CC BY
21
УДК 616.62-003.7-092.4
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ВНУТРИПОЧЕЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ И МАРКЕРОВ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА НЕФРОЦИТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ
Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул Жариков А.Ю., Якушев Н.Н.
Целью данного исследования является изучение влияния натрия цитрата и а-токоферола ацетата на уровень экспрессии протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина, бикунина, малонового диальдегида и супероксиддисмутазы в почечной ткани крыс при экспериментальной мочекаменной болезни. Эксперименты проведены на 60 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и массой от 250-300 граммов. Животные были разделены поровну на 4 группы: группа интактных крыс - Гинт (42 дня содержания в стандартных лабораторных условиях без моделирования МКБ и без введения исследуемых препаратов), контрольная - Гк (42 дня моделирования МКБ), группа лечения натрия цитратом - Гнц (42 дня моделирования МКБ + ежедневное введение натрия цитрата с 22-го по 42-й дни эксперимента), группа лечения а-токоферола ацетатом - Гт. (42 дня моделирования МКБ + ежедневное введение а-токоферола ацетата с 22-го по 42-й дни эксперимента). Экспериментальная мочекаменная болезнь моделировалась в соответствии с общепринятой этиленгликолевой моделью. Определение экспрессии протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина и бикунина, а также супероксиддисмутазы и малонового диальдегида проводилось при помощи непрямого двухшагового стрептавидин-биотинового метода с контролем специфичности реакции.
Установлено, что экспрессия протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина, бикунина, малонового диаль-дегида и супероксиддисмутазы в условиях моделирования МКБ была подвержена существенным изменениям относительно здоровых крыс. На этом фоне длительное непрерывное введение натр ия цитрата и а-токоферола ацетата сопровождалось нормализацией экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и маркеров оксидативного повреждения нефроцитов.
Ключевые слова: мочекаменная болезни, внутрипочечные ингибиторы кристаллизации, маркеры ок-сидативного стресса, натрия цитрат, а-токоферола ацетат.
The present research is aimed at the study of sodium citrate and а-tocopherol acetate effect on the level of expression of Tamm-Horsfall protein, osteopontin, bikunin, malondialdehyde and superoxide dismutase in the kidney tissue of rats by experimental kidney stone disease.
The experiments were performed in 60 male Wistal rats at the age of 2-3 months and 250-300 g of weight. The animals were equally divided into 4 groups: the group of intact rats - Gint (42 days in standard laboratory conditions without KSD modelling and without injection of the studied drugs), control group - Gc (42 days of KSD modelling), group of treatment by sodium citrate - Gn c (42 days of KSD modelling + daily injection of sodium citrate from 22nd to 42nd day of experiment), group of treatment by а-tocopherol acetate - Ga (42 days of KSD modelling + daily injection of а-tocopherol acetate from 22nd to 42nd day of experiment). The experimental kidney stone disease was modelled in accordance with the generally accepted ethyleneglycol model. The expression of Tamm-Horsfall protein, osteopontin, bikunin, superoxide dismutase and malondialdehyde was determined by means of indirect two-stage streptavidin-biotin method with the control of reaction specificity. It was determined, that the expression of Tamm-Horsfall protein, osteopontin, bikunin, superoxide dismutase and malondialdehyde in conditions of KSD modelling was exposed to considerable alterations in relation to the healthy rats. On this background, long-term continuous injection of sodium citrate and а-tocopherol acetate was accompanied by the normalization of expression of intrarenal inhibitors of crystallization and oxidative stress markers of nephrocytes.
Key words: kidney stone disease, intrarenal inhibitors of crystallization, oxidative stress markers, sodium citrate, а-tocopherol acetate.
Введение
Согласно современным представлениям, важнейшую роль в процессе камнеобразования при мочекаменной болезни (МКБ) играют качественные и количественные изменения экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристалли-
зации, таких как протеин Тамма-Хорсфалла (ПТХ), остеопонтин (ОПН) и бикунин (БИК), в результате которых они теряют свои ингиби-рующие свойства или даже становятся стимуляторами литогенеза [1-4]. Кроме того, сегодня не подлежит сомнению деструктивная роль
процесса свободнорадикального окисления (СРО) при МКБ, приводящего к формированию первичного очага литогенеза с последующей преципитацией на нем кристаллического материала из мочи [5-7]. Гистохимическими маркерами процесса СРО могут служить уровень экспрессии в почках малонового диаль-дегида (МДА) и супероксиддисмутазы (СОД), роль которых в активации и сдерживании СРО хорошо известна [5-7].
В этой связи изменения параметров вну-трипочечной экспрессии указанных веществ могут стать важным индикатором эффективности того или иного метода фармакологической коррекции мочекаменной болезни. Учитывая данное обстоятельство, нас заинтересовала возможность оценки влияния некоторых известных антилитогенных средств на уровень экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и маркеров оксидативного стресса в почечной ткани.
Цель исследования
Изучить влияние натрия цитрата и а-токо-ферола ацетата на уровень экспрессии протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина, бикунина, малонового диальдегида и супероксиддисмута-зы в почечной ткани крыс при экспериментальной мочекаменной болезни.
Материал и методы
Эксперименты проведены на 60 самцах крыс сток Вистар возрастом 2-3 месяца и массой от 250-300 граммов, выращенных в питомнике ГУ НИИ цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Исследования выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ ЕЕС) и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные были разделены поровну на четыре группы: группа интактных крыс - Гинт (42 дня содержания в стандартных лабораторных условиях без моделирования МКБ и без введения исследуемых препаратов), контрольная - Гк (42 дня моделирования МКБ), группа лечения натрия цитратом - Гнц (42 дня моделирования МКБ + ежедневное введение натрия цитрата с 22-го по 42-й дни эксперимента), группа лечения а-токоферола ацетатом - Гта (42 дня моделирования МКБ + ежедневное введение а-токоферола ацетата с 22-го по 42-й дни эксперимента).
Экспериментальная мочекаменная болезнь моделировалась в соответствии с общепринятой этиленгликолевой моделью, согласно которой животные ежедневно в свободном доступе получали в виде питья 1%-ный раствор этилен-26
гликоля [8]. а-токоферола ацетат - классический антиоксидант, используемый в лечении МКБ [7]. Препарат вводился внутрь через зонд в виде масляного раствора в дозе 300 мг/кг. Натрия цитрат - средство, обладающее способностью хелатировать в моче литогенные ионы и/или их нерастворимые соли [9]. Вводился внутрь через зонд в дозе 200 мг/кг.
По завершении шести недель эксперимента крысы подвергались декапитации под полным эфирным наркозом, после чего у них изымались почки для проведения иммуногистохими-ческого исследования.
Определение экспрессии протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина и бикунина, а также супероксиддисмутазы и малонового диальдегида проводилось при помощи непрямого двухшагового стрептавидин-биотинового метода с контролем специфичности реакции [10]. После стандартной процедуры депара-финизации и регидратации выполнялось блокирование эндогенной пероксидазы, согласно рекомендациям производителя антител (Santa Cruz, США).
Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1. Степень экспрессии оценивали полуколичественным методом с использованием критерия а2 по интенсивности окрашивания ДАБ с применением программы анализа изображений ImageJ 1.43. Для удобства интерпретации результатов полученные данные рассчитывали по формуле:
100 XD
Е% = 100--
256
где: E% - процент экспрессии;
256 - максимум интенсивности окраски поля среза.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных экспериментов было установлено, что у крыс Гинт экспрессия протеина Тамма-Хорсфалла отмечалась преимущественно в цитоплазме и на апикальных мембранах клеток эпителия дистальных канальцев коркового вещества и толстого восходящего отдела петли Генле наружной зоны мозгового вещества. Экспрессия остеопонтина фиксировалась главным образом в цитоплазме эпите-лиоцитов канальцев нефрона, собирательных трубок, переходного эпителия чашечно-ло-ханочной системы. Кроме того, наблюдалась умеренно выраженная экспрессия бикунина цитоплазменной локализации в эпителии канальцев нефрона и собирательных трубок и отсутствие таковой в интерстиции. Количествен-
ные показатели экспрессии ПТХ, ОПН, БИК, а также МДА и СОД представлены в таблице 1.
На этом фоне в условиях моделирования МКБ у крыс контрольной группы наблюдались довольно существенные изменения качественных и количественных показателей экспрессии ПТХ, ОПН, БИК, МДА и СОД. Оказалось, что дополнительно отмечалась экспрессия ПТХ в интерстиции почечного сосочка, максимально выраженная в области основания и средней трети, т.е. в местах преимущественного отложения кальциевых депозитов. При этом после шести недель применения этиленгликоля степень экспрессии ПТХ относительно интактных крыс достоверно увеличилась на 4,6% (табл. 1). Топологической разницы в экспрессии ОПН относительно интактных животных в контроле заболевания выявлено не было. Однако количественно в процессе длительного употребления этиленгликоля экспрессия ОПН по сравнению с показателями интактных животных ослаблялась на 3,2% (табл. 1). В почках крыс контрольной группы при схожей в целом локализации дополнительно выявлялась экспрессия БИК в интерстиции почечного сосочка, т.е. в месте преимущественного отложения кальциевых депозитов. При этом уровень экспрессии БИК в количественном отношении незначительно превышал показатели интактной группы (табл. 1).
Уровень экспрессии МДА в баллах в группе Г увеличился с 2+ в норме до 3+ (табл. 1). В процентах зафиксированное увеличение составило 3,5%. На этом фоне уровень экспрессии СОД, напротив, снижался. Так, если у интактных крыс данный показатель оценивался в баллах как 3+, то по истечении шести недель моделирования заболевания таковой снизился до 2+. В количественном пересчете регресс степени экспрессии СОД составил 5,8%.
Проведенные в группе Гнц эксперименты показали, что в результате курса применения натрия цитрата происходила нормализация экспрессии ингибиторов кристаллизации. Так, топология экспрессии ПТХ, признаки которой в контроле заболевания выявлялись в интерсти-ции почечного сосочка, т.е. в месте преимущественного отложения кальциевых депозитов, у пролеченных натрия цитратом крыс полностью соответствовала интактной группе: цитоплазма и апикальные мембраны клеток эпителия дистальных канальцев коркового вещества и толстого восходящего отдела петли Генле наружной зоны мозгового вещества без признаков интерстициальной локализации. Вместе с тем топологической разницы в экспрессии ОПН и БИК между группами выявлено не было.
Несмотря на это, количественные характеристики экспрессии всех описываемых протеинов по итогам курса лечения претерпевали существенные изменения. Как следует из таблицы 1, уровень экспрессии ПТХ понизился относительно контроля с 3+ баллов до 2+ баллов, что в арифметической интерпретации составило 3,2%. Экспрессия ОПН, наоборот, усиливалась с 2+ баллов до 3+ баллов, т.е. на 2,5%, а экспрессия БИК - ослабилась на 3,4%.
Таким образом, картина экспрессии вну-трипочечных ингибиторов кристаллизации в результате трехнедельного введения натрия цитрата в целом соответствовала показателям здоровых животных.
Изучение влияния длительного введения а-токоферола ацетата на показатели экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и маркеров оксидативного повреждения нефроцитов позволило установить, что под воздействием испытуемого препарата происходили характерные изменения экспрессии ПТХ, ОПН и БИК. Оказалось, что экспрессия
Таблица 1
Показатели экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и маркеров оксидативного стресса в почечной ткани
Группы животных
Маркеры МКБ Г инт Г к Г н.ц. Г т.а.
Степень экспрессии
Баллы % Баллы % Баллы % Баллы %
Протеин Тамма-Хорс- фалла 2+ 49,8 3+ 54,4 2+ 51,2 2+ 51,1
Остеопонтин 2+ 50,0 1+ 46,8 2+ 49,3 2+ 51,2
Бикунин 2+ 50,6 2+ 52,0 2+ 48,6 1+ 47,9
Малоновый диальдегид 2+ 48,0 3+ 51,5 2+ 47,6 2+ 47,4
Супероксид-дисмутаза 3+ 52,5 2+ 46,8 3+ 51,0 3+ 54,7
ПТХ в почках крыс Г выявлялась в цитоплазме и на апикальных мембранах эпителиоцитов дистальных канальцев и толстого восходящего отдела петли Генле наружной зоны мозгового вещества, что полностью соответствовало топологии интактных крыс. Важно, что интерстици-альной локализации экспрессии ПТХ в результате проведенного лечения не выявлялось, хотя в контроле заболевания она фиксировалась, что являлось характерным иммуногистохими-ческим признаком патологии. Визуальной топологической разницы экспрессии ОПН межДУ группами не наблюдалось. В отношении экспрессии БИК было установлено, что в почках крыс Г таковая присутствует в эпителии канальцев нефрона и собирательных трубок, а интерстициальная локализация в области почечного сосочка, имевшая место в контроле заболевания, не обнаруживалась.
Количественная оценка изменений экспрессии вышеназванных протеинов, представленная в таблице 1, выявила ослабление экспрессии ПТХ с 3+ баллов в контроле до 2+ баллов в почках крыс группы Г , что в процентном измерении составило 3,3%. Параллельно с 1+ балла в контроле до 2+ баллов после курса применения а-токоферола ацетата (на 4,4%) усиливалась экспрессия ОПН, а также с 2+ баллов у больных животных до 1+ балла у крыс, которым длительно вводился а-токоферола ацетат, уменьшалась степень экспрессии БИК. В процентах это снижение равнялось 4,1%. Зафиксированные изменения привели к тому, что уровень экспрессии ПТХ и ОПН после курса антиоксидантной терапии соответствовал таковому у здоровых животных, а аналогичный показатель для БИК даже уступал интактным цифрам 2,7%.
Кроме того, у крыс Г уровень экспрессии МДА относительно контроля заболевания уменьшился с 3+ баллов до 2+ баллов, что в количественном выражении составило 4,1% (табл. 1). Аналогичный показатель для СОД увеличился с 2+ баллов в контроле до 3+ баллов в группе лечения, что составило 5,7%. Такие изменения реализовались в том, что степень экспрессии МДА в точности соответствовала значению здоровых крыс, а экспрессия СОД даже превосходила таковое на 2,2% (табл. 1).
Таким образом, длительное непрерывное введение а-токоферола ацетата сопровождалось нормализацией экспрессии внутрипочеч-ных ингибиторов кристаллизации и маркеров оксидативного повреждения нефроцитов.
Суммируя вышеизложенное, отметим, что качественные и количественные характеристики экспрессии ПТХ, ОПН, БИК, МДА и СОД в условиях моделирования МКБ были подвержены существенным изменениям относительно здоровых крыс. Эти изменения могли носить как патологический, так и компенсаторный харак-
тер. Тем не менее и в том, и в другом случае их можно признать маркерами развития нефро-литиаза. При этом трехнедельное применение натрия цитрата и а-токоферола ацетата привело к нормализации показателей экспрессии вышеуказанных веществ. Как известно, натрия цитрат - хелатирующее средство, а а-токофе-рола ацетат - прямой неферментный антиок-сидант [7,9]. У этих веществ сегодня доказаны антилитогенные свойства. Оба влияют на основные движущие силы кристаллизации: натрия цитрат - на пересыщение мочи ионами кальция, а-токоферола ацетат - на оксидативное повреждение нефротелия [7, 9]. Не исключено, что эти вещества, таргетно корригируя соответствующие звенья патогенеза нефролитиаза, значительно ослабляли тяжесть протекания патологии, что нивелировало условия для изменений картины экспрессии ПТХ, ОПН, БИК, МДА и СОД, приводя ее в норму. Разумеется, особенности модуляции экспрессии маркеров нефролитиаза при МКБ и в условиях ее лечения нуждаются в более тщательном изучении. Однако по результатам данного исследования с определенной долей уверенности можно полагать, что качественные и количественные изменения экспрессии указанных белков могут являться весьма информативным показателем для оценки эффективности фармакологического лечения мочекаменной болезни.
Заключение
Трехнедельное применение натрия цитрата и а-токоферола ацетата при экспериментальной мочекаменной болезни приводит к нормализации качественных и количественных показателей экспрессии ПТХ, ОПН, БИК, МДА и СОД, существенно измененных в условиях заболевания.
Список литературы:
1. Зверев Я.Ф., Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Лампатов В.В. Модуляторы окса-латного нефролитиаза. Ингибиторы кристаллизации. Нефрология. 2010; 14 (1): 29-49.
2. Garimella PS, Sarnak MJ. Uromodulin in kidney health and disease. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017; 2(2): 136-142.
3. Yasui T, Okada A, Hamamoto S et. al. Pathophysiology-based treatment of urolithiasis. Int J Urol. 2017; 24(1): 32-38.
4. Igci M, Arslan A, Igci YZ et. al. Bikunin and a1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) gene mutational screening in patients with kidney stones: a case-control study. Scand J Urol Nephrol. 2010; 44(6): 413419.
5. Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф. и др. Оксидативный стресс как один
из факторов повреждения на ранних сроках экспериментального нефролити-аза. Морфолопя. 2011; 5(1): 33-37.
6. Мотина Н.В., Зверев Я.Ф., Лепилов А.В. и др. Оксидативное повреждение почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе. Нефрология. 2010; 14(1): 68-72.
7. Жариков А.Ю., Талалаева О.С., Зверев Я.Ф. и др. Роль антиоксидантной терапии в фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза. Нефрология. 2010; 14(4): 53-58.
8. Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Жариков А.Ю. Методические подходы к изучению функции почек в эксперименте на животных. Нефрология. 2009; 13(3): 52-62.
9. Marangella M. Use of citrate in patients with nephrolithiasis. G Ital Nefrol. 2017; 34(4): 51-60.
10. Гуревич Л.Е., Исаков В.А. Использование в иммуногистохимических исследованиях метода восстановления антигенной специфичности воздействием микроволн на ткани, фиксированные формалином и заключенные в парафин. Архив патологии. 1999; 2: 48-50.
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Жариков Александр Юрьевич, д.б.н., доцент, заведующий кафедрой фармакологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656056, г. Барнаул, ул. Папанинцев, д. 126. Тел.: (3852) 24-18-59, 56-68-91. E-mail: zharikov@agmu.ru
