Фармакологическая коррекция уровня перекисного окисления липидов при экспериментальной эндотелиальной дисфункции Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 3

УДК 577.115:616.018.74-008.6-085-092.9

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ УРОВНЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ

© Маль Г.С.* 1, Артюшкова Е.Б.2, Григорьева Т.М.3, Каплина К.Р.2,

Каплин А.Н.4, Гладченко М.П.2, Заугольникова Н.С.5

1 Кафедра фармакологии, 2 научно-исследовательский институт экологической медицины, 3 кафедра общей и биоорганической химии, 4 кафедра патологической анатомии, 5 кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета, Курск

E-mail: [email protected]

В настоящее время коррекция эндотелиальной дисфункции является важнейшим компонентом терапевтического лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Применяемые препараты, используемые для патогенетического лечения, обладают широким спектром протективных эффектов, которые могут быть усилены комбинацией с ранее известным лекарственным средством магния оротат. В эксперименте на крысах (n = 60) нами была проведена оценка влияния препаратов розувастатин (Розарт) в дозировках 0,33 мг/кг/сут и 0,66 мг/кг/сут, магния оротат 100 мг/кг/сут и их комбинаций на уровень перекисных радикалов в сыворотке крови крыс при моделировании эндотелиальной дисфункции. В проведенном исследовании было отмечено снижение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) до значений интактной группы животных при комбинированной терапии данными препаратами с меньшей дозой розуваста-тина.

Ключевые слова: сердечно-сосудистые заболевания, эндотелиальная дисфункция, перекисные радикалы, розува-статин, магния оротат.

PHARMACOLOGICAL CORRECTION OF LIPID PEROXIDATION LEVEL IN EXPERIMENTAL ENDOTHELIAL DYSFUNCTION Mal G.S.1, Artyushkova E.B.2, Grigoreva T.M.3, Kaplina K.R.2, Kaplin A.N.4, Gladchenko M.P.2, Zaugolnikova N.S.5

1 Department of Pharmacology, 2 Research Institute of Environmental Medicine, 3 Department of General and Bioorganic Chemistry, 4 Department of Pathological Anatomy, 5 Department of Pathophysiology

of Kursk State Medical University, Kursk

The correction of endothelial dysfunction is currently the most important component of cardiovascular therapy. The drugs used for pathogenetic treatment have a wide range of protective effects that can be enhanced by combining with the well-known drug Magnesium Orotate. We assessed the impact of 0.33 mg/kg/day and 0.66 mg/kg/day Rosuvastatin (Rozart) and 100 mg/kg/day Magnesium Orotate and their combined administration on lipid peroxidation level in rats’ serum in experimental endothelial dysfunction. The study revealed that the combined use of low-dose Rosuvastatin and Magnesium can decrease lipid peroxidation level in rats’ serum.

Keywords: endothelial dysfunction, cardiovascular disease, Rosuvastatin, Magnesium Orotate.

По данным Росстата в 2013 году смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в Российской Федерации составила 55% от общего числа летальных исходов (525431 человек) среди трудоспособного населения [14].

В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, атеросклероза и многих других патологий одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия [2, 3]. При этих заболеваниях он предстает в роли первоочередного органа-мишени, поскольку эндотелиальная выстилка сосудов участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции. С современных позиций ключевым звеном в патогенезе ССЗ считается эндотелиальная дисфункция с дисбалансом между основными функциями эндотелия: вазодилата-

цией и вазоконстрикцией, ингибированием и содействием пролиферации, антитромботической и протромботической, антиокислительной и проокислительной активностью [4, 5, 9, 16].

Эндотелий вовлекается в патологический процесс на наиболее ранних стадиях. При этом интенсивная продукция перекисных радикалов нарушает баланс между защитными и повреждающими воздействиями на стенку сосуда. Свободные радикалы являются своеобразной ловушкой для молекул оксида азота (NO), блокируя его физиологическое воздействие на сосуды [7, 8].

Оксид азота - сигнальная молекула, которая осуществляет межклеточные взаимодействия и регулирует перекисное окисление липидов. В физиологических условиях оксид азота выступает в роли антиоксиданта, тормозит радикальные окислительные реакции, связываясь со свободными ионами двухвалентного железа, входящими в со-

79

Медико-биологические науки

став гема. При гиперпродукции активных форм кислорода происходит окисление липопротеидов, что способствует повышению синтеза кавеолина-1 и приводит к снижению образования оксида азота эндотелием [4, 7].

При активации свободнорадикальной активности происходит реакция супероксид-аниона с оксидом азота и образуется пероксинитрит, который служит пусковым фактором в развитии воспаления и повреждения тканей, по токсичности значительно превосходит оксид азота и лишает его биологического действия как антиоксиданта. Свое действие пероксинитрит реализует за счет инициации перекисного окисления липидов в мембранах и липопротеинах [6, 9, 15].

Распространенность основных факторов риска развития сердечно-сосудистых патологий и высокая степень смертности или инвалидизации при представленных нозологических единицах требуют активного изучения способов профилактики и лечения.

Современные методы лечения, основанные на применении статинов и цитопротекторов, получили большое распространение, но они не лишены недостатков в виде непереносимости больших доз препаратов [1, 11, 12]. В настоящее время является перспективным использование статинов в комбинации с макро- и микроэлементами, которые участвуют в метаболических реакциях [10]. Одним из таких макроэлементов является магний. Магний функционирует в организме как кофактор в более чем 300 известных ферментативных реакциях. Он обеспечивает гидролиз АТФ, регулирует гликолиз, уменьшая накопление лактата, участвует в окислении жирных кислот и активации аминокислот [10, 17, 18, 19].

Целью данного исследования является изучение влияния применения препарата Магнерот® (магния оротат) в дозе 100 мг/кг/сут при монотерапии и комбинированном применении с препаратом Розарт® (3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзимА-редуктазы) в дозах 0,33 мг/кг/сут и 0,66 мг/кг/сут внутрижелудочно на интенсивность перекисного окисления липидов сыворотки крови крыс при экспериментальной эндотелиальной дисфункции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 120 белых кры-сах-самцах линии Wistar массой 350-450 г, которые были разделены на 12 групп по 10 крыс в каждой группе:

группа № 1 - интактные животные;

группа № 2 - контрольные животные с моделированной эндотелиальной дисфункцией;

+

+

+

Розувастатин Розувастатин Розувастатин Розувастатин + Магнерот + Магнерот + Магнерот

группа № 3 - контрольные +

0,33 мг/кг в течение 7 суток;

группа № 4 - контрольные 0,33 мг/кг - 42 суток;

группа № 5 - контрольные 0,66 мг/кг - 7 суток;

группа № 6 - контрольные 0,66 мг/кг - 42 суток;

группа № 7 - контрольные 100 мг/кг - 7 суток;

группа № 8 - контрольные

100 мг/кг - 42 суток;

группа № 9 - контрольные

100 мг/кг + Розувастатин 0,33 мг/кг - 7 суток;

группа № 10 - контрольные + Магнерот 100 мг/кг + Розувастатин 0,33 мг/кг - 42 суток;

группа № 11 - контрольные + Магнерот 100 мг/кг + Розувастатин 0,66 мг/кг - 7 суток;

группа № 12 - контрольные +Магнерот

100 мг/кг + Розувастатин 0,66 мг/кг - 42 суток.

В экспериментальные группы были включены животные, прошедшие карантинный режим вивария Курского государственного медицинского

университета, содержащиеся при световом режиме: 12 ч/12 ч светлый и темный цикл. Для получения статистически достоверных результатов экспериментальные группы животных были сформированы путем рандомизации со стратификацией по массе и проводимым манипуляциям. Все исследования проводились с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург, 1986), и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).

Операции и все манипуляции с крысами проводились в условиях общего обезболивания путем внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг животного.

Контрольной группе животных моделировали гиперлипидемию на фоне развития экспериментальной эндотелиальной дисфункции. С целью моделирования эндотелиальной дисфункции вводился внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут в течение 7 дней ^нитро^-аргинин метиловый эфир (L-NAME - неселективный блокатор NO-синтазы) [13].

Моделирование гиперлипидемии проводилось в соответствии с рекомендациями по изучению специфической активности новых веществ гипо-липидемического действия и/или антиатеросклеротического действия путем однократного внутрибрюшинного введения поверхностно-активного вещества Твин-80 в дозе 200 мг/100 г веса за 24 часа до выведения животных из эксперимента [6].

С целью предупреждения развития экспериментальной эндотелиальной дисфункции и ги-

80

Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 3

перлипидемии экспериментальные животные получали статин 4-го поколения Розарт®

(3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзимА-

редуктазы) производства «Актавис Лтд» Мальта, при монотерапии и комбинированном применении с препаратом Магнерот® в дозе

0,33 мг/кг/сут и в дозе 0,66 мг/кг/сут внутрижелудочно в течение 10 суток перед моделированием гиперлипидемии.

Препарат магния Магнерот® (магния оротат) производства «Вервагфарма» Германия вводили при монотерапии и комбинированном применении с препаратом Розарт® в дозе 100 мг/кг/сут внутрижелудочно в течении 10 суток предварительно введению Твин-80.

Интактной группе (I группа) внутрижелудочно вводили очищенную воду для инъекций из расчета 200 мг/кг/сут.

Расчет доз производили, используя коэффициент пересчета доз с взрослого человека на крыс массой 350-450 г согласно методическим указаниям, содержащимся в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева (2005). Выбор и расчет доз для исследования ги-полипидемической активности производился методом эквивалентного межвидового переноса доз по площади тела с использованием коэффициента пересчета по Freireichetal., 1966.

Исследованные препараты вводились внутрижелудочно при помощи металлического атрав-матического зонда ежедневно в утренние часы один раз в сутки в объеме, рассчитанном исходя из массы тела крысы.

Объектом исследования служила сыворотка крови. Взятие крови проводили в количестве 5 мл. После свертывания кровь центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин для уплотнения сгустка. Полученную сыворотку в количестве 1 мл сливали в чистую пробирку и смешивали с 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:9. Второе центрифугирование проводили в течение 20 мин при 5000 об/мин для окончательного осветления пробы. Для исследования отбирали верхний слой сыворотки.

Анализ проводили на приборе биохемилюми-нометр БХЛ-06. Использовалась инструментальная методика: «Определение перекисного окисления липидов в биологических субстратах», 1991 г., разработанная НИЦ «Биоавтоматика» г. Нижний Новгород.

Исследовали индуцированную Fe2+ хемилюминесценцию сыворотки крови. Метод индуцирования хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа основан на каталитическом разложении перекиси ионами металлов с пере-

менной валентностью. В эксперименте определяли светосумму за 60 сек (S), величина которой коррелирует с интенсивностью свободнорадикальных процессов, и максимум быстрой вспышки (Imax), свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов.

Уровень ПОЛ оценивался по изменению в крови лабораторных животных значений максимальной интенсивности хемилюминесценции и значения светосуммы.

При статистической обработке данных в программе Microsoft Excel 2010 рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Статистические различия между экспериментальными группами оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Оценку влияния применения розувастатина, магния оротата и их комбинации осуществляли путем сравнения интенсивности хемилюминесценции сыворотки крови. При моделировании гипертензии существенно повышались показатели максимальной интенсивности хемилюминесценции проб и светосуммы по сравнению с результатами интактной группы животных на 17,29% и 19,95% соответственно (табл. 1).

Введение розувастатина в дозе 0,33 мг/кг в течение 7 и 42 суток не привело к достоверному снижению исследуемых показателей, лишь при использовании статина в дозе 0,66 мг/кг значения максимальной интенсивности и светосуммы хемилюминесценции были сопоставимы со значениями интактной группы лабораторных животных. При проведении терапии препаратом Маг-нерот значения исследуемых показателей, сравнимые с интактной группой, были получены только при длительном применении (в течение 42 суток). Необходимо отметить, что комбинированное применение розувастатина в дозе 0,33 мг/кг и магния оротата в течение 42 суток также привело к достоверному снижению уровней прооксидантов сыворотки крови крыс до значений интактной группы.

Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что при применении розувастатина в дозе 10 мг, значения максимальной интенсивности хемилюминесценции сыворотки крови сопоставимы со значениями в группе интактных животных. При использовании магния оротата уровень максимальной интенсивности хемилюминесценции достигает значений интактной группы только при длительном приеме в течение 42 суток. При изучении действия комбинации препаратов розувастатин и магнерот можно отметить,

81

Медико-биологические науки

Таблица 1

Максимальная интенсивность хемилюминесценции (I max) и значение светосуммы (S) сыворотки крови экспериментальных животных на фоне моделирования эндотелиальной дисфункции и при фармакологической коррекции статинами, магния оротатом и их комбинацией

№ группы Эксперимент 1 max (М ± m) мВ S (М ± m) мВ

1 интактные животные 556,2±8,5 9427±128

2 контрольные животные с моделированной эндотелиальной дисфункцией 652,4±6,2# 11307±49#

3 контрольные + Розувастатин 0,33 мг/кг - 7 суток 662,3±9,8# 11295±232#

4 контрольные + Розувастатин 0,33 мг/кг - 42 суток 659,8±9,7# 11359±241#

5 контрольные + Розувастатин 0,66 мг/кг - 7 суток 541,3±9,6* 9186±95*

6 контрольные + Розувастатин 0,66 мг/кг - 42 суток 551,9±11,5* 9581±108*

7 контрольные + Магнерот 100 мг/кг - 7 суток 656,2±8,9# 11535±126#

8 контрольные + Магнерот 100 мг/кг - 42 суток 562,5±9,6* 9157±133*

9 контрольные + Магнерот 100 мг/кг + Розувастатин 0,33 мг/кг - 7 суток 650,0±6,3# 10943±179#

10 контрольные + Магнерот 100 мг/кг + Розувастатин 0,33 мг/кг - 42 суток 542,8±13,9* 9447±172*

11 контрольные + Магнерот 100 мг/кг + Розувастатин 0,66 мг/кг - 7 суток 557,2±4,4* 10105±224*

12 контрольные + Магнерот 100 мг/кг + Розувастатин 0,66 мг/кг - 42 суток. 565,6±6,4* 9626±77*

Примечание: М - среднее значение, ± m - ошибка среднего, * - при р<0,05 по сравнению с контролем, # - при р < 0,05 по сравнению с интактными животными.

что положительный эффект наблюдается уже при использовании статина в дозе 5 мг в течение 42 суток.

Данные эксперимента при определении светосуммы хемилюминесценции коррелируют со значениями максимальной интенсивности для соответствующих групп животных.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Моделирование эндотелиальной дисфункции достоверно повышает интенсивность хемилюминесценции сыворотки крови крыс по сравнению с группой интактных животных.

2. При монотерапии препаратом Розарт в дозе

0. 66 мг/кг наблюдается статистически достоверное снижение интенсивности хемилюминесценции до уровня интактной группы животных.

3. При комбинированном применении препаратов Розарт и Магнерот® достоверное снижение интенсивности хемилюминесценции до уровня интактной группы животных проявляется уже при дозе розувастатина 0,33 мг/кг при длительном применении (42 суток).

ЛИТЕРАТУРА

1. Артюшкова Е.Б., Маль Г.С., Хорунжая О.А., Крюков А.А., Гладченко М.П., Артюшкова Е.В., Тата-ренкова И.А., Заугольникова Н.С. Фармакологическая коррекция экспериментальной гиперлипиде-

мии комбинированным применением препаратов магния оротата и розувастатина // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2015. -№ 1 - С. 72-77.

2. Бувальцев В.И. Дисфункция эндотелия как новая концепция профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний // Международный медицинский журнал - 2001. - № 3 - С. 9-14.

3. Визир В.А., Березин А.Е. Роль эндотелиальной дисфункции в формировании и прогрессировании артериальной гипертензии. Прогностическое значение и перспективы лечения // Укр. мед. часопис. - 2000. - № 4. - С. 23-33.

4. Воробьева Е.Н., Шумахер Г.И., Осипова И.В. Роль дисфункции эндотелия в патогенезе атеросклероза // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2006. - № 5(6). - С. 129-136.

5. Долженкова Т.В., Якушев В.И., Покровский M..В., Покровская Т.Г., Бесхмельницына Е.А., Гуды-рев О. С., Корокин М.В., Белоус А.С. Дозозависимые противовоспалительные, эндотелиопротек-тивные, кардиопротективные эффекты аторваста-тина // Курск. науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2010. - № 3. - С. 26-31.

6. Зотова И.В., Затейщиков Д.А., Сидоренко Б.А. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза // Кардиология. 2002. - № 4. - С. 57-67.

7. Коркушко О.В., Лишневская В.Ю. Эндотелиальная дисфункция // Кровообіг та гемостаз. - 2003. -№ 2. - С. 4-15.

82

Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 3

8. Кремец К.Г. Эндотелиальная дисфункция и ее роль в патогенезе атеросклероза // Практическая ангиология. - 2009. - № 7(26). - С. 35-36.

9. Лупач Н.М., Хлудеева Е.А., Лукьянов П.А. Мат-риксные металлопротеиназы, оксидантный статус и дисфункция эндотелия с гиперхолестринемией у пациентов с различными формами ишемической болезни сердца // Российский медицинский журнал. - 2010. - № 4. - С. 71-74.

10. Морозова Т.Е., Дурнецова О.С. Препараты магния в кардиологической практике // Мед. науч.-практ. журн. «Лечащий врач». - 2014. - № 4. - С. 98-101.

11. Омельяненко М.Г., Суховей Н.А., Назаров С.Б., Плеханов В.Г. Клиническое значение эндотелиальной дисфункции при остром коронарном синдроме без подъема сегмента ST у лиц в возрасте до 55 лет // Рос. кардиол. журн. - 2003. - № 4(42). -

С. 36-40.

12. Пименов Л.Т., Шпицин А.Н. Клинические и метаболические аспекты обмена магния у больных ишемической болезнью сердца // Курск. науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2010. -№ 1. - С. 71-75.

13. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита окси-

да азота в эксперименте // Российский журнал иммунологии. - 2006. - Т. 96. - С. 60-61.

14. Российский статистический ежегодник, 2014: стат. сб. / Федер. служба гос. статистики (Росстат); [редкол. Э.Ф. Баранов и др.]. - Офиц. изд. - М., 2014. - 89 с.

15. Титов В.Н. Общность атеросклероза и воспаления: специфичность атеросклероза как воспалительного процесса (гипотеза) // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 4. - С. 310.

16. Allison B.R., Amy D.G. Atherosclerosis: immune and inflammatory aspects // Journal of investigative medicine. - 2006. - Vol. 54, N 3. - P. 123-131.

17. Jellinek H., Takacs E. Course of the progression of experimentally induced arteriosclerotic vessel wal changes after treatment with magnesium orotate [in German] // Arzneimittelforschung. - 2000. - Vol. 50, N 12. - P. 1071-1077.

18. Liao F., Folsom A., Brancati F. Is low magnesium concentration a risk factor for coronary heart disease? The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study // Am Heart J. - 1998. - Vol. 136, N 3. -P. 480-490.

19. Maier J.A. Low magnesium and atherosclerosis: an evidence-based // Molecular Aspects of Medicine. -2003. - Vol. 24, N 1-3. - P. 3-9.

83