CC BY
226
А.А. Иванов1'2'3, И.Е. Андрианова1, В.Н. Мальцев1, А.Н. Абросимова1'2, Т.М. Булыжина12, С.В. Ворожцова12, Ю.С. Северюхин12, Н.М. Ставракова1
Фармакологические свойства фитомеланина
1 ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна», г. Москва 2 Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН, г. Москва 3 Объединенный институт ядерных исследований, г. Дубна
A.A. Ivanov^2^, I.E. Andrianova1, V.N. Mal'tsev1, А-N. Abrosimova12, T.M. Bulynina12, S.V. Vorozhtsova12, Yu. S. Severyuchin12, N.M. Stavrakova1
The pharmacological properties of phytomelanin
1 Federal State Budgetary Institution "State Research Center — Federal Medical Biophysical
Center named by A.I. Burnazyan", Moscow 2 Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia 3 Laboratoty of Radiation Biology, Joint Institute for Nuclear Research, Dubna, Russia
Ключевые слова: меланин, масса тела, физическая сила, поведенческие реакции, кроветворение.
Цель работы — изучение влияния длительного применения фитомеланина на жизненно важные функции организма: кроветворение, иммунитет и поведенческие реакции. Материалы и методы. На мышах СБ-1 и ¥(СВЛ*С57В1) действие фи-томеланина при приеме внутрь изучено по показателям динамики массы, периферической крови, центральных органов кроветворения и иммунитета, а также выносливости к статической нагрузке и поведения в «открытом поле». Результаты. Водорастворимый фитомеланин вызывает выраженные изменения в изученных системах, направленность которых зависит от его растворимости и дозировок, в том числе применяемых у человека. Выводы. Водорастворимые меланины, разрабатываемые для энтерального и парентерального введения, следует рассматривать как новые фармакологические средства, доклиническое изучение безопасности которых регламентировано имеющимися требованиями.
Keywords: melanin, body weight, physical strength, behavoioral activity, hematopoiesis.
Literaly and our own data of pharmacological properties of phytomelanine are presented. It was shown that intake of water with phytomelanin demonstrated modulating effects on immuno-hematological status, body weight, physical strength and behavioral. The authors believe, that exogenous melanines that are used in medicinal practice are not the food biologically active additives, therefore they should be studied for other applications, according to the requirements applied to the new pharmacological substances.
The article presents our own findings and data in publications on the pharmacological properties of phytomelanine.
Меланины — собирательное определение группы высокомолекулярных соединений животного и растительного (фитоме-ланины) происхождения, обладающих широким кругом физиологических функций [12] и, как следствие, рядом фармакологических свойств. В организме человека меланины находятся в меланоцитах кожи, прида-
ют окраску волосам и радужной оболочке глаза. В форме Substantia Nigra меланины являются частью экстрапирамидной системы, находящейся в области четверохолмия средне -го мозга, которое играет важную роль в осуществлении вегетативных функций, включая дыхание, сердечно-сосудистую деятельность, а также статокинетической функции.
Повреждение последней приводит к развитию болезни Паркинсона [15]. Меланины эндогенного происхождения наделены ролью фото- и радиопротекторов за счет их способности нейтрализовать продукты перекисного окисления липидов [3; 6; 9; 14; 17], участвуют в репарации ДНК, будучи акцепторами электронов, включаются в процессы дыхательной цепи. Нарушения пигментного обмена (меланогене-за) приводят к развитию дисхромии кожи, в частности витилиго [7].
Исходя из разнообразия физиологических функций меланинов в организме, а также с учетом различных видов патологии человека, развивающейся при нарушении пигментного обмена, фармакологи в течение нескольких десятилетий разрабатывают способы получения и медицинского применения экзогенных меланинов, в первую очередь микробного и растительного происхождения [8]. На этом пути были получены важные результаты. В частности, установлено радиопротекторное действие меланина при его парентеральном [17] и внутри-желудочном [9] однократном и многократном введении перед облучением. Отмечено уменьшение мутагенного действия циклофосфамида препаратом меланина из гречихи [1; 2].
После однократного внутрибрюшинно-го введения водорастворимого меланинового пигмента из винограда крысам на фоне длительного стресс-воздействия отмечен слабый активирующий эффект у неэмоциональных животных и угнетающий — у эмоциональных в тестах «открытое поле» и Хендерсона [5], при этом установлено вовлечение углеводного и липидного обмена в реализацию модифицирующего действия эномеланина. Отмечается крайне низкая острая токсичность меланинов - ЛД50>2500 мг/кг.
Меланины, обладающие высокими сорб-ционными свойствами, успешно использованы в качестве энтеросорбентов [10].
Меланиновые пигменты находят все более широкое применение в косметологии, лакокрасочной и пищевой (краситель Е150с) промышленности [11]. Достаточно отметить, что они являются составной частью шоколада, гречки, черного хлеба, напитков типа кока-кола и др.
По нашему наблюдению, имеет место определенный парадокс, поскольку, с одной
стороны, меланины обладают высокой физиологической и фармакологической активностью, а с другой — нетоксичны. Одним из объяснений подобного парадокса представляется предположение о существовании в организме некоего «депо» связанных меланинов, высвобождающихся из него при определенных физиологических ситуациях [5; 13].
Наше внимание привлек водорастворимый меланин из лузги гречихи [11]. Разработчики этого меланина, имеющего статус биологически активной добавки к пище, приписывают ему все положительные свойства, известные для данной группы соединений. Хорошая растворимость на уровне не менее 80% позволяет использовать это вещество с питьевой водой.
Цель исследования — изучение влияния длительного применения фитомеланина на жизненно важные функции организма: кроветворение, иммунитет и поведенческие реакции.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на аутбред-ных мышах-самцах породы CD-1, SPF категории с исходной массой тела 21—22 г, а также на мышах-гибридах F1(CBA*C57Bl) с исходной массой тела 16—17 г, содержавшихся в условиях конвенционального вивария с неограниченным доступом к стандартному брикетированному корму и питьевой воде.
В опытах использовали фитомеланин из лузги гречихи, полученный в НИИ биологии Иркутского государственного университета [11] . Исследовано две партии меланина: А — с растворимостью в воде на уровне 80% и В — с водорастворимостью на уровне 95—98%, с концентрацией парамагнитных центров не менее 6Х1017 спин/г. Меланин растворяли в дистиллированной воде из расчета 0,125 и 0,5 мг сухого вещества на 1 мл воды, при этом вещество В растворялось практически полностью, а вещество А частично не растворялось и оставалось в виде темных крупинок на дне бутылки. Дозировка 0,5 мг/мл близка к используемой по разным показаниям у человека в качестве пищевой добавки. Контрольные животные получали дистиллированную воду, а опытные — растворы меланина ad libitum в течение 15 суток.
Массу тела животных измеряли на электронных весах с ценой деления 1 г.
Эвтаназию животных проводили методом цервикальной дислокации. Животных не менее 6 на точку обследовали в период с 5-х по 15-е сутки от начала эксперимента. Массу тимуса и селезенки измеряли на электронных весах «Adventurer» (Ohaus) с ценой деления 1 мг.
Число форменных элементов в периферической крови определяли с помощью гематологического анализатора фирмы «Alcon 7» (ФРГ). В одном из экспериментов число лейкоцитов в крови определяли рутинным методом в камере Горяева.
Уровень ядросодержащих клеток в бедренной кости мышей определяли по методу Манца [4].
Спонтанную двигательную активность мышей оценивали в тесте «открытое поле». Мышечную силу определяли по времени удержания на скользком вертикальном стержне.
Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Excel.
Эксперименты выполнены с соблюдением биомедицинской этики по правилам, регламентированным приказом Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1987 г. № 755.
Результаты исследования и их обсуждение
Динамика массы тела мышей-самцов F1(CBA*C57Bl), получавших меланин, представлена в табл. 1.
Как видно из таблицы, на 10-е и 12-е сутки приема меланина в дозе 0,5 мг/мл (серия А) отмечено существенное статистически значимое превышение массы тела опытных животных над контрольными. При дальнейшем наблюдении различия по сравнению с контролем практически нивелировались.
Сходная динамика массы тела зарегистрирована при использовании меланина се-
рии В в 4 раза меньшей концентрации — 0,125 мг/мл питьевой воды: увеличение по сравнению с контролем на 10-е сутки и снижение различий на 15-е сутки. Хорошо растворимый меланин серии В в концентрации 0,5 мг/мл оказал отрицательное влияние на динамику массы тела, четко проявившееся на 15-е сутки от начала эксперимента.
Показатели иммуногематологическо-го статуса мышей, получавших меланин серии А, представлены в табл. 2.
Видно, что двухнедельный прием меланина в концентрации 0,5 мг/мл сопровождается существенным увеличением массы тимуса и селезенки, количества в ней ядерных клеток, а также нарастанием числа миелокарио-цитов в костном мозге, наиболее выраженным на 11-е сутки. Изменения в периферической крови в период 11—14-е сутки характеризовались повышением уровня тромбоцитов и снижением содержания лейкоцитов.
Противоположная направленность изменений изученных показателей наблюдалась при приеме меланина улучшенной растворимости — серии В. Результаты представлены в табл. 3.
Видно, что длительное — в течение 15 суток — потребление мышами меланина этой серии в большой концентрации обусловило статистически достоверное снижение массы селезенки, числа кариоцитов в костном мозге и лейкоцитов в периферической крови по сравнению с контрольной группой. Кроме того, по показателям массы селезенки и количеству лейкоцитов в периферической крови статистически значимое их снижение отмечено и по сравнению с группой, получавшей меланин в малой концентрации, при которой негативных эффектов не наблюдалось. По показателю массы тимуса статистически достоверных различий не выявлено.
Динамика массы тела мышей при длительном потреблении меланина (% по отношению к контролю на соответствующий срок) Таблица 1
Группа Меланин: серия и Мыши Время от начала эксперимента (сутки)
концентрация, мг/мл 5-е 10-е 11-е 12-е 13-е 14-е 15-е
1 Серия А 0,5 F1(CBAxC57Bl) - 123* 117 119* 114 106 -
2 Серия В 0,5 СБ-1 108 97** - - - - 78**
3 Серия В 0,125 СБ-1 115 125 - - - - 103
Примечания: * — различия достоверны по отношению к контролю — критерий Стьюдента, р<0,05; ** — различия достоверны с группой 3 — критерий Стьюдента, р<0,05.
Таблица 2 Иммуногематологический статус мышей РДСВАхС57В1), получавших меланин серии А в концентрации 0,5 мг/мл (М±т)
Показатели Группа Время от начала эксперимента, сутки
10-е 11-е 13-е 14-е
Масса тимуса, мг Контроль 19±4,5 26±7,6 27,8±8,9 45±11,3
Меланин 43,5±8,12* 39,5±3,9 47,8±2,2* 66,4±6,0
Масса селезенки, мг Контроль 23±11,8 41,5±9,8 51±10,3 82,0±8,4
Меланин 58,7±9,8 78,5±8,9* 86,7±15,4 88,6±5,8
Количество клеток в селезенке, *106 Контроль - 85,0±50,9 81,0±28,6 146,0± 11,3
Меланин - 152,9±20,3 131,8±17,1 151,5±20,7
Число кариоцитов в костном мозге, х106/бедро Контроль 20,9±5,9 19,5±1,85 19,6±2,5 25,7±3,5
Меланин 24,4±2,75 28,3±1,23* 21,0±2,58 25,1±1,68
Число лейкоцитов, *109/л Контроль 4,1±0,29 4,75±0,76 4,2±0,48 5,6±2,52
Меланин 3,7±0,5 4,75±0,45 2,9±0,48* 3,44±0,34
Число тромбоцитов, *109/л Контроль 868±137,3 882±82 924±19,6 864±42
Меланин 929±38,1 720±5,6* 880±59 890±43,6
Примечание: * — различия достоверны по сравнению с контролем (критерий Манна—Уитни, р<0,05).
Иммуногематологический статус мышей CD-1, получавших меланин серии В (M±m) Таблица 3
Показатель Уровень показателя Группа Концентрация меланина, мг/мл Время от начала эксперимента, сутки
в контрольной группе 5-е 10-е 15-е
Масса тимуса, мг 68,3±20,6 1 0,5 52,5±9 52±10,6 56±24
2 0,125 54,2±14,6 58,2±15 58±13
Масса селезенки, мг 120,2±16,3 3 0,5 123±12,3 112,7±9,4 65,7±15,7*, **
4 0,125 144,5±7,8 111±9,5 114,8±17,8
Число кариоцитов в костном 13,9±1,37 5 0,5 10,8±1,9 10,4±3,0 9,1±1,4**
мозге, *106/бедро 6 0,125 11,2±2,6 10,8±2,6 10±4
Число лейкоцитов, *109/л 5,4±0,5 7 0,5 6,1±1,2 5,3±1 3 4±0 8** ***
8 0,125 4,7 ±1,4 7,1±0,6 7,9 ±1,3**
Примечания: * — различия достоверны в сравнении с группой 4 — критерий Стьюдента, р<0,05; ** — различия достоверны в сравнении с контрольной группой — критерий Стьюдента, р<0,05; *** — различия достоверны в сравнении с группой 8 — критерий Стьюдента, р<0,05.
Выносливость к физической нагрузке является тестом, характеризующим состояние функциональных систем организма, обеспечивающих нервно-мышечную регуляцию. Показано, что прием меланина серии А в концентрации 0,5 и 0,125 мг/мл в течение 8 дней приводит к достоверному сокращению времени удерживания мышей на вертикальном стержне, которое соответственно группам составило 83,8±25,4 и 89,9±17,7 сек, в контроле - 164,0±23,8 сек (р<0,05).
Результаты тестирования спонтанной двигательной активности (СДА) мышей в «открытом поле» представлены на рисунке.
Видно, что прием меланина серии А в течение 8 дней вызвал снижение всех параметров СДА. На 1-е сутки после его отмены суммарное число выполненных действий уменьшилось до 85,6±18,9 (0,5 мг/мл) и 77,7±6,0
(0,125 мг/мл), в контроле — 127,4±9,6 (р<0,02). Помимо этого у мышей, принимавших меланин, отмечены удлинение 1о$-фазы, замедленность и осторожность передвижений с повторным возвращением в пройденные квадраты. При дальнейшем наблюдении различия показателей в группе с малой дозой и контролем практически нивелировались. Наиболее уязвимым компонентом оказался «норковый рефлекс», достоверное снижение которого сохранялось при обеих дозировках меланина.
Заключение
Меланины естественного микробного, растительного и животного происхождения, нерастворимые в воде, постоянно поступают в организм человека с различными продуктами питания. В числе таких продуктов следует
1-е сутки
j- 140 ю
^ 120 )S
| 100
<J
80
О
¡S 60
U ф
g 40
J 20 0
É
*
= S É *
? *
ш
= = К 1 * * ^— _
В Контроль
ИМелэнин 0,5 мг/мл
ПМелэнин 0,125 мг/мл
11-е сутки
В Контроль
Основные показатели спонтанной двигательной активности мышей, получавших меланин серии А.
1 - суммарная двигательная активность, 2 - пересечение квадратов, 3 - заглядывание в «норки», 4 - подъемы, 5 - заходы в центр; * - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)
отметить гречневую крупу, черный хлеб, какао, черные грибы и др. Многовековой опыт человечества показывает, что такого рода вещества безопасны в качестве пищевых продуктов. Наиболее логичным предположением о причине безопасности физиологически активных веществ естественного происхождения при энтеральном использовании является существование в тканях отложений — «депо», где они находятся в связанном состоянии в виде неактивных меланопротеинов [5]. На наш взгляд, именно в этой ситуации меланины нетоксичны.
Другое положение складывается в том случае, когда для получения меланинов используют высокоагрессивные методы, такие как обработка целлюлолитическим ферментом с последующей экстракцией раствором щелочи и обработкой соляной кислотой [11].
Получаемый в этом случае водорастворимый меланин становится существенно более биодоступным при сохранении выраженных антиоксидантных свойств, с концентрацией парамагнитных центров 6х 1017 спин/г [2]. Указанные обстоятельства позволяют, на
наш взгляд, объяснить тот факт, что при длительном поступлении водорастворимого меланина в организм мышей в суточной дозе 25—30 мг/кг отмечены замедление роста массы тела животных и нарушение иммуногема-тологического статуса, снижение спонтанной двигательной активности и мышечной силы. Уменьшение суточной дозы меланина в 4 раза при наблюдении в течение 15 суток нивелировало проявление негативных эффектов и привело к стимуляции роста массы тела, массы селезенки и числа лейкоцитов в периферической крови, восстановлению СДА.
Меланин с ограниченной водораствори-мостью (серия А) в дозе 0,5 мг/мл проявил фармакологические свойства, сопоставимые с эффектом меланина с хорошей водораствори-мостью (серия В), используемого в существенно меньшей концентрации — 0,125 мг/мл. Это указывает на важность показателя водораство-римости при стандартизации препаратов фито-меланина.
Анализ собственных и литературных данных свидетельствует о необходимости разграничения представлений о физиологической роли эндогенных меланинов и фармакологических свойствах экзогенных меланинов, вводимых в организм животных и человека как энтерально, так и парентерально. В доступной литературе мы не встретили сообщений об успешном применении меланинов для лечения дисхромий кожи или болезни Паркинсона — специфических патологических состояний с явным нарушением пигментного обмена. Напротив, приведенные во введении данные литературы указывают на неспецифический характер фармакологических эффектов экзогенных меланинов, основанный на их физико-химических свойствах, таких как способность тормозить перекисное окисление липидов [6; 8; 14] и даже осуществлять неспецифическую сорбцию токсичных веществ, включая радионуклиды [10].
Изменение процессов перекисного окисления липидов, жирового, углеводного и пигментного обмена, нарушение дыхательной цепи являются составными частями ряда патологических процессов, включая развитие атеросклероза, канцерогенеза, диабета, лучевых и ожоговых поражений и др. Все это указывает на то, что водорастворимые фитомеланины яв-
120
100
80
60
20
0
ляются веществами, перспективными для создания на их основе медицинских средств — неспецифических митигаторов при ряде заболеваний. Возможность достижения позитивного эффекта с помощью этих веществ при лучевой патологии подтверждается данными об уменьшении мутагенного действия цитостати-ка циклофосфамида водорастворимым меланином, полученным из лузги гречихи [1; 2]. Позитивные результаты получены и при вну-трижелудочном [16] введении нативных меланинов. В частности, установлено, что многократное введение мышам суспензии черных грибов перед облучением повышает их радиорезистентность. Вполне вероятно, что для достижения быстрого формирования повышенной радиорезистентности оптимальным может быть внутривенное введение, применение водорастворимых форм в виде наномела-нинов. Такие попытки уже предпринимаются [18]. Для формирования повышенного уровня радиорезистентности на длительный период, по-видимому, наиболее целесообразно курсовое введение, создание некоего «депо» из нативных меланопротеинов. Оптимизация условий лечебно-профилактического применения меланинов требует дальнейших фармакокине-тических исследований.
В ходе обсуждения проблемы, на наш взгляд, необходимо акцентировать внимание на некоторых практически значимых моментах.
Следует разграничить фармакологические подходы в исследовании биомедицинских свойств, с одной стороны, натуральных меланинов, входящих в состав пищевых продуктов и выделенных из них щадящими физико-химическими методами, а с другой стороны — меланинов с измененными в результате воздействия агрессивных веществ физико-химическими свойствами и структурными вариациями.
Водорастворимые меланины, предназначенные как для энтерального, так и впоследствии — для парентерального введения, нельзя рассматривать как биологически активные добавки к пище. Напротив, к ним должны быть применены требования по стандартизации, доклиническому и клиническому изучению, регламентированные для новых фармакологических веществ.
Литература
1. Алексеева Т.Н., Орещенко A.B., Куликова A.B. и др. Влияние растительного ме-ланинового пигмента на кластогенные эффекты химических мутагенов у мышей // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001. № 6. С. 51—61.
2. Барабой В.А., Дурнев А.Д., Орещенко A.B. и др. Уменьшение мутагенного действия циклофосфамида препаратом меланина из гречихи // Украинский биохимический журнал. 2004. Т. 76. № 5. С. 148-150.
3. Бердышев Г.Д. О защитном действии меланина при облучении мышей // Радиобиология. 1964. Т. 4. Вып. 4. С. 644-645.
4. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. М.: Медицина, 1983.
5. Жеребин Ю.М., Бондаренко H.A., Макан С.Ю. и др. Фармакологические свойства эномеланиновых пигментов // Доклады АН УССР. 1984. № 3. Серия 5. С. 64-67.
6. Жеребин Ю.М., Сава В.М., Колесник A.A., Богатский A.B. Исследования антиокислительных свойств эномеланина // Доклады AH СССР. 1982. 262. № 1. С. 112-115.
7. Исмайлов Р.Г. Регуляция меланогенеза при дисхромии кожи // Вестник РAМH. 2014. № 1-2. С. 85-92.
8. Лях С.П. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука, 1981.
9. Моссэ И.Б., Кострова Л.Н., Дубовик Б.В. и др. Влияние меланина на мутагенное действие хронического облучения и адаптивный ответ у мышей // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. № 2-3. С. 325-333.
10. Моссэ И.Б., Плотникова С.П., Лях И.П. и др. Радиопротектор, снижающий накопление радионуклидов в организме. Заявка на а.с. 06.12.90 № 1888566 (116992).
11. Огарков Б. Н., Самусенок Л. В. Способ получения пигмента-красителя из растительного сырья. Патент RU 2215761 С09861, 2003.
12. Островский M. А., Донцов А. Е. Физиологические функции меланина в организме // Физиология человека. 1985. Т. 11. № 4. С. 670-678.
13. Эммануэль H.M. Химическая и биохимическая кинетика // Успехи химии. 1981. Т. 50. № 10. С. 1721-1809.
14. Юасифов Э.Ю., Донцов А.Е., Островский М.А. Влияние меланина на свободно-радикальное состояние гамма-облученных белков и липидов / / Радиобиология. 1987. Т. 27. Вып. 1. С. 8-11.
15.Adams R., Van Bogaert L., Ecken H. Striatonigral degeneration // Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1964. Vol. 23. P. 584-593.
16. Dadachova E., Casadevall A. Oral administration of melanin for protection against radiation. Патент США. W02012129047 (А1) 2012-09-27.
17. Kunwar A., Adhihary B., Jayakumar S. et al. Melanin, a promising radioprotector: Mechanisms of actions in a mice model // Toxicology and Applied Pharmacology. 2012. Oct. 15. No. 264(2). P. 202-211.
18. Schweitzer A.D., Revskaya E., Chu P. et al. Melanin-covered nanoparticles for protection of bone marrow during radiation therapy of cancer // International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 2010. Vol. 78. No. 5. P. 1494-1502.
Контакты:
Иванов Александр Александрович, заведующий лабораторией радиационной иммунологии и экспериментальной терапии ФГБУ ГНЦ РФ -«ФМБЦ им. А.И. Бурназяна» ФМБА России, доктор медицинских наук, профессор. Тел.: 8-499-190-96-35. E-mail: [email protected]
