CC BY
82
фаскаплизин - перспективное вещество для создания новых способов лечения глиАльных опухолей головного мозга
И.С. Брюховецкий 12, М.Е. Жидков 1, И.В. Кудрявцев 1, А.В. Полевщиков 1, П.В. Мищенко 12, Е.В. Милькина 12, А.С. Брюховецкий 1, С.В. Зайцев 1, И.А. Ляхова 1, В.В. Вихарева 1, Ю.С. Хотимченко 12
1 Школа биомедицины Дальневосточного федерального университета РАН, Владивосток, Россия
2 Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток, Россия
Fascaplysinis a promising agent for the creation of new treatments' methods of glial brain tumors
I.S. Bryukhovetskiy12, ME. Zhidkov1,1.V. Kudryavtsev1, A.V. Polevshikov1, P.V. Mishchenko 12, E.V. Milkina 12, A.S. Bryukhovetskiy1, S.V. Zaitsev1, IA. Lyahova 1, V.V. Vikhareva 1, Yu.S. Khotimchenko 1■2
1 School of Biomedicine, Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia
2 A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch of the RAS, Vladivostok, Russia
Эффективность лечения глиальных опухолей головного мозга остается крайне низкой. Стандартные методы лечения не обеспечивают радикального удаления опухолевых клеток, инфильтрирующих ткани мозга. Одним из путей решения этой проблемы является поиск новых соединений, обладающих высокой противоопухолевой активностью, и разработка методов их адресной доставки. Наше внимание привлекла группа соединений, в основе которых лежит пентациклическая система пиридо[1,2-а:3,4-Ь'] ди-индола. Наиболее известный ее представитель — красный пигмент фаскаплизин — был впервые выделен из морской губки Fascaplysynopsis sp. Цель работы: изучить особенности и механизмы цитотоксического и цитостатического действия фаскаплизина на клетки глиомы С6 in vitro, сопоставить эффективность фаскаплизина и темозоломида in vitro и в условиях адресной доставки в опухоль in vivo у экспериментальных животных (крыс). В работе использованы метод культуры клеток, система глубокого оптического имиджинга биоматериалов, проточная цитофлуориметрия, моделирование глиобластомы in vivo, фармакологическое тестирование, магнитно-резонансная томография. Показано, что фаскаплизин индуцирует апоптоз в клетках глиомы С6, и цитотоксическое действие 2 мкМ фаскаплизина превосходит цитотоксическое действие 2 мкМ темозоло-мида. При концентрации фаскаплизина меньше 0,5 мкМ наблюдается уменьшение его цитотоксического действия, а формируемый цитостатический эффект возрастает с увеличением времени экспозиции. Адресная доставка фаскаплизина в опухолевый очаг с использованием транспортных возможностей стволовых клеток способствует увеличению продолжительности жизни крыс и уменьшению размера опухоли.
Ключевые слова: мультиформная глиобластома, гли-альные опухоли, фаскаплизин, стволовые клетки, адресная доставка, циклин-зависимые киназы, апоптоз.
The effectiveness of glial brain tumors treatment remains low. Standard treatments do not provide a radical removal of tumor cells infiltrating the brain substance. One solution to this problem is to find new compounds with high anti-tumor activity and the methods' development of targeted delivery. Our attention was drawn to a group of compounds, which are based on pentacyclic system of pyrido[1,2-a: 3,4-b'] diindols. The most famous representative is fascaplysin. It is the first substance isolated from a marine sponge Fascaplysynopsis sp. The objective was to explore the characteristics and mechanisms of the cytotoxic and cytostatic effect of fascaplysin on C6 glioma cells in vitro, and to compare the effectiveness fascaplysin and temozolomide in vitro and in a targeted delivery to the tumor in vivo. We used techniques: mammalian cell cultures, high-performance robotic quantitative microscopy, confocal laser fluorescence microscopy, flow cytometry, modeling of glioblastoma in vivo, pharmacological testing, magnetic resonance imaging. It is shown that fascaplysin induces apoptosis in C6 glioma cells. At a concentration of 2 uMfascaplysin was more effective than the temozolomide. Decrease of concentration below 0.5 uM resulted to reduction of cytotoxic effects. The severity of cytostatic effect increased with increasing exposure time. Targeted delivery the fascaplysin to the tumor using transport capacity of stem cells increased the lifespan of rats and decrease in tumor size.
Keywords: fascaplysin, glioblastomamultiforme, glial tumors, stem cells, targeted delivery, cyclin-dependent kinases, apoptosis.
введение
Несмотря на все достижения медицинской науки, эффективность лечения глиальных опухолей головного мозга остается низкой. При условии выполнения всех стандартных протоколов комплексного лечения только 10% больных с одной из самых распространенных глиом — мультиформной глио-бластомой (МГБ) — живут более 2 лет с момента установления диагноза [1]. Хирургическая операция и лучевая терапия, рекомендованные большинству больных глиобластомой [2], не обеспечивают полного удаления опухолевых клеток, инфильтрирующих ткань мозга, что служит причиной рецидива. Химиотерапия может продлить безрецидивный период,
e-mail: [email protected]
однако классические цитостатики, как и современные противоопухолевые препараты, помимо высокой токсичности, недостаточно эффективны против опухолевых клеток, находящихся в состоянии про-лиферативного покоя [3]. Попытки решения этой проблемы лекарственными препаратами, синхронизирующими клеточный цикл [1], пока не увенчались успехом, поэтому разработка новых методов и технологий терапии глиальных опухолей является актуальной.
Как известно, клетки в фазе могут вступить в митоз при воздействии на них факторов роста, приводящих к транскрипции генов циклинов и циклин-за-висимых киназ (СРЮ. Помимо регуляции клеточного
58
оригинальные исследования
цикла эта сигнальная ось обеспечивает энергетический гомеостаз [4], что делает ее перспективной мишенью для противоопухолевой таргетной терапии. Мы предположили, что для эффективного уничтожения опухолевых клеток в фазе стимулирующее влияние на них должно сочетаться с одновременным воздействием на систему СйК [5].
Активирующее воздействие на клетки глиобла-стомы, находящиеся в состоянии пролиферативного покоя, способны оказать постнатальные стволовые клетки (СК) больного. Миграция в неопластический очаг — фундаментальное свойство СК [6]. Клетки этого типа самостоятельно мигрируют в опухоль по градиенту концентрации хемокинов, выделяемых поврежденными тканями, и значительный вклад в подачу сигнала, индуцирующего процессы миграции и хоуминга СК, вносят сами опухолевые клетки [7], для которых способность привлекать тканеспецифи-ческие СК обратно пропорциональна степени диф-ференцировки.
Продукция СК различных нейротрофических факторов является одним из ведущих механизмов ре-паративного действия при травмах и сосудистых поражениях мозга [8]. Эти факторы играют ключевую роль в обеспечении межклеточных взаимодействий в пределах ниши СК [9]. Помимо клеточного микроокружения, уровень продукции СК мозгового нейро-трофического фактора (ВйЫР) [10]), фактора роста эндотелия кровеносных сосудов (УБЭР) [11]) и ряда других лигандов непосредственно в зоне повреждения напрямую зависит от сигналов патологически измененного внеклеточного матрикса. Указанные обстоятельства требуют создания линий СК, стабильно экспрессирующих нужные белки независимо от внешних влияний. В 2013 г. Б. Уатапака [12], показал возможность создания таких клеточных линий без прямого вмешательства в геном, что открыло широкие перспективы для их применения в медицине.
Теоретически, мигрируя в мозг больного гли-областомой, СК способны при взаимодействии с опухолевыми клетками в фазе запустить в них процесс митоза. В свою очередь создание высоких локальных концентраций химиотерапевтического агента с использованием транспортного потенциала СК приведет к повреждению репродуктивных систем и гибели опухолевых клеток. Адресная доставка позволяет существенно снизить токсичность химиотерапии и повысить эффективность лечения, но данный метод пока слабо востребован онкологией, что отчасти связано с ограниченностью набора веществ, обладающих нужным спектром возможностей. В этой связи, наше внимание привлекла группа соединений, в основе которых лежит пентациклическая система пиридо[1,2-а:3,4-Ь']дииндола, известная как фаскаплизиновые алкалоиды.
Самым известным представителем этой группы является фаскаплизин — красный пигмент, выделенный в 1988 г. из морской губки Гввсвр!увупорв1в вр, обитающей в водах Тихого океана. Среди механизмов противоопухолевого действия фаскаплизина описано подавление процесса образования активных комплексов СйК 4 и 6 с циклином й1, специфически регулирующих переход □1/Б-фазы в клеточном цикле [13]. Комплексы циклин й1/СйК4 или циклин й1/СйК6 активируют белок ретинобластомы (ПЬ) и способствуют переходу клеток из фазы в Б-фазу [14]. Блокируя фосфорилирование белка ПЬ, фа-скаплизин вызывает блокировку клеточного цикла
в фазе G1 и запуск апоптоза [15]. Эффекты фа-скаплизина показаны на модели ряда карцином [13—15], однако, как средство потенциально применимое для терапии глиобластомы, он не рассматривался. ^оме того, в литературе отсутствуют сведения о воздействии фаскаплизина непосредственно на CK, что имеет существенное значение в контексте исследования.
На сегодняшний день «золотым стандартом» химиотерапии глиальных опухолей мозга является те-мозоломид — препарат алкилирующего действия с сильным цитотоксическим эффектом [S, 3]. Однако сочетание стандартной химиотерапии и адресной доставки новых лекарственных веществ может стать важным шагом в направлении создания новых, более эффективных способов лечения глиальных опухолей.
Цель работы: оценка особенностей и механизмов цитотоксического и цитостатического действия фаскаплизина на клетки глиомы C6 in vitro, возможности его адресной доставки в опухоль in vivo с использованием гемопоэтических стволовых клеток (TCK) у экспериментальных животных (крыс), сопоставление эффективности фаскаплизина и те-мозоломида in vitro и in vivo.
Материал и методы
Глиома линии С6
В работе использована культура клеток крысиной глиомы C6 (ATCC® CCL-1 □, CIIA), которым дана иммуноцитохимическая характеристика до начала экспериментов. НСлетки культивировали в среде DMEM, содержащей Ю% FBS и 1% антибиотика-антимикотика (Gibco, CIA). После образования кон-флюентного монослоя клетки снимали с помощью ферментативной диссоциации (^,Э5% trypsin-EDTA, Thermo Fisher Scientific, CIA, 37°C, Ю мин.), центрифугировали g, 3 мин.) и переносили в свежую среду, кратность пересева 1:Э. Эксперименты проводили на культуре клеток глиомы 3—5 пассажей.
Иммуноцитохимическое исследование глиомы С6
НСлетки фиксировали в 4% растворе парафор-мальдегида (Э^ мин., 4°C), отмывали 3 раза по Ю мин. в рабочем растворе Ш,1 M PBS, pH 7,4 + □ ,г% tween + аго/о triton-Х 1Ш + □,3% бычий сывороточный альбумин), и проводили блокирование мест неспецифического связывания антител (□,1 М PBS, pH 7,4 + 3% бычий сывороточный альбумин, 3^ мин., при комнатной температуре). Окрашивали по схеме: первичные антитела (13 ч., 4°C) — трехкратная отмывка в рабочем растворе — вторичные антитела të ч., 37°C; Novex, CIA) - окраска DAPI (Molecular Probes, CIA, D13œ) (7 мин., SS^) -двукратная отмывка в рабочем растворе — заключение препаратов в Mowiol (Sigma-Aldrich, CIA). Характеристика антител дана в табл. 1.
В работе использованы видоспецифические вторичные антитела, конъюгированные с Alexa488 (anti-mouse, 1:5ВД, Thermo Fisher Scientific, CIA, A11 □59) и с Alexa633 (anti-rabbit, 1:5Ш, Thermo Fisher Scientific, CIA, A21071), ядра контрастировали DAPI (Molecular Probes, CIA, D13^6). ^нтроль специфичности окрашивания проводили на препаратах без первичных антител. ^личественное исследование выполнено на проточном цитофлуориметре (ЦФМ) BD Accuri™ C6 (BD Biosciences, CIA).
Тестируемые вещества: Фаскаплизин, темозоло-мид (Тетос1а1®, 8Иеппд-Р1оидЫ_аЬо Ы.У., Бельгия), дексаметазон (йехаэоп®, □Д1ЕМ!КД а.С., Сербия). Фаскаплизин(12,13-й1Ь|уСго-13-охорупСо[1,2-а:
таблица 1. Характеристика использованных антител
3,4-b'] diindol-5-ium chloride) был получен по методу М.Е. Жидкова (2013) [15]. Основные спектральные характеристики (ЯМР 1Н, ЯМР 13С) продукта идентичны природному фаскаплизину.
Антитело Вид
Моно/поли клональные
Производитель Разведение
Значение
P53
Нестин
CD133
GFAP
tubulin-ß-II
S100
Ms
Rb
Rb
Rb Ms Rb
Моноклональные Novex; AHO0152
Поликлональные
Sigma-Aldrich; 5413
1:100
1:100
Поликлональные Abcam; ab19898 1:100
Поликлональные Моноклональные Поликлональные
Abcam; 7260 Abcam; 7751 Abcam; 868
50 100 100
«Страж генома», экспрессируется в клетках, устойчивых к ординарным сигналам апоптоза
Маркер стволовых клеток
Маркер нейральных и опухолевых стволовых клеток
Маркер клеток астроглии
Маркер клеток нейронального ряда
Маркер клеток нейрального происхождения
Дизайн исследования
Эксперимент состоял из трех этапов. На первом этапе оценивали особенности и механизмы цито-токсического и цитостатического действия фаска-плизина на клетки глиомы С6. Клетки глиомы С6 в количестве 3х104 культивировали в течение 120 ч. в 24 луночных планшетах, в ростовой среде ДМЕМ с добавлением различных концентраций фаскапли-зина (0,005; 0,05; 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мкМ). Точки мониторинга (окраска на апоптоз) 6, 24, 48, 72, 120 ч., 20 повторов для каждой точки.
Для оценки наблюдаемых явлений применяли микроскопию системы глубокого оптического имиджинга биоматериалов FluoView FV 1200MPE (Olympus, Япония) и проточную цитофлуориметрию (BD Accuri® C6).
Общее количество клеток в апоптозе определяли по окраске методом TUNEL (Click-iT® TUNEL AlexaFluor® 488 ImagingAssay, formicroscopy & HCS, C10245, США), количество клеток на разных стадиях апоптоза — методом двойного окрашивания YO-PRO-1 (Invitrogen, США) и йодистым пропидием (PI, Sigma-Aldrich, США) [16]. Лигандами красителей являются нуклеиновые кислоты в цитоплазме клеток. YO-PRO-1 проникает внутрь клетки с помощью P2X7 лиганд-зависимых ионных каналов, которые не активны в интактных клетках. Активация происходит при запуске апоптоза и по времени совпадает с нарушением асимметрии липидного состава поверхностной мембраны, что позволяет рассматривать накопление YO-PRO-1 в качестве маркера «ранних» стадий апоптоза [17].
Для выявления поздних стадий апоптоза, а не только констатации факта его запуска, клетки дополнительно окрашивали PI, который не имеет интегрированных в мембрану специфических переносчиков и может проникать в цитоплазму и ядро только через поврежденные мембраны, что имеет место на финальных стадиях апоптоза при формировании апоптотических телец или при некрозе клеток. Ин-тактные клетки не окрашиваются этими красителями. Клетки, вступившие в апоптоз, позитивны только по YO-PRO-1, тогда как клетки, находящиеся на более поздних стадиях апоптоза, эффективно окра-
шиваются обоими красителями [16]. Окрашивание клеток проводили в пробирках для цитометрического учета 12x75 мм (Beckman Coulter, США). К 100 мкл клеточной суспензии (1x106 кл/мл) добавляли 5 мкл раствора YO-PRO-1 (конечная концентрация красителя — 250 нМ), затем вносили 10 мкл раствора PI (конечная концентрация красителя —1 мкг/мл). Образцы выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин. в защищенном от света месте. После инкубации к образцам добавляли 100 мкл PBS и анализировали на проточном цитофлуориме-тре BD Accuri™ C6.
При изучении влияния фаскаплизина на фазы клеточного цикла клеток линии С6 (цитостатический эффект фаскаплизина) in vitro применяли двойное окрашивание клеток PI и DAPI. Связывание PI с ДНК строго пропорционально ее количеству в ядре клетки, поэтому на гистограммах, полученных с проточного цитофлуориметра, можно выделить специфичные области, соответствующие различным стадиям клеточного цикла [16, 17]. Поскольку покоящиеся клетки (фаза G0) и клетки, в фазе G1 клеточного цикла, содержат равное количество ДНК (2с), соответствующее диплоидному набору хромосом, то на гистограмме они будут находиться в составе одного диплоидного (G0/G1) пика. В S-фазе клеточного цикла содержание ДНК постепенно возрастает с 2с до 4с, что сопровождается увеличением связывания красителя и усилением интенсивности флуоресценции окрашенных клеток. В фазе G2 и во время митоза содержание ДНК и количество хромосом удваиваются (2n4c), в результате интенсивность флуоресценции клеток в фазе G2/M клеточного цикла будет ровно в два раза превосходить таковую для клеток, имеющих количество ДНК, равное 2с (G0/G1). В том случае, если пик G0/G1 находится в районе 200-го канала линейной шкалы, то пик G^/M будет располагаться в районе 400-го канала. Что касается клеток, вступивших в апоптоз, то они будут располагаться левее пика G0/G1, так как имеют неполное или гиподиплоидное количество ДНК (менее 2с).
Для окраски клеток PI клеточный осадок ресу-спендировали в 100 мкл забуференного физио-
в0
оригинальные исследования
логического раствора (ЗФР), добавляли 900 мкл 70% этанола, инкубировали 1 ч. при 20°С, переносили в пробирки для проведения цитометрических исследований и однократно отмывали избытком ЗФР (300 g, 8 мин.). Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл свежего ЗФР.
Дополнительно, для окраски ДНК использовали раствор DAPI (№ 422801, BioLegend Inc., США) в конечной концентрации 10 мкг/мл, время инкуба-ции15—20 мин. при комнатной температуре в темноте. По завершении инкубации к образцам добавляли 200 мкл ЗФР и анализировали на проточном цитофлуориметре Navios™ (Beckman Coulter, США). Для каждого из образцов анализировали не менее 10000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от агрегатов и в последующем удалить агрегаты из зоны анализа, использовали сочетания пикового и интегрального сигналов флуоресценции DAPI. Результаты получали в виде распределения клеток по фазам G0/G1, S и G^/M, выраженного в процентах от общего числа проанализированных клеток. Анализ данных ЦФМ осуществляли с помощью програмного обеспечения Kaluza™ Software, 10 User Network Pack (Full Version) и ModFit TL (Verity Software House, США).
На втором этапе определяли воздействие разных концентраций фаскаплизина (0,5; 0,05 и 0,005 мкМ) на ГСК in vitro методом двойного окрашивания диацетатфлуоресцеином (FDA, Thermo Fisher Scientific, США) и PI. Методология исследования аналогична той, которая описана для первого этапа. Одно из следствий запуска апоптоза в клетке — снижение активности внутриклеточных ферментов, в первую очередь, внутриклеточных эстераз — ферментов класса гидролаз, отвечающих за гидролитическое расщепление сложных эфиров на спирты и кислоты при участии молекул воды. Краситель FDA, являясь эфиром, может не только подвергаться действию эстераз, но и, проявляя липофильные свойства, спонтанно проникать в клетки из среды. Потеря гидроксильных групп после взаимодействия с ферментами сопровождается как накоплением красителя в клетке, так и способствует появлению флюоресценции в ответ на облучение. Живые клетки обладают яркой флуоресценцией, тогда как в погибающих клетках флуоресценция красителя существенно снижена. Дополнительная окраска этих клеток PI [18] позволяет отличить ранние стадии апоптоза от поздних. Окраску клеток и все технические манипуляции осуществляли по схеме, аналогичной исследованию влияния фаскаплизина на клетки линии С6.
На третьем этапе проводили сопоставление цитотоксической эффективности фаскаплизина и темозоломида in vitro с помощью системы Cell-IQ (CM Technologies, США) в полностью автоматизированном режиме и in vivo с применением иммуно-липосомальных биологических конструкций, конъ-югированных с CD34+-TCK, методом выявления флуоресцирующих объектов в опухолевом очаге: конфокальная микроскопия криосрезов, (микроскоп FluoView FV 1200 MPE, Olympus, Япония).
Клетки глиомы в количестве 5х103 культивировали в 96-луночных планшетах в ростовой среде ДМЕМ, содержащей 2 мкМ фаскаплизина или 2 мкМ темозоломида (96 ч., 37°С, 5% СО2), мониторинг проводили в режиме реального времени,
результаты сравнивали с контролем (клетки глиомы C6 в ростовой среде без добавок) и данными, полученными при культивировании клеток глиомы C6 в присутствии 2 мкМ дексаметазона. Препарат дек-саметазон включен в современный стандарт лечения МГБ для борьбы с отеком мозга. Изучение противоопухолевой активности дексаметазона in vitro необходимо для более корректной интерпретации результатов исследования in vivo, где он применялся для подавления реакции отторжения трансплантанта.
Эксперимент in vivo
Работа выполнена на 90 крысах породы Вистар, массой 200—220 г. Удержание и уход за животными осуществлялся в соответствии с требованиями GLP и «Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным». Работа одобрена Жомиссией по биомедицинской этике» Иколы биомедицины ДВФУ (протокол № 1 от 15.02.2015).
Моделирование глиобластомы in vivo и нейрови-зуализационное исследование. Выполнялась вну-тримозговая имплантация 0,2х10в клеток крысиной глиомы C6 с использованием стереотаксической установки Harvard Apparatus (LabStandard™, Япония). Операцию проводили в условиях общей анестезии по методике, описанной K. Эбоди (2013) [19]. Динамику развития опухоли изучали с помощью МРТ на томографе Biospec (Bruker, CIA). Для усиления изображения экпериментальным животным внутривенно вводили стандартный раствор Магневиста (0,2 мл/кг, Bayer Pharma, Германия). Объем опухоли определяли по формуле:
V = 4\3п abc,
где a, b, c - полуоси эллипсоида.
Клеточный препарат для адресной доставки фа-скаплизина в неопластический очаг. В работе использован клеточный продукт ATCC® PCS-800-012™, представляющий собой первичную культуру TCK костного мозга человека, в котором содержание CD34+-клеток составляет 90%. Cертификаты и другая документация по этому продукту представлена на сайте компании-производителя [19]. Издание иммунолипосомальных биологических конструкций, конъюгированных с CD34+-CK (клеточный препарат, препарат TCK), выполнено AНО «Национальный институт регенеративной медицины», согласно патенту № 233в901 от 2008 г. [20]. Липосомы, содержащие □,5 мкМ раствор фаскаплизина, конъ-югировали с TCK, окрашенными витальным красителем Vybrant® CFDA SE (V12883, Molecular Probes, CIA; X = 488 nm; 25 мкМ в PBS, 25 мин., 37°C) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Изучение противоопухолевой эффективности адресной доставки фаскаплизина. Экспериментальные животные были разделены на три группы: группа 1 — контроль (n х 30), крысы с глиобластомой, не получавшие лечебные препараты; группа 2 (n = 30) — группа «фаскаплизин»: с 7 по 10 сут. после имплантации опухолевых клеток крысы получали 0,1 мг/сут. дексаметазона внутримышечно; клеточный препарат в количестве 3х105 в 0,3 мл апирогенного физраствора вводили троекратно с интервалом 24 ч. в центральную хвостовую вену, начиная с 10 сут. после имплантации опухолевых клеток при наличии опухоли на МР-томограммах; группа 3 (n = 30) — группа «темозоломид», крысы получали перорально темо-
золомид в дозе 50 мг/кг массы тела с 10 по 12 сут. после имплантации. Животных выводили из эксперимента в случае тяжелых нарушений неврологического статуса, характерных для последней стадии развития глиомы.
Статистическая обработка
Данные подвергали обработке, используя дисперсионный анализ ДЫОУД, сравнение разностей средних проводили по методу Тьюки. Данные выражали в виде средних значений ± стандартное отклонение (М±э.е.т), различия считались достоверными при р<0,05. Все статистические тесты выполнены с использованием пакета □гарИРаСРпэт 4.00.
результаты
По данным проточной цитофлуориметрии клетки глиомы линии С6 окрашивались антителами к нести-ну (87,6±12,1%), белку р53 (82,3±9,8%), СР133 (33,7±4,8%), Б100 (7,4±4,3%), ЭРДР (7,2±2,2%) и рШ-тубулину (9,3±4,4%). Иммуноцитохимическая характеристика клеток линии С6 представлена на рис.1.
Особенности и механизмы цитотоксического и цитостатического действия фаскаплизина на клетки глиомы С6 in vitro
Окраска клеток по методу TUNEL уже через 3 ч. во всех культурах, содержащих фаскаплизин, выявляла множество флуоресцирующих «апоптотических» телец, что говорит об олигонуклеосомной деградации ДНК и служит достоверным признаком апоптоза. В диапазоне концентраций 1—2 мкМ фаскаплизин оказывал четкое цитотоксическое действие на клетки глиомы С6 (рис. 2). При концентрации фаскаплизина 2 мкМ, этот эффект был максимальным, о чем свидетельствовало наименьшее число живых клеток через 72 ч. При снижении концентрации фаскаплизина до 0,5 мкМ половина популяции клеток линии С6 погибали через 72 ч. Дальнейшее понижение его концентрации до 0,05 и 0,005 мкМ оказывало не только цитотоксическое действие, но и цитостатиче-ское через 48 ч. При экспозиции клеток глиомы С6 в среде, содержащей 0,05 и 0,005 мкМ фаскаплизина, количество погибших клеток через 120 ч. было больше, чем через 72 ч., что доказывает зависимость цитотоксического эффекта не только от дозы, но и от времени экспозиции (рис. 3).
Рис. 1.
Клетки линии С6, экспрессия: А — нестина; Б - р53; В - СР133; Г - ЬиЬиНп-р!!!, Д - Б100; Е - ОБДР;
Ж, З - контроли - окрашивание вторичными антителами (Ж - Д1еха488, З - Д1еха633). Иммунофлуоресцентная микроскопия. Окраска специфическими антителами, докраска ядер РДР!
Рис. 2. Количество клеток (M±m.s.e.) глиомы линии С6 через 72 ч. культивирования в присутствии фаскаплизина в различных концентрациях.
* различия с контрольной группой статистически значимы (р<0,01).
Рис. 3. Количество живых клеток (M±m.s.e.) глиомы линии С6 при культивировании в присутствии 0,05 и 0,005 мкМ фаскаплизина в течение 72 и 120 ч.
* различия с контрольной группой статистически значимы (р<0,01)
Поскольку концентрация фаскаплизина 0,5 мкМ вызывала гибель более половины популяции клеток глиомы С6 за 72 ч., было решено использовать данную концентрацию в качестве точки отсчета при проведении ЦФМ исследования. Результаты ЦФМ с применением красителей У0-РП0-1 и Р1 показали, что фаскаплизин в концентрации 0,5 мкМ вызывает апоптоз клеток глиомы С6 (рис. 4А—В). Спустя 12 ч. количество опухолевых клеток с ранними признаками апоптоза, интенсивно окрашенных УО-РПО, было максимальным в культурах, содержащих 0,5 мкМ фаскаплизина. Число живых клеток глиомы, расположенных в области «V», при концентрации фаскаплизина 0,5 мкМ (рис. 4Б) было меньше, чем в культуре, содержащей 0,05 мкМ этого вещества (рис. 4В), что говорит о зависимости цитотоксиче-ского эффекта от дозы препарата. Однако результаты ЦФМ на более поздних сроках эксперимента (72 ч.) показали, что эффект фаскаплизина в большей степени зависит от времени экспозиции (табл. 2).
Фаскаплизин влиял и на жизненный цикл клеток глиомы С6 (рис. 5). По данным ЦФМ с увеличением концентрации фаскаплизина в питательной среде уменьшалось число клеток в фазе G0/G1, и данный процесс коррелировал со временем экспозиции (рис. 5А). Было зафиксировано уменьшение числа клеток в фазе G1 и увеличение их количества в S фазе (рис. 5Б), однако количество опухолевых клеток, вошедших в митоз, существенно не менялось (рис. 5В). Детальный количественный анализ клеток глиомы С6 при инкубации в среде, содержащей 0,5 мкМ фаскаплизин, показал достоверное уменьшение числа клеток в фазе G0/G1 (рис. 6А—Г) и рост количества клеток в S фазе. Нужно отметить, что этот процесс не сопровождался увеличением количества клеток в Gg/M фазе. Подобные данные свидетельствуют о первичном цитостатическом эффекте фаскаплизина за счет накопления клеток в S-фазе и блокаде митоза, что впоследствии сопровождается запуском механизмов клеточной гибели.
А
Б
В
Рис. 4. Уровень апоптоза клеток глиомы линии С6, культивированных в присутствии фаскаплизина 0,5 и 0,05 мкМ: А — интактные клетки глиомы С6 (контроль);
Б, В — клетки глиомы С6, инкубированные в среде с фаскаплизином 0,5 и 0,05 мкМ, соответственно. Проточная цитофлуориметрия, окраска YO-PRO-1 и PI. Область «V» — популяция не окрашенных живых клеток; область «Ap» — клетки, окрашенные YO-PRO-1, ранние стадии апоптоза; область «Ap/N» — погибшие клетки, позитивно окрашенные обоими красителями
таблица 2. Соотношение живых и мертвых клеток в культуре глиомы линии С6 при концентрации фаскаплизина 0,5 м^. Данные цитофлуориметрии
Время, ч. Число живых клеток глиомы С6, % Число клеток глиомы С6 с признаками апоптоза, %
24 65,12±9,4 24,61±5,4
48 48,13±11,2 31,7±7,3
72 24,6±14,2 53,7±8,3
В в2/м
* р>0,05
12 24
-0,005 Время эксперимента, ч
Рис. 5. Динамика распределения клеток глиомы линии С6 по фазам клеточного цикла при культивировании в среде с различным содержанием фаскаплизина
фаскаплизин, 6 часов
фаскаплизин, 12 часов
А
вг/М; 14,74
в-фаза; 35,96
00/01; 49,30
Б
В
фаскаплизин, 24 часа
00/01; 37,86
Г
фаскаплизин, 48 часов
02/М; 17,57
Б-фаза; 44,58
00/01; 37,86
Контроль, 48 часов
Д
00/01; 54,30
Рис. 6. Динамика распределения клеток глиомы линии С6 по фазам клеточного цикла (А-Г) при культивировании в среде с 0,5 мкМ фаскаплизином в течение 48 ч.; Д - контроль
Воздействие фаскаплизина на ГСК in vitro На первом этапе эксперимента было показано, что 0,5 мкМ фаскаплизин вызывет гибель более половины популяции клеток глиомы С6 (рис. 2) в течение 72 ч., поэтому данная концентрация была выбрана, как стартовая при оценке влияния фаска-плизина на линию С034+-ГСК.
ГСК инкубировали 120 ч. в стандартных условиях в среде, содержащей 0,5; 0,05 и 0,005 мкМ фаскаплизина. Через 12 ч. по данным ЦФМ число живых ГСК, окрашенных FDA, при концентрации фаскаплизина 0,05 мкМ было существенно меньше подобного показателя в культуре, содержащей 0,005 мкМ фаскаплизина (рис. 7). Однако эффект фаскаплизи-на зависел не только от концентрации, но и от времени экспозиции: через 72 ч. признаки апоптоза выявлены у 73,1±7,6% ГСК, культивируемых в среде с 0,05 мкМ фаскаплизином (табл. 3).
Сопоставление эффективности фаскаплизина и темозоломида in vitro и в условиях адресной доставки in vivo
В ходе экспериментов, проведенных in vitro, дексаметазон проявлял некоторое цитостатическое действие, которое не имело значимых различий с контролем, 2 мкМ темозоломид оказывал четкий цитотоксический эффект в отношении клеток глио-
мы С6, а 2 мкМ фаскаплизин вызывал гибель всех клеток глиомы линии С6 (рис. 8).
Имплантация 0,2х106 клеток глиомы в головной мозг крыс приводила к формированию опухолей в течение 10 сут., после чего проводили экспериментальную терапию. На 7 сут. после введения препарата ГСК (липосомы, содержащие фаскаплизин, и конъюгированные с ГСК) в опухолевой ткани мозга крыс группы «фаскаплизин», площадь регистрации сигнала, соответствующего флуоресцентному красителю СРйД БЕ, составила 39,4±14,5%. Сопоставление результатов с данными контрольной группы (4,1 ±1%) и группы «темозоломид» (6,5±2,2») позволило избежать ложной интерпретации данных, вызванных автофлуоресценцией. К 10 сут. после внутривенного введения клеточного препарата, клетки визуализировались в кровеносных сосудах мозга крыс в непосредственной близости к опухоли (рис. 9А), концентрировались на границе опухолевого очага (рис. 9Б, В) и проникали в неопластическую ткань (рис. 9Г). К этому моменту площадь регистрации флуоресцентного сигнала, соответствующего красителю СРйД БЕ, у крыс группы «фаскаплизин» возрастала до 56,4±4%. Очевидно, введенные клетки достигали опухоли, накапливались в ней и высвобождали фаскаплизин, что сопровождалось рядом значимых эффектов.
А
Б
В
Рис. 7. Уровень апоптоза CD34+-ГСК под действием фаскаплизина в различных концентрациях: А — контроль, без фаскаплизина; Б — 0,05 мкМ фаскаплизин; В — 0,005 мкМ.
Проточная цитофлуориметрия, окраска FDA и PI. Область «V» — популяция живых ГСК, интенсивно окрашенных FDA; область «Ap» — клетки, слабо окрашенные FDA и негативные по PI, ранние стадии апоптоза; область «Ap/N» — погибшие клетки, слабо окрашенные FDA и интенсивно окрашенные PI, поздние стадии апоптоза и некроза
Таблица 3. Динамика развития апоптоза в ГСК при действии фаскаплизина
% ГСК с признаками апоптоза
Время, ч. -
0
0,005 мкМ 0,05 мкМ
1,9±1,2 1,8±1,2
2,2±1,1 14,7±4,2
7,2±4,3 19,6±5,3
16,1±7,1 26,1±8,3
39,3±6,4 43,1±7,6
46,1±7,1 66,1±8,3
54,3±6,4*/** *73,1±7,6
Количество ГСК с признаками апоптоза после воздействия фаскаплизина. Данные представлены в виде М±Б.е.т., n = 20 для каждой точки; * количество ГСК с признаками апоптоза при концентрации фаскаплизина 0,005 мкМ достоверно меньше, чем при 0,05 мкМ (p<0,05); ** различия с контролем достоверны.
1,6
О I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-т-т-т-т-1
О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57
Время, ч
—л— Дексаметазон —«Темозоломид ^^ Фаскаплизин —"—Контроль *р<0,01
Рис. 8. Сравнительная эффективность цитотоксического действия темозоломида и фаскаплизина в концентрации 2 мкМ.
* различия с контрольной группой статистически значимы (р<0,01)
Рис. 9. Ткань головного мозга крыс группы «фаскаплизин»:
А - СРОД+- клетки в полости кровеносного сосуда на стороне полушария с опухолью;
Б - СРОД+-клетки сосредоточены вдоль границ опухолевого узла, 7 сут. после введения клеточного препарата; В - СРОД+-клетки вдоль границ опухоли, 10 сут. после введения клеточного препарата; Г - СРОД+-клетки сосредоточены в глубине опухолевого узла.
Конфокальная микроскопия (X = 488 пт). Окраска клеток СРОД БЕ, докраска ядер ОДР!
Средняя продолжительность жизни животных группы «фаскаплизин» составила 39,5±8,8 сут., что было больше подобного показателя в контроле, и практически не уступало данному показателю у крыс группы «темозоломид» (рис. 10). По данным магнитно-резонансной томографии, к 30 сут. эксперимента размер опухоли в мозге крыс группы «фаскаплизин» был достоверно меньше, чем у контрольных животных (рис. 11, 12). Крысы группы «фаскаплизин» были подвижны, проявляли горизонтальную и вертикальную активность, охотно принимали пищу, пили воду, «умывались», интересовались событиям в клетке и за ее пределами. Напротив, у животных, получавших темозоломид, отмечались судороги в мышцах, жевательные движения, не связанные с едой, облизывание задних лап вместо вертикальной активности, встряхивание и подергивание головой. Эти животные неохотно пили воду и принимали пищу, на коже выявлялись очаги алопеции, в полости рта — признаки кандидо-за, наблюдалась задержка мочи, что практически отсутствовало у животных группы «фаскаплизин».
Обсуждение
По данным иммуноцитохимии (рис. 1) более 80% клеточной популяции глиомы С6, окрашивались антителами к белку р53, что говорит о высокой резистентности этих клеток к ординарным сигналам апоптоза [21], вызванной активацией значительного числа онкогенов и подавлением генов-онкосупрес-соров [22]. 87% клеток были иммунопозитивны по отношению к нестину — белку, экспрессия которого характерна для низкодифференцированных клеток, в том числе ОСК [23, 24]. Присутствие в популяции 33,7% клеток, экспрессирующих белок Сй133 (рис. 1), также подтверждает, что в составе общего пула клеток глиомы С6 находится значительное количество клеток с иммунофенотипическими признаками ОСК [25]. Важно отметить, что иммунофенотип клеток глиомы С6, на которых проводились эксперименты, несколько отличается от «паспортных» параметров [26], что может быть связанно с предшествующим культивированием на средах с низким содержанием сыворотки [27]. Однако в контексте исследования эти особенности свидетельствуют
Рис. 10. Средняя продолжительность жизни животных разных групп (М±Б.е.т) * различия между группой «фаскаплизин» и контролем статистически значимы (р<0,05)
Рис. 12. Объем опухолевого узла (М±Б.е.т, мм3) в мозге животных разных групп, по данным МРТ, 30 сут. наблюдения.
* различия с контрольной группой статистически значимы (р<0,01)
rv '
Мл wf » >
% ч
Рис. 11.
МРТ головного мозга крысы группы «фаскаплизин»: А — опухоль в мозге крысы до введения препарата ГСК; Б — опухоль в мозге этой же-крысы через 20 сут. после введения препарата ГСК
Б
о том, что в этих клетках есть особые механизмы резистентности к цитотоксическим воздействиям.
Как показано в эксперименте in vitro, фаска-плизин характеризуется сильным цитотоксическим действием, основным механизмом которого является апоптоз (рис. 2, 3). Эффект был максимален при концентрации фаскаплизина 1—2 мкМ, а при снижение концентрации до 0,5 мкМ погибала половина популяции клеток глиомы линии С6, что позволило использовать ее в качестве отправной точки для проведения дальнейших исследований. По данным литературы ЛД50 (полулетальная доза) фаскаплизина in vitro в отношении некоторых линий мелкоклеточного рака легких [24], ряда других злокачественных опухолей [25, 26] варьирует в диапазоне 0,5—2,0 мкМ, что не противоречит нашим данным. Однако в более низких концентрациях, 0,05 и 0,005 мкМ, фаскаплизин оказывал преимущественно цитостатическое действие, и эффект зависел от дозы и времени экспозиции.
Заслуживает внимания механизм противоопухолевого действия фаскаплизина. По данным литературы этот эффект принято связывать с подавлением образования активных комплексов, циклин-зависи-мых киназ 4 и 6 с циклином D1, что в конечном итоге вызывает блокировку клеточного цикла в фазе G1 и далее запуск апоптоза [27, 28]. Анализ данных ЦФМ показал, что воздействие фаскаплизина удлиняло S-фазу клеточного цикла, препятствовало митозу, и эти процессы зависели от дозы препарата. Кроме того, под влиянием фаскаплизина сокращалось количество опухолевых клеток в фазе G0 (рис. 5 и 6). Важно отметить, что фаскаплизин вызывал апоптоз ГСК и для запуска процесса клеточной гибели нужны были существенно меньшие концентрации (рис. 7, табл. 2), что позволяет исключить возможную неопластическую трансформацию ГСК в опухоли.
In vitro дексаметазон и темозоломид уступают по цитотоксической эффективности фаскаплизину. Первый, активируя глюкокортикостероидные рецепторы в клетках глиомы, смещает баланс белков семейства Bcl-2 в пользу проапоптозных белков и уменьшает подвижность опухолевых клеток, воздействуя на сигнальный путь Akt/mTOR/RhoA [29, 30]. Второй оказывает четкий цитотоксический эффект [2, 3], однако витральная эффективность фаскапли-зина в данном эксперименте была более очевидной (рис. 8). Нужно отметить, что эффект темозоло-мида обычно оценивают in vitro на более поздних сроках инкубации (72—144 ч,) что в нашем случае не имело смысла, поскольку 2 мкМ фаскаплизин, с которым сравнивали темозолимид, вызывал гибель клеток глиомы в течение меньшего времени. Тем не менее, дальнейшее сопоставление эффективности фаскаплизина и других противоопухолевых веществ представляется весьма целесообразным.
Таким образом, полученные нами данные доказывают, что фаскаплизин является мощным индуктором апоптоза. Однако высокая токсичность [31, 32], обусловленная интеркаляционными свойствами, ограничивает его широкое использование и требует создания менее токсичных производных данного вещества. Кроме того, в литературе отсутствуют четкие данные о способности синтетического фаскаплизина к диффузии сквозь кишечную стенку, возможности преодолевать гематоэнцефаличе-ский барьер, а также по ряду других ключевых параметров его фармакодинамики и фармакокинетики
в организме животных с глиобластомой. Пробное в/в введение 0,3 мл апирогенного физиологического раствора, содержащего 2 мкМ фаскаплизина, 5 здоровым животным в наших экспериментах приводило к развитию тяжелых соматических и неврологических нарушений, что исключало его применение на используемой модели in vivo. В связи с этим было решено апробировать транспортные возможности стволовых клеток для адресной доставки фаска-плизина в опухоль.
В 2008 г. В.П. Чехонин с соавт. [20] предложили перспективный способ доставки иммунолипосомаль-ного контейнера в центральную нервную систему при опухолевом процессе. В нашем эксперименте с помощью введения в кровоток крыс с перевитой глиомой ГСК, транспортирующих иммунолипосо-мальный контейнер, содержащий 0,5 мкМ раствор фаскаплизина, клетки достигали опухоли, проникали в нее и накапливались в опухолевой ткани. Доказательством этому служит достоверное по сравнению с контролем увеличение площади регистрации флуоресцентного сигнала в группе крыс, получавших препарат ГСК, до 39,4% (рис. 9). Важно отметить, что для создания клеточного препарата на основе ГСК необходимо использовать такую концентрацию фаскаплизина, которая позволяет сохранить жизнеспособность ГСК, но в то же время будет вызывать гибель опухолевых клеток (табл. 2).
Мы не проводили количественную оценку содержания фаскаплизина в ткани опухоли, однако данные, полученные другими методами, позволяют предположить, что уменьшение объема опухоли является результатом комплексного воздействия используемой технологии: первичным эффектом трансплантированных ГСК и последующим воздействием фа-скаплизина. Это согласуется с результатами работ K. Aboody и соавт. (2013) [18], М. Ehtesham и соавт. (2002) [33], R. Frank и соавт. (2010) [34], R. Haley и соавт. (2008) [35], D. Kanojia и соавт. (2015) [36] и ряда других авторов, изучавших адресную доставку лекарств с использованием ГСК, и нашими данными, полученными ранее [37].
Анализируя результаты настоящего исследования можно утверждать, что увеличение средней продолжительности жизни, одного из главных критериев эффективности терапевтических усилий в онкологии, по-видимому, следует тоже объяснить эффектом клеточного трансплантата (трофическим, пластическим, иммуномодулирующим и др. [37]). В пользу этого свидетельствует и лучшая сохранность животных, получавших препарат ГСК, в отличие от крыс, принимавших системную химиотерапию, что имеет важное практическое значение.
В свою очередь, наблюдаемый циторедукционный эффект вероятно тоже связан с комплексным воздействием клеточного препарата и может быть обусловлен как высвобождением фаскаплизина, так и антипролиферативным влиянием ГСК на опухоль [7]. Однако допустимо предположить, что эффект фаскаплизина опосредован его влиянием на ГСК, взаимодействующими с клетками глиомы, что требует дальнейшего изучения в эксперименте. Отметим, что данный способ воздействия на опухолевые клетки представляется нам более предпочтительным и перспективным.
В этом ключе необходимо отметить, что доставка максимального количества фаскаплизина в опухолевую ткань с целью уничтожения опухоли не явля-
ется конечной целью разрабатываемой технологии, поскольку такой результат в большинстве случаев достижим с использованием хирургических технологий [1]. В данном эксперименте было обнаружено, что ГСК, транспортирующие фаскаплизин, накапливаются в опухоли и, возможно, высвобождают транспортируемое вещество одномоментно, что сопоставимо с его введением в опухоль. Однако на предыдущих этапах исследования [38], такой вариант использования индукторов апоптоза приводил к резкой гибели значительной части клеток глиомы, нейронов и глиоцитов, сопровождался резким нарастанием отека мозга, и в результате часть экспериментальных животных погибала. Последующая глиомезодермальная реакция приводила к резкому увеличению объема опухолевого узла, что также несет опасность угрожающих жизни осложнений. При этом обработка стволовых клеток нетоксическими для клеток глиомы концентрациями индукторов апоптоза существенно повышала их противоопухолевый потенциал [39].
Поскольку основной мишенью технологии являются мигрировавшие в ткань мозга опухолевые клетки, которые невозможно удалить с помощью стандартных методов, то использование индукторов апоптоза для усиления потенциала нормальных СК представляется более перспективным. Как показано в работах К. Aboody с соавт. (2013), СК способна следовать за мигририрующей в мозг опухолевой клеткой и настигать ее [18]. В этом аспекте адресную доставку можно рассматривать как способ локального «прекондиционирования» СК, потенциально повышающий противоопухолевую эффективность взаимодействия стволовых и неопластических клеток, что также требует проведения дополнительных исследований.
Результаты эксперимента позволяют выделить три ключевые точки, определяющие итоговую эффективность технологий адресной доставки лекарственных веществ с использованием ГСК: непосредственное влияние ГСК, воздействие транспортируемого вещества на опухоль и эффект от воздействия вещества на ГСК, взаимодействующими с клетками опухоли. Заслуживает особого внима-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Omuro A., DeAngeles L.M. Glioblastoma and others malignant gliomas: a clinical review. JAMA 2013; 310(17): 1842-50.
2. Коновалов А.Н., Потапов А.А., Лошаков В.А. и соавт. Стандарты, опции и рекомендации в лечении опухолей ЦНС. Ассоциация нейрохирургов. 2009.
3. Stupp R., Taillibert S., Kanner A.A. et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomidevs temozolomide alone for glioblastoma: a randomized clinical trial. JAMA 2015; 314(23): 2535-43.
4. Lee Y., Dominy J.E., Choi Y.J. et al. Cyclin D1-Cdk4 controls glucose metabolism independently of cell cycle progression. Nature 2014; 510(7506): 547-51.
5. Gayek A.S., Ohi R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One 2016; 11(6): e0157491.
6. Bryukhovetskiyl., Bryukhovetskiy A., Khotimchenko Y. et al. Novel cellular and post-genomic technologies in the treatment of glioblastoma multiforme. Oncol. Rep. 2016; 35(2): 639-48.
7. Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Толок Е.В. и др. Взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vitro. Тихоокеанский медицинский журнал 2014; 4: 31-7.
8. Bryukhovetskiy A., Shevchenko V., Kovalev S. et al. To the novel paradigm of proteome-based cell therapy of tumors: through comparative proteome mapping of tumor stem cells and tissue-specific stem cells of humans. Cell Transplant. 2014; 23 Suppl 1: 151-7.
9. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточное взаимодействие. М.: Медицина; 2003.
ния еще один важный момент. Одним из основных направлений создания биомедицинских клеточных препаратов для доставки терапевтического агента в опухоль является применение аутогенных СК, что связано с необходимостью изъятия у больного этого бесценного ресурса. В случае фаскаплизина данное обстоятельство не имеет принципиального значения, поскольку его концентрация, необходимая для уничтожения ГСК, значительно меньше, чем для запуска апоптоза, что существенно расширяет арсенал используемых СК, например, в пользу СК, полученных от близких родственников.
В данном исследовании клеточный препарат вводили внутривенно. Альтернативой этому способу может стать инкорпорирование клеточной композиции в биополимерный гель, с последующей имплантацией в область постэктомического дефекта, что сократит расстояние для адресной доставки фаскаплизина и создаст оптимальные условия для воздействия на клетки глиобластомы, инфильтрирующие паренхиму мозга. Однако, это задачи ближайшего будущего.
выводы
1. Фаскаплизин индуцирует апоптоз в клетках глиомы С6.
2. В концентрации 2 мкМ цитотоксическое действие фаскаплизина превосходит цитотоксическое действие темозоломида.
3. При концентрации ниже 0,5 мкМ наблюдается уменьшение цитотоксического действия фаскапли-зина, а формируемый цитостатический эффект возрастает с увеличением времени экспозиции.
4. Адресная доставка фаскаплизина в опухолевый очаг с использованием ГСК оказывает комплексное воздействие на опухоль: способствует уменьшению размера опухоли и увеличению продолжительности жизни крыс.
Благодарности
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (Проект14.575.21.0038; Ю RFMEF157514X0038).
10. Ahn S.Y., Chang Y.S., Sung D.K. et al. Pivotal role of brain derived neurotrophic factor secreted by mesenchymal stem cells in severe intraventricular hemorrhage in the newborn rats. Cell Transplant. 2016 Aug 16 [Epub ahead of print].
11. Chang Y.S., Ahn S.Y., Jeon H.B. et al. Critical role of vascular endothelial growth factor secreted by mesenchymal stem cells in hyperoxic lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2014; 51(3): 391-9.
12. Yamanaka S. Shinya Yamanaka: purveyor of pluripotency. Interview by Ruth Williams. Circ. Res. 2013; 112(2): 233-5.
13. Bharate S.B., Manda S., Mupparapu N. et al. Chemistry and biology of fascaplisin a potent marine derived CDK-4 inhibitor. Mini Rev. Med. Chem. 2012; 12(7): 650-64.
14. Shafiq M.I., Steinbrecher T., Schmid R. Fascaplysin as a specific inhibitor for CDK4: insights from molecular modelling. PLoS One 2012; 7(8): e42612.
15. Aubry C., Wilson A.J., Jenkins P.R. et al. Design, synthesis and biological activity of new CDK4-specific inhibitors, based on fascaplysin. Chem. Commun. (Camb.) 2004; (15): 1696-7.
16. Hirst T.C., Vesterinen H.M., Sena E.S. et al. Systematic review and meta-analysis of temozolomide in animal models of glioma: was clinical efficacy predicted? Br. J. Cancer 2013; 108(1): 64-71.
17. Zhidkov M.E., Kaminskii V.A. A new method for the synthesis of marine alkaloid fascaplysin based on the microwave-assisted Minisci reaction. Tetrahedron Letters 2013; 54: 3530-2.
18. ATCC [US]. Primary Bone Marrow CD34+ Cells, Normal, Human. ATCC® PCS-800-012, https://www.atcc.org/Products/All/ PCS-800-012.aspx?geo_country=+ru# documentation.
19. Aboody K.S., Najbauer J., Metz M.Z. et al. Neural stem cellmediated enzyme/prodrug therapy for glioma: preclinical studies. Sci. Transl. Med. 2013; 5(184): 184ra59.
20. Чехонин В.П., Брюховецкий А.С, Семенова А.В. и др. Противоопухолевое средство на основе иммунолипосомальной биологической конструкции, способ его получения и векторной доставки в центральную нервную систему при опухолевом процессе. Патент РФ на изобр. №2336901. 27 октября 2008.
21. Kim S.S., Rait A., Kim E. et al. A nanoparticle carrying the p53 gene targets tumors including cancer stem cells sensitizes glioblastoma to chemotherapy and improves survival. ACS Nano 2014; 8(6): 5494-514.
22. Wei J., Yang Y., Lu M. et al. Escape, or vanish: control the fate of p53 through MDM2-mediated ubiquitination. Anticancer Agents Med. Chem. 2015; 16 (2): 174-89.
23. Jin X., Jin X., Jung J.E. et al. Cell surface Nestin is a biomarker for glioma stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013; 433(4): 496-501.
24. Neradil J., Veselska R. Nestin as a marker of cancer stem cells. Cancer Sci. 2015; 106(7): 803-11.
25. Brown D.V., Daniel P.M., D'Abaco G.M. et al. Coexpression analysis of CD133 and CD44 identifies proneural and mesenchymal subtypes of glioblastomamultiforme. Oncotarget 2015; 6(8): 6267-80.
26. ATCC [US]. C6 Cells, glioma, rat. ATCC® CCL-107, https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CCL-107.aspx# characteristics.
27. Shen G., Shen F., Shi Z. et al. Identification of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line and the limitation of current identification methods. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2008; 44(7): 280-9.
28. Hamilton G. Cytotoxic effects of fascaplysin against small cell lung cancer cell lines. Mar. Drugs 2014; 12(3): 1377-89.
29. Meng X.G., Yue S.W. Dexamethasone disrupts cytoskeleton organization and migration of T47D Human breast cancer cells by modulating the AKT/mTOR/RhoA pathway. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2014; 15(23): 10245-50.
30. Pitter K.L., Tamagno I., Alikhanyan K. et al. Corticosteroids compromise survival in glioblastoma. Brain 2016; 139tPt. 5): 1458-71.
31. Kuzmich A.S., Fedorov S.N., Shastina V.V. et al. The anticancer activity of 3- and 10-bromofascaplysins is mediated by caspase-8, -9, -3-dependent apoptosis. Bioorg. Med. Chem. 2010; 18(11): 3834-40.
32. Lu X.L., Zheng Y.L., Chen H.M. et al. Anti-proliferation of human cervical cancer HeLa cell line by fascaplysin through apoptosis induction. Acta Pharmacevtica Sinica 2009; 44(9): 980-6.
33. Ehtesham M., Kabos P., Gutierrez M.A. et al. Induction of glioma apoptosis using neural stem cell-mediated of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Cancer research 2002; 62(24): 1770-4.
34. Frank R.T., Najbauer J., Aboody K.S. Concise review: stem cells as an emerging platform for antibody therapy of cancer. Stem cells 2010; 28(11): 2084-7.
35. Haley B., Frenkel E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urologic oncology 2008; 26(1): 57-64.
36. Kanojia D., Balyasnikova I.V., Morshed R.A. Neural stem cells secreting anti-HER2 antibody improve survival in a preclinical model of HER2 overexpressing breast cancer brain metastases. Stem Cells 2015; 33(10): 2985-94.
37. Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Толок Е.В. и др. Гемо-поэтические стволовые клетки с индуцированным апоптозом эффективно подавляют рост клеток глиомы invitro, но запускают механизм образования опухолевых стволовых клеток. Гены и клетки 2014; IX(4): 70-5.
38. Bryukhovetskiy I., Bryukhovetsky A., Khotimchenko Y. et al. Combination of the multipotentmesenchymal stromal cell transplantation with administration of temozolomide increases survival of rats with experimental glioblastoma. Mol. Med. Rep. 2015; 12(2): 2828-34.
39. Брюховецкий А.С. Клеточные технологии в нейроонкологии: циторегуляторная терапия глиальных опухолей головного мозга. М.: Издательская группа РОНЦ; 2011.
Поступила: 30.08.2016
