN + + ±
D-фруктоза FC + + +
Адонитол ADO - - -
Аргининдигидролаза ADH - - -
Восстановление нитрата NO3 + + (+)
ГидролизМ-benzyl-arginine-p-naphthylamide BANA - -
Гидролиз p-nitrophenyl-N-acetyl-p,D-glucosaminide NAG - - -
Гидролиз p-nitrophenylphosphoester PHS (+) (+)
Гидролиз p-nitrophenyl-р, D-glucoside pGLU (-) (-) -
Гидролиз proline-p-naphthylamide PRO - - -
Гидролиз pyrrolidine-р-naphthylamide PYR - - -
Гидролизtryptophane-p-naphthylamide TRY
Каталаза CAT + + +
Лизиндекарбоксилаза LYS - - -
1 2 3 4 5
Оксидаза OXI + + +
Подвижность MOT - - -
Сахароза SU + + +
Сукроза SUC + + +
Уреаза URE - - -
Тесты дифференцирующие Pasteurella multocida от Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi.
Индол IND - (-) (+)
Сорбитол SOR - +
Орнитиндекарбоксилаза ORN - (-) (+)
Гидролиз o-nitrophenyl-ß,D-galactoside (ONPG) ONPG (+) (+) (-)
Мальтоза MA + (+) (-)
Тесты дифференцирующие Mannheimia haemolytica от Bibersteinia trehalosi.
Арабиноза ARA + - -
Трегалоза TR - + +
D-ксилоза XYL (+) - +
Лактоза LAC + - -
Гидролиз эскулина ESC - + -
Разжижение желатины GEL - + -
«+» - положительный результат. «-» - отрицательный результат. «±» - вариабельная реакция.
(+) - в большей степени результат положительный. (-) - в большей степени результат отрицательный.
Первым этапом идентификации изолятов Mannheimia haemolytica стоит считать дифференциацию его от Pasteurella multocida, как наиболее часто индицируемого вида. Pasteurella multocida в отличие от двух других рассматриваемых видов обладает положительными результатами индольного теста, ферментации сорбитола, а также обладает присутствием орнитиндекарбоксилазы. В свою очередь бактерии Mannheimia haemolytica и Bibersteinia trehalosi имеют положительный результат гидролиза o-nitrophenyl-ß, D-galactoside (ONPG - тест) и ферментацию мальтозы, в то время как для бактерий вида Pasteurella multocida значение данных тестов преимущественно является отрицательным. Результаты идентификации музейных штаммов и полевых изолятов пастерелл и манхеймий, по дифференцирующим свойствам, приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты идентификации бактерий рода Pasteurella spp. и Mannheimia spp. по
дифференцирующим тестам
Тест Сокращенное название Mannheimia haemolytica (3 штамма и 1 изолят) Pasteurella multocida (20 штаммов и 7 изолятов)
Кол-во. % Кол-во. %
Индол IND - / (4 из 4) -/ 100% + / (27 из 27) + / 100%
Сорбитол SOR - / (4 из 4) -/ 100% + / (27 из 27) + / 100%
Орнитиндекарбоксилаза ORN - / (4 из 4) -/ 100% + / (27 из 27) + / 100%
Гидролиз o-nitrophenyl-p,D-galactoside (ONPG) ONPG + /(4 из 4) + / 100% - / (27 из 27) -/ 100%
Мальтоза MA + /(4 из 4) + / 100% - / (27 из 27) - / 100%
Арабиноза ARA + /(4 из 4) + / 100% - / (27 из 27) -/ 100%
Трегалоза TR - / (4 из 4) -/ 100% + / (27из 27) + / 100%
D-ксилоза XYL + /(4 из 4) + / 100% + / (26 из 27) + / 96,3%
Лактоза LAC - / (4 из 4) -/ 100% - / (27 из 27) -/ 100%
Гидролиз эскулина ESC - / (4 из 4) -/ 100% - / (27 из 27) - / 100%
Разжижение желатины GEL - / (4 из 4) -/ 100% - / (27 из 27) -/ 100%
В соответствии с полученными результатами при биохимическом типировании коллекционных штаммов можно сделать заключение, что использование тестов, приведенных в таблице 2, позволяет производить дифференцирование культур
Mannhei'mi'a haemolyti'ca от Pasteurella multoa'da, что в свою очередь подтверждается научными данными [6,9]. Результаты изучения биохимических свойств музейных штаммов Pasteurella multocida свидетельствуют о том, что все штаммы бактерий имеют одинаковый биохимический профиль согласно данным, указанным в таблице 2, и в действительности относятся к данному виду микроорганизмов. Исключением послужил штамм №749, имеющий отрицательную реакцию на ферментацию ксилозы, в то время как остальные штаммы имели положительную реакцию.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
При проведении дифференциации штаммов Mannheimia haemolytica от Pasteurella multocida были подтверждены научные данные о биохимических особенностях данных культур. Так, все четыре штамма Mannheimia haemolytica, исследуемых в опыте, имеют отрицательную реакцию в тестах на индол, сорбитол, орнитиндекарбоксилазу и положительную реакцию в тестах на ферментацию мальтозы и гидролиз ОМРО(о-пКгорИепу1-р, й-да1ас^1Ье), в то время как для культур Pasteurella multocida значение данных тестов оказались абсолютно противоположны.
Дифференциация изолятов Mannheimia haemolytica от Bibersteinia trehalosi возможна при воспроизведении всего двух тестов - ферментации арабинозы и ферментации трегалозы ввиду их изначальной классификации на различные биотипы. Дополнительными тестами также могут послужить положительная ферментация ксилозы и лактозы, свойственная Mannheimia haemolytica и способность большинства штаммов Bibersteinia trehalosi к гидролизу эскулина и разжижению желатины. Тем не менее, вариабельность результатов некоторых из этих тестов затрудняет проведение окончательной идентификации.
Mannheimia haemolytica имеет перемежающуюся способность к ферментации лактозы. При этом стоит обратить внимание на то, что процесс ферментации имеет замедленный механизм, в связи с чем период культивирования вынужденно должен быть увеличен до 48 часов. Штаммы бактерий вида Bibersteinia trehalosi способны к проявлению как положительной, так и отрицательной возможности гидролиза эскулина и желатины.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение биологических свойств культур коллекционных штаммов семейства Pasteurellaceae подтверждают высокую степень однородности биохимических качеств у ряда бактерий данной группы, что осложняет идентификацию и дифференциацию возбудителя.
Основными возбудителями от которых необходимо производить дифференциацию Mannheimia haemolytica стоит считать Pasteurella multocida ввиду наибольшей распространенности данного вида и Bibersteinia trehalosi ввиду наибольшей фенотипической схожести. Pasteurella multocida в отличие от Mannheimia haemolytica имеет положительную реакцию в тестах на индол, сорбитол, орнитиндекарбоксилазу и отрицательную реакцию в тестах на ферментацию лактозы и гидролиз ОЫРО. Данные тесты стоит рассматривать как приоритетные при проведении лабораторной диагностики на выявление возбудителя пастереллеза.
Дифференциация Mannheimia haemolytica от Bibersteinia trehalosi основывается на воспроизведении комплекса тестов, основными из которых стоит считать положительную реакцию на ферментацию арабинозы для Mannheimia haemolytica и положительную реакцию на ферментацию трегалозы для Bibersteinia trehalosi.
В качестве дополнительных тестов можно рекомендовать тест на ферментацию ксилозы и лактозы, которые для МаппИе1т1а Иаето1уйса чаще всего имеют положительное значение, и гидролиз эскулина и разжижение желатины, при воспроизведении которых данные изоляты имеют отрицательную реакцию. Примечательным является факт вариабельности значений данных тестов, что
осложняет процесс интерпретации. Для Mannheimia haemolytica ферментации лактозы
может иметь и положительное и отрицательное значение, как, впрочем, и для
Bibersteinia trehalosi значение тестов на гидролиз эскулина и разжижение желатины.
Это, в свою очередь, обуславливает необходимость в комплексной идентификации по
ферментативным свойствам.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Aalbaek B., Falsen E., Olsen J.E., Bisgaard M. Relationships among strains classified with the ruminant Pasteurella haemolytica-complex using quantitative evaluation of phenotypic data. Zentralblatt fu" r Bakteriologie 285: 459-479 1997b.
2. Angen, Q., Ahrens, P., Bisgaard, M. Phenotypic and genotypic characterization of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica-like strains isolated from diseased animals in Denmark. Vet. Microbiol., 2002; 84: 103-114.
3. Bisgaard, M., Mutters R. 1986. Re-investigations of selected bovine and ovine strains previously classified as Pasteurella haemolytica and description of some new taxa within the Pasteurella haemolytica-complex. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica B 94: 185-193.
4. Caugant D. A., Olsen J. E., Bisgaard M. Genotypic relationships among strains classified under the (Pasteurella) haemolytica-complex as indicated by ribotyping and multilocus enzyme electrophoresis. Zentralblatt fur Bakteriologie 286: 333-354. 1997.
5. Highlander S. K. at al. Inactivation of Pasteurella (Mannheimia) haemolytica leukotoxin causes partial attenuation of virulence in a calf challenge model. Infection and Immunity 68: 3916-3922 2002.
6. Holt, J.G., Kreig, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T.: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Hensley W.R. Eds., Facultatively Anaerobic Gram-Negative Rods. Williams and Wilkins, Baltimore, 1994; 196, 282.
7. Houghton S.B., Mutters R., Stenzel A. Reclassification of German, British and Dutch isolates of so-called Pasteurella multocida obtained from pneumonic calf lungs. Veterinary Microbiology 26: 115-124 1991.
8. Kapustin A.V., Laishevtcev A.I. Pasteurellosis of cattle caused by Mannheimia Haemolytica. Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. Т. 52. № 4. С. 3-1.
9. Koneman, E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C., Winn, W.C.Jr.: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology (fifth edition). Andrew Allen Eds., Miscellaneous Fastidious Gram-Negative Bacilli. Lippincott-Raven, Philadelphia, 1997; 1307, 1371.
10. Kovaleva E.N. Ecosystems monitoring with purpose for phage detection of pathogen microorganisms as part of agricultural foresight // Advances in Environmental Biology. 2016. Т. 10. № 3. С. 1-3.
11. Lenev S.V. Improvement of allocation and identification of Salmonella Enterica bacteria of Arizonae subspecies.//Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. Т. 50. № 2. С. 14-23.
12. Pimenov N.V. The identification of salmonella infection in hatching eggs and products of turkey-keeping.// Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2015. Т. 46. № 10. С. 9-17.
13. Rivera M, Hunter GC, Brooker J, O'Berg CW, Smythe SH, Bernhard VM (1994) Aortic graft infection due to Pasteurella haemolytica and group C beta-hemolytic streptococcus. Clin Infect Dis 19:941-3.
14. Smith G.R. (1959): Isolation of two types of Pasteurella haemolytica from sheep. Nature (London) 183, 1132-1133
15. Tatum F. M. at al. Construction of an isogenic leukotoxin deletion mutant of Pasteurella haemolytica serotype 1: Characterization and virulence. Microbial Pathogenesis 24: 3746 1998.
16. Watanabe T, Sato M, Abe T, Oda Y (1998) Bacterial croup caused by Pasteurella haemolytica. Acta Paediatr Jpn 40: 360-361.
17. Zurlo J (2009) Pasteurella Species. In Mandell G, Bennett J, Dolin R, editors. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 6 ed. London: Churchill Livingstone. 2687-2690
18. Дельцов А.А., Пименов Н.В. Современное состояние фармацевтического рынка лекарственных средств для молодняка животных./ Научные исследования молодых ученых - сельскому хозяйству России: Труды Всероссийского совета молодых ученых и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений. - М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2014. - С. 51-53
19. Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Пименов Н.В. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных: Учебник для вузов. - М.: КолосС, 2005. - 296 с.
20. Пименов Н.В., Крупальник В.Л. Лечение молодняка сельскохозяйственных животных при респираторных болезнях инфекционной этиологии: Учебное пособие. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2010. - 47 с.
21. Пименов Н.В., Крупальник В.Л., Тухфатова Р.Ф. Средства и методы лечения молодняка сельскохозяйственных животных при желудочно-кишечных и респираторных болезнях смешанной этиологии. Учебное пособие. - М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. - 2014. - 168 с.
