CC BY
365
ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 615.1
Д. А. Василькин1, Л. А. Поцелуева1, И. А. Литвинов2, А. Т. Губайдуллин2
ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ВО ВЗАИМОСВЯЗИ С ИХ ПОЛИМОРФИЗМОМ КАК ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИМ ФАКТОРОМ.
Сообщение I
1 ГОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет
2 ФГУ Институт органической и физической химии им. А. Е. Арбузова
В начале 60-х годов XX века сформировалось новое научное направление — биофармация. К этому моменту в литературе появились многочисленные данные о фактах фармакотерапевтической неэквивалентности одинаковых лекарственных препаратов, производимых разными промышленными предприятиями.
Один из самых известных случаев, получивших широкую огласку, — обнаружение двукратного различия в активности таблеток широко используемого антикоагулянта — бисгидрооксикумарина, произведенного разными фирмами. При этом не было выявлено различий в количественном содержании действующего вещества. В последующем такие же факты имели место и в отношении препаратов других групп — антибиотиков (тетрациклинов, левомицетина, эритромицина), стероидных гормонов, сульфаниламидов, нестероидных противовоспалительных средств.
С позиций биофармации выделяют понятия «биодоступность» и «фармацевтические факторы», которые подразделяются на несколько групп, а именно:
— химическая модификация препарата (соль, кислота и т.д.);
— физико-химическое состояние лекарственного вещества (полиморфизм, размеры частиц);
— вспомогательные вещества, их природа и количество;
— вид лекарственной формы и пути введения в организм;
— фармацевтическая технология.
Одним из самых значимых факторов, определяющих активность лекарственных веществ, является полиморфизм.
Полиморфизм кристаллов (от греч. ро1ушогрЬо8 — многообразный) — способность вещества существовать в различных кристаллических структурах, называемых полиморфными модификациями (их принято обозначать греческими буквами а, р, у и т. д.). Близким с понятием полиморфизма является термин аллотропия, когда один химический элемент может образовывать несколько простых веществ. Данное свойство веществ изучается даже в рамках школьной программы на примере углерода, образующего такие кристаллические модификации, как графит, алмаз, карбен, фуллерен. Надо
© Д.А.Василькин, Л.А.Поцелуева, И.А.Литвинов, А.Т.Губайдуллин, 2010
заметить, что, несмотря на схожесть данных понятий они не тождественны — в понятие полиморфизм не входят аллотропные модификации некристаллических веществ, например кислород и озон.
Полиморфизм веществ до недавних времен рассматривался как редкое явление, не имеющее практического значения. Впервые наличие полиморфизма было отмечено в 1788 г. немецким химиком М. Г. Клапортом на примере минералов кальцита и арагонита, представляющих собой разные кристаллические формы карбоната кальция [1]. По мнению американского химика У. Мак-Кроуна, «каждое соединение имеет различные полиморфные модификации и... число модификаций, выявляемых для данного соединения, зависит от времени и средств исследователя». Академик В. И. Вернадский назвал полиморфизм «общим свойством материи». Даже такое простое и известное вещество, как вода, по последним данным, может существовать в виде 3 аморфных и 15 кристаллических модификаций.
В органической химии полиморфизм является скорее правилом, чем исключением. В 1942 г. было известно более 1200 органических полиморфных соединений, сегодня их насчитывается более 10000. Исследование полиморфизма биологически активных органических соединений и, прежде всего лекарственных веществ, началось в конце 30-х годов прошлого столетия. В 1937 г. был обнаружен полиморфизм сульфаниламида, в 1941 г. выделены и рентгенографически изучены его полиморфные модификации [2]. Первый обзор о фармацевтическом применении полиморфизма был опубликован в 1969 г.
В настоящее время полиморфизм выявлен у более чем 70% лекарственных веществ практически всех фармакологических групп. Он оказался чрезвычайно важным фактором, определяющим лечебный эффект фармацевтических субстанций и лекарственных форм, существенно влияющим на параметры их биологической активности.
Полиморфные изменения могут явиться причиной быстрой инактивации лекарственных веществ, а также смены физических показателей готовых лекарственных средств и химической несовместимости ингредиентов в лекарственной форме.
Полиморфные модификации ряда широко применяемых лекарственных веществ заметно различаются по химической стабильности, гигроскопичности, прессуемости. В зависимости от типа связей в кристалле, окружающих условий, химической структуры они могут переходить в свои менее активные, но при этом более стабильные аналоги. Полиморфные превращения наиболее характерны для лекарственных и вспомогательных веществ в суспензиях, мазях, суппозиториях, гранулах, таблетках, капсулах, спансулах, аэрозолях с твердой дисперсной фазой. Иногда такие переходы могут происходить и при хранении исходной субстанции, нагреве или механическом воздействии, например при измельчении. Иногда такой переход может вызвать попытка снять кристалл с подложки или царапание кристалла. С другой стороны, иногда различия между полиморфными формами могут сохраняться и после их растворения.
В то же время полиморфные формы вещества могут сильно различаться между собой по активности, стабильности, частоте побочных эффектов.
Классическим примером зависимости биодоступности лекарственных веществ от их полиморфной модификации является хлорамфеникол пальмитат, который может существовать в виде трёх полиморфных форм (А, В и С), а также в виде аморфной формы. Наиболее стабильной является форма А, но биологически активны только форма В и аморфная форма. Например, суспензия, состоящая из одной только формы В хлорам-феникола пальмитата, обеспечивает в крови на порядок более высокую концентрацию вещества, чем аналогичная суспензия, содержащая то же вещество, но в виде формы А.
Исследования полиморфизма хлорамфеникола пальмитата затруднялись тем, что переход из одних форм в другие происходил даже при измельчении названного вещества в процессе подготовки образца к исследованию [3].
Из 4 полиморфных форм дикаина его ß-форма наиболее стабильна, реже вызывает аллергические реакции и в 2-2,5 раза активнее других форм данного соединения. Обнаруженные различия столь существенны, что в ГНИИ «Биоэффект» была разработана технология получения субстанции, состоящей только из ß-формы дикаина, получившей название — леокаин [4]. Примером может служить и полученная из промышленной субстанции метилурацила его ß-форма — бетамецил, обладающая более высокой ранозаживляющей активностью, чем исходная субстанция метилурацила [5].
Отдельно следует отметить существование псевдополиморфизма, когда при кристаллизации молекулы растворителя внедряются в кристаллическую решетку вещества, вызывая ее изменение. Точки плавления и растворимость сольватов и несольва-тированных форм вещества могут значительно различаться. Растворимость сольватов, в свою очередь, влияет на их биофармацевтическое поведение.
Примеры влияния псевдополиморфизма на биодоступность лекарственных веществ не менее многочисленны. Например, безводная форма ампициллина при 37°С на 20% более растворима в воде, чем его тригидрат. Соответственно, время, необходимое для растворения безводного ампициллина, значительно меньше. Поэтому при использовании безводной формы антибиотика в виде пероральных суспензий и капсул наблюдается более раннее достижение пика концентрации в плазме крови и более высокое его содержание, чем в случае применения тригидрата. Скорость растворения безводных форм кофеина, теофиллина, глютетимида также значительно выше, чем их сольватных форм. И наоборот, метанольные сольваты трет-бутилацетата преднизолона всасываются в среднем в 4,7 раза быстрее безводной формы [3].
В США тесты на полиморфизм включены в требования FDA1 для аналитического контроля новых лекарственных средств, утвержден набор методик его выявления и изучения. Фармакопеи ряда стран содержат перечень лекарственных веществ, имеющих полиморфные модификации. 23-я Фармакопея США указывает на наличие полиморфизма у индометацина, этаминал-натрия, плаквенила, тетракаина гидрохлорида и ряда других веществ.
Важно отметить, что в отечественной нормативной документации обычно не отражается факт возможного существования полиморфизма у конкретного лекарственного вещества и не оговаривается необходимость соблюдения определенных условий его кристаллизации для получения кристаллов с определенными характеристиками, определяющими наиболее высокую терапевтическую активность получаемых лекарственных средств в промышленных условиях.
Получение кристаллов лекарственных веществ разных модификаций и форм, в том числе и псевдополиморфных форм (кристаллосольватов) определяется способом кристаллизации вещества. В связи с этим могут различаться и характеристики образцов веществ, полученных на разных заводах-производителях. Причем, различия могут отмечаться и в образцах отдельных серий одного и того же предприятия. Особые проблемы возникают с зарубежными субстанциями, характеризующимися значительным разбросом свойств даже в пределах одной серии. В связи с этим вполне логичен интерес к проблеме полиморфизма в отношении лекарственных субстанций, поступающих на
1 (US FDA) — (англ. Food and Drug Administration)—Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (США).
отечественные фармацевтические предприятия для производства лекарственных препаратов.
Методы. На первом этапе нами были проведены исследования на предмет наличия полиморфизма в 6 образцах промышленного производства субстанций сульфаниламида (стрептоцида) и 1-хлорметилсилатрана (мивала). Ввиду отсутствия в образцах субстанций кристаллов, пригодных для монокристального рентгеноструктурного анализа, исследование производили кристаллографическим методом.
На втором этапе исследования было изучено влияние условий кристаллизации на возможность образования полиморфных модификаций исследуемых веществ. Перекристаллизацию сульфаниламида осуществляли из воды, спирта этилового, ацетонитрила, ацетона, н-бутанола и воды методами равновесной и неравновесной кристаллизации. По первому методу кристаллизацию проводили сушкой (испарением растворителя) при 20°C из растворов сульфаниламида, насыщенных при той же температуре. По второму методу готовили растворы сульфаниламида в указанных органических растворителях вблизи их температуры кипения (60—100°C), так как вблизи точки кипения раствора растворимость вещества резко повышается, что увеличивает выход продукта кристаллизации, и затем быстро охлаждали растворы до температуры 20° C.
Перекристаллизацию 1-хлорметилсилатрана производили из этанола, ацетона, ацетонитрила и диметилсульфоксида (ДМСО) по методике, описанной для сульфаниламида. Ввиду малой летучести ДМСО кристаллизацию сушкой его растворов не производили.
Полученные кристаллы отделяли от раствора и исследовали кристаллографически, и далее подвергали монокристальному рентгеноструктурному анализу.
Рентгеноструктурный анализ заключался в определении параметров кристаллических ячеек кристаллов субстанций сульфаниламида и 1-хлорметилсилатрана на автоматическом рентгеновском дифрактометре «Enraf-Nonius CAD-4» и сопоставлении их с параметрами ячеек, имеющимися в Кембриджской базе кристаллоструктурных данных [6].
На третьем этапе до оценки фармакотерапевтической эффективности полученных полиморфных форм сульфаниламида представлялось интересным изучить активность 10%-ных мазей на его основе, изготовленных экспериментально из образцов сульфаниламида отечественного (ОАО Ирбитский ХФЗ, ОАО Московская фармфабрика и др.) и зарубежного производств (Zhejiang Quzhou Chemical Industrial Corporation, Китай), поступающих в аптечную сеть, и аналогичных мазей заводского изготовления (ОАО фарм. фабрика Санкт-Петербурга).
Для этого из имеющихся образцов субстанций сульфаниламида готовились 10%-ные мази на вазелине согласно нормативной документации [7]. Затем была оценена антимикробная активность образцов экспериментально полученных мазей и образцов мазей промышленного производства в отношении музейного штамма золотистого стафилококка (S. aureus ATCC 25923) и 12 культур золотистого стафилококка, выделенных из полости носа здоровых носителей методом диффузии в агар с использованием лунок, диаметром 6 мм.
Положительным контролем служили стандартные диски с сульфаниламидом, отрицательным контролем была мазевая основа — вазелин.
Для этого чашки Петри с мясопептонным агаром засевались взвесью суточной культуры микроорганизма. Взвесь готовили по эталону мутности 5Ед (500 млн. микроорганизмов в 1 мл) на изотоническом растворе натрия хлорида. Полученную взвесь в количестве 2-3 мл наносили на среду, покачиванием чашки распределяли по всей по-
верхности среды, избыток взвеси сливали. Затем давали время взвеси впитаться в среду (15-20 мин.). В среде при помощи гильзы (диаметр 6 мм) делали лунки, которые заполняли до краев мазью. Далее чашки термостатировали при 37°С в течение 20 часов. Результаты оценивали по величине (диаметру) задержки зон роста вокруг образцов мазей. Чувствительность культур к сульфаниламиду подтверждалась по наличию зоны задержки роста вокруг стандартного диска с лекарственным веществом. Критерии чувствительности: зона задержки роста вокруг диска < 15 мм — культура устойчива к сульфаниламиду, > 15 мм—культура чувствительна.
Результаты. Кристаллографическое исследование образцов сульфаниламида промышленного производства (рис. 1) и образцов, полученных в лабораторных условиях (рис. 2, 3), выявило существенные различия в размере и форме их кристаллов. Различия были выявлены и у образцов 1-хлорметилсилатрана, полученных в промышленных и лабораторных условиях (рис. 4, 5).
V,
образец 4 образец 5 образец 6
Рис. 1. Образцы субстанций сульфаниламида промышленного производства
В ходе проведённого рентгеноструктурного анализа установлено, что:
— 7 образцов кристаллов сульфаниламида, полученных при охлаждении его горячих растворов в этаноле, ацетонитриле, ацетоне и этаноле, а также при сушке водного раствора при 20°С, представляют собой моноклинную р-форму. При этом кристаллы субстанции имеют форму призм или пластин. Параметры ячейки: а 9.000(2), Ь 9.015(2), с 10.050(3) А, в 111.50(3)о, V 758.7(8) А3, Z 4, d(выч) 1,51 г/см3, пространственная группа Р2х/с;
— 2 образца сульфаниламида, полученных при охлаждении его горячего водного раствора и при сушке его раствора в н-бутаноле при 20°С представляют собой ромбическую а-форму. При этом кристаллы субстанции имеют форму игл или тонких пластин, которые также можно принять за игольчатые. Параметры ячейки: а 5.650(2), Ь
н-бутанол вода
Рис. 2. Образцы кристаллов сульфаниламида, полученных охлаждением его горячих насыщенных растворов в различных растворителях
Рис. 3. Образцы кристаллов сульфаниламида, полученных из его растворов в различных растворителях, путем сушки при 20° С
Рис. 4. Образец субстанций 1-хлорметилсилатрана промышленного производства
Рис. 5. Образцы кристаллов 1-хлорметилсилатрана
а — кристаллы, полученные охлаждением горячих насыщенных растворов 1-хлорметилсилатрана в различных растворителях; б — кристаллы, полученные из растворов 1-хлорметилсилатрана в различных растворителях, путем сушки при 20° С.
18.509(2), с 14.794(3) А, V 1547.1(8) А3, Z 8, d(выч) 1,49 г/см3, пространственная группа РЬса;
— идентифицировать кристаллы сульфаниламида, полученные быстрым охлаждением горячего насыщенного раствора в н-бутаноле, было невозможно из-за неудовлетворительного их качества;
— основные геометрические параметры молекул (длины связей и валентные углы) в этих молекулах совпадают в пределах экспериментальных погрешностей. Различия кристаллов (I) и (II), по-видимому, определяются различным типом кристаллической упаковки (рис. 6). Следует отметить, что кристаллы р-формы имеют более высокую вычисленную плотность, чем кристаллы а-формы —1,51 г/см3 и 1,49 г/см3, соответ-
а-форма (I) 0-форма (II)
Рис. 6. Геометрия молекул сульфаниламида в кристаллах а- и р-формы
Рис. 7. Геометрия молекулы 1-хлорметилсилатрана в кристалле
ственно. Плотная упаковка кристалла (II) обусловлена развитой трехмерной системой водородных связей, в образовании которых участвуют три из четырех связей N—Н. К сожалению, в структуре (I) не были выявлены атомы водорода на атомах азота, поэтому система водородных связей в этом кристалле не определена. Тем не менее, тип упаковки
и межмолекулярные контакты N... O типа соответствуют наличию водородных связей, но их тип, по-видимому, определяет слоевую упаковку молекул в кристалле.
— все образцы 1-хлорметилсилатрана были представлены лишь одной формой с параметрами ячейки, одинаковыми для всех исследованных образцов: а = 6,881, b = 11,042, с = 13,208, р = 100,48, V = 986,84À3, Р2х/с (рис. 7).
Таким образом, мази сульфаниламида, изготовленные из образцов субстанции, полученных от разных фирм-производителей, не адекватны друг другу по антимикробной активности, что вполне может быть объяснимо наличием полиморфизма у данного лекарственного вещества.
Выявленное различие в форме кристаллов образцов сульфаниламида заводского изготовления и образцов, полученных в лабораторных условиях, делают целесообразным изучение в дальнейшем противомикробной активности мазей, изготовленных на основе экспериментально полученных кристаллов лекарственного вещества с выявлением наиболее перспективных с терапевтической точки зрения его полиморфных форм.
Отсутствие у 1-хлорметилсилатрана полиморфизма обусловливает возможность получения на его основе биоэквивалентных лекарственных средств без учёта данного фармацевтического фактора.
Литература
1. Леонидов Н. Б. История развития концепции полиморфизма химических веществ (краткий очерк) // Российский химический журнал. 1997. Т. XLI. №5. С. 10-22.
2. Казахстанский фармацевтический вестник. 2002, май, № 9 (157). Интернет-версия: http://www.pharmnews.kz/kfv_db/Nomera157/ct3.html
3. Полиморфизм молекулярных кристаллов / Дж. Берштейн; [пер. с англ. К. Ю. Супов-ницкого, И. В. Глухова, И. В. Фединина и др.; под. ред. М. Ю. Антипина, Т. В. Тимофеевой]; Междунар. союз кристаллографии. М.: Наука, 2007. 500 с.
4. Леонидов Н. Б., Селезенев Н. Г., Успенская С. И. Физико-химические свойства леокаина и особенности его биологической активности в сравнительном аспекте с дикаином // Российский химический журнал. 1997. Т. XLI. №5. С. 53-60.
5. Леонидов Н. Б., Селезенев Н. Г., Успенская С. И. и др. Особенности структуры, физикохимических свойств и биологической активности бетамецила в сравнительном плане с метил-урацилом // Там же С. 82-86.
6. Кембриджская кристаллографическая база данных—Cambridge Cristallographie Data Base. http://www.ccdc.cam.ac.uk/
7. Фармакопейная статья 42-2037-92 —Мазь стрептоцидовая 10%.
Статья поступила в редакцию 21 декабря 2009 г.
