Фармакодинамическое моделирование in vitro клинической эффективности флюдарабина при резистентных формах хронического лимфолейкоза Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»



КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ... 25

УДК 616-006.446.2-036.12:615.277.3.015.46:616-092.4 А.Н. Иншаков1, Е.В. Катаева2, Е.В. Трифонова2, А.К. Голенков2 ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ IN VITRO КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФЛЮДАРАБИНА ПРИ РЕЗИСТЕНТНЫХ ФОРМАХ ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА 'РОНЦ им. Н.Н. Блохина, Москва 2МОнИкИ им. М.Ф. Владимирского, Москва

Контактная информация:

Иншаков Андрей Николаевич, научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей.

адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел.: +7(495)-392-26-16, моб.: +7(926)-179-04-20 e-mail: an-inshakov@yandex. ru

Статья поступила 02.06.2009, принята к печати 07.10.2009.

Резюме

Методом МТТ-теста in vitro определяли чувствительность к флюдарабину опухолевых лимфоцитов 14 первичных и 49 резистентных больных хроническим лимфолейкозом. Выявлено, что 61,2% резистентных больных чувствительны к препарату in vitro. Обнаружено, что лучшему клиническому эффекту соответствуют более низкие значения LD50 при ПР 0,61±0,21 мкг/мл, ЧР 1,69±0,56 мкг/мл, СБ 3,5±1,3 мкг/мл и ПБ 10,21±6,5 мкг/мл. Анализ клинического ответа показал, что в группе чувствительных in vitm больных 82,4 % (n=17) ответивших на лечение, а в группе не чувствительных больных клиническая эффективность была достоверно ниже: 37,5 %(n=16) ответивших на лечение флюдарабином (р<0,05).

Ключевые слова: хронический лимфолейкоз, МТТ-тест, резистентность, флюдарабин.

A.N. Inshakov1, E.V. Kataeva2, E.V. Trifonovd2, A.K. Golenkov2

FLUDARABINE PHARMACODYNAMIC IN VITRO

AND ITS EFFECT IN PATIENTS

WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA

'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

2M.F. Vladimirsky Clinical Institute of Moscow Region, Moscow

Abstract

We have used MTT assay to examine the effect of Fludarabine on lymphocytes of patients with chronic lymphocytic leukemia. 14 non-treated and 49 resistant patients with chronic lymphocytic leukemia were enrolled in this study. 61,2 % of patients responded to Fludarabine.

Here, we show that the low IC50 is more effective in treatment of disease: IC50 of the complete remission was 0,61±0,21 mkg/ml, the partial remission - 1,69±0,56 mkg/ml, the stabilization of disease - 3,5±1,3 mkg/ml, the progression of disease - 10,21±6,5 mkg/ml. In case of sensitivity toward Fludarabine, observed in vitro test 82,4 % patients (n=17) responded to treatment and only 37,5 % (n=16) patients responded in resistant group of patients. The data are statistically significant.

Key words: chronic lymphocytic leukaemia, MTT-assay, resistance, fludarabine.

Введение

В последнее время в гематологии уделяется большое внимание проблеме лекарственной устойчивости, так как именно с этим связана неэффективность программной ХТ. В настоящее время данная проблема разрабатывается в следующих направлениях:

— изучение клинической эффективности новых противоопухолевых препаратов с различными механизмами действия;

— создание более эффективных химиотерапевтических программ на основе этих препаратов;

- высокодозная терапия с пересадкой аутологичных и аллогенных стволовых кроветворных клеток;

- применение модуляторов резистентности

- препаратов, обладающих способностью подавлять механизмы, ответственные за развитие устойчивости.

Определение чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам при лейкозах in vitro так

же можно рассматривать как актуальное направление в преодолении устойчивости опухолевых клеток к цитостатикам. Применение пуриновых аналогов открыло новый этап в лечении хронического лимфолейкоза (ХЛЛ).

Появилась реальная возможность увеличить число полных ремиссий и выживаемость без прогрессии заболевания у первичных больных по сравнению с другими препаратами [6].

Необходимо учитывать, что 22-30 % первичных больных рефрактерны к флюдарабину [4]. Среди рефрактерных и рецидивных больных результаты лечения флюдарабином хуже, частота достижения полной и частичной ремиссии ниже, чем в группе ранее не леченных пациентов [3].

По данным литературы, исследование чувствительности В-клеток больных ХЛЛ в культуре помогает прогнозировать ответ на терапию флюдара-бином [1; 2; 5; 6]. В связи с этим, представляется актуальным исследовать чувствительность В-клеток больных ХЛЛ к флюдарабину и сопоставить клинические и лабораторные данные.

Материалы и методы

В исследовании представлены результаты терапии бЗ больных ХЛЛ, из них женщин - 2б, мужчин -37 в возрасте 43-78 лет (средний возраст 59,5 года). Из бЗ исследуемых 49 проводилось предшествующее лечение программной полихимиотерапией. Вследствие этого у них развилась резистентность к проводимому ранее лечению. Резистентными считались больные, не ответившие на 2 курса ХТ. Исследование чувствительности опухолевых лимфоцитов к флюдара-бину первичным больным проводили до лечения, а получавшим ранее терапию - не менее чем через 2 мес. после последнего курса. Выделение мононукле-арных клеток из цельной гепаринизированной крови осуществляли на градиенте плотности Ficoll-Paque или фиколл-верографин по общепринятому методу Bojum. Для постановки MTT-теста выделенные из периферической крови клетки раскапывали в концентрации 2 105 в 180 мкл полной среды RPMI-1640 в 9б-луночные плоскодонные планшеты (Costar, USA). В каждую лунку добавляли 20 мкл исследуемого препарата в 5 концентрациях, каждую концентрацию ставили в триплете, максимальная концентрация в лунке составила 33 мкг/мл с шагом разведения 3.

Флюдарабин (Schering AG, Германия): флакон, содержащий 50 мг лиофилизированного препарата. Разводили 5 мл 0,9%-ного р-ра NaCl до конечной стоковой концентрации 10 мг/мл. Хранили в аликвотах по 0,04 мл при -20 °С до использования. Теоретически рассчитанная терапевтическая концентрация флюдарабина в плазме (ТИК) составила 0,97 мкг/мл.

В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл чистой среды RPMI-1640. В качестве контроля среды использовали лунки, содержащие 180 мкл полной и 20 мкл чистой среды RPMI-1640. Планшеты с клетками инкубировали в течение 9б ч при 37 °С в атмосфере 5 %-ного CO2. Через 96 ч в планшет с клетками добавляли по 20 мкл MTT (концентрации в PBS 5 мг/мл) в каждую лунку и инкубировали 5-6 ч при 37 °С в атмосфере 5%-ного CO2.

После образования синих кристалов формазана планшеты центрифугировали при 2000 об/мин 7-10 мин, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 150-200 мкл ДМСО. Планшеты помещали на 5-7 мин в термостат при температуре 37 °С. Далее планшеты встряхивали на шейкере, после этого интенсивность окрашивания среды измеряли на спектрофотометре «Multiscan» при 1=540-690 нм, за blank принимали лунки, содержащие среду без клеток и препаратов. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток.

Процент живых клеток вычисляли по формуле:

N1

N 0— x 100%, где

0 N 2

— N0 - процент живых клеток;

— N1 - средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат;

— N2 - средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки.

Потом строили график зависимости «доза-эффект» и определяли LD50 (концентрация, которая вызывала гибель 50 % клеток). Клетки опухоли считались чувствительными к препарату, если значение LD50 было меньше ТПК.

Результаты и обсуждение

У 63 больных ХЛЛ было проведено скрининговое исследование чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину МТТ-тестом. По нашим дан-

ным, В-лимфоциты 37 больных (58,7 %) оказались чувствительными, а 26 (41,3 %) - резистентны к флюдарабину. Часть обследованных больных составили ранее не леченные (первичные) 14 пациентов: в этой группе у 12 (85,7 %) опухолевые клетки были чувствительны, у 2 (14,3 %) устойчивы к действию флюдарабина in vitro. У остальных 49 была выявлена клиническая рефрактерность к проводимой ранее ХТ: опухолевые клетки 30 (61,2 %) больных были чувствительны, 19 (38,8 %) устойчивы к действию препарата (рис. 1). Как видно из проведенного скрининга, в группе рефрактерных больных (n=49) больше половины оказались чувствительны к флю-дарабину. Это послужило основанием для изучения противоопухолевого эффекта флюдарабина у преимущественно резистентных больных.

В дальнейшем лечение этим препаратом было проведено 33 больным ХЛЛ, среди которых было 7 первичных, 2б рефрактерных к проводимому ранее лечению. Флюд2арабин назначали в виде монотерапии по 25 мг/м2 в течение 5 дней через 4-недельные интервалы. В зависимости от ответа на лечение больных разделили на две группы: отвечающие и не отвечающие на ХТ. Ответ должен был сохраняться не менее 2 мес. К отвечающим относили больных, достигших полной и частичной ремиссии, к не отвечающим - больных, у которых произошла стабилизация болезни или прогрессирование заболевания.

В результате проведенного лечения:

— у 33 больных ХЛЛ было достигнуто 11 полных (33,3 %) + 9 частичных ремиссий (27,3 %) = в совокупности б1 % ответивших,

— у 10 больных произошла стабилизация (30 %) + у 3 прогрессирование болезни (9,1 %) = не ответившие 39 %.

Результаты сопоставления данных чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину в МТТ-тесте по LD50 у 33 больных с клиническими данными у этих же пациентов представлены на рис. 2. Средняя величина LD50 при полной ремиссии составляла

0,61±0,21 мкг/мл, частичной ремиссии 1,69±0,56 мкг/мл, стабилизации болезни - З,5±1,З мкг/мл и прогрессирование болезни - 10,21±6,5 мкг/мл. Эти данные показывают, что лучшему клиническому эффекту соответствуют более низкие показатели LD50. Были выявлены достоверные различия значений LD50 в группах ПР и СБ (р<0,05), ПР и ПБ (р<0,05), ЧР и Пб (р<0,05). Значение LD50 в группе больных, ответивших на лечение, было достоверно ниже и составило 1,1±0,З мкг/мл. В группе больных, не ответивших на лечение, значение LD50 было достоверно выше 5,1±1,8 мкг/мл (р<0,01; рис. 3).

При рассмотрении фармакодинамических кривых в группах больных, ответивших и не ответивших на лечение флюдарабином, получены следующие результаты. Фармакодинамическая кривая ответивших (ПР+ЧР) расположена более полого и ближе к оси ОХ, на которой отложены значения 5 концентраций флюдарабина, что отражает меньшее количество жизнеспособных клеток, оставшихся после культивирования с противоопухолевым препаратом. Фармакодинамическая кривая больных, не ответивших (СБ+ПБ) на терапию флюдарабином, расположена более круто и в точках 5 концентраций флюдарабина показывает большее количество жизнеспособных клеток. При увеличении концентрации более 11,1 мкг/мл отмечено приближение кривых друг к другу, что свидетельствует об одинаковой жизнеспособности клеток у больных, ответивших и не ответивших на лечение (рис. 4).

КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ... 27

1GG^

8G^

6G^

4G^

2G^

G^

85,71

^ 58,73 Г 1 61,22

Я I I 38,78^""^

Все Ранее нелеченые Рефрактерные обследованные п=14 п=49

больные п=63

□ Резистентные □ Чувствительные

Рис. 1. Скрининг чувствительности к флюдарабину всех обследованных больных.

9

I

3,5+/-1,3

1,69+/-0,56

Рис. 2. Сравнение клинических результатов и величины LD50 у больных ХЛЛ (n=33).

%

4

0,61+/-0,21

ПР

6

б

?4^ &

s 3"

S32Г

5,1+/-1,8

1,1+/-0,3

■

Ответившіе (ПР+ЧР) n=2G Не ответившие (СБ+ПБ) n=13

Р<0,01

Ю 15 2G 2б

концентрация флюдарабина (мкг/мл) ПР+ЧР n=2G СБ+ПБ n=13

Рис. 3. Значения LD50 в группах больных ХЛЛ, ответивших и не ответивших на лечение флюдараби-ном (п=33).

Рис. 4. Фармакодинамические кривые флюдарабина в культуре опухолевых клеток у 33 больных ХЛЛ in vitro.

0 5 10 15 20 25 30

концентрация флюдарабина (мкг/мл)

—♦—Больные, чувствительные in vitro (n=17)

—■— Больные, нечувствительные in vitro (n= 16)

Все больные (n=33)

Рис. 5. Фармакодинамические кривые зависимости жизнеспособности опухолевых клеток от концентрации флюдарабина in vitro.

І2

A 3k

9 2К

5,01+/-5,7

0,47+/-0,4

Чувствительные n=17

Нечувствительные n=16

Р<0,05

Рис. б. Сравнение значений LD50 в группах больных ХЛЛ чувствительных и нечувствительных к флюдарабину in vitro (n=33).

G

б

3G

35

6

б

4

35

G

Таблица 1

Зависимость количества живых клеток от концентрации флюдарабина в MTT-тесте________________________

Клинический ответ Концентрация флюдарабина in vitro, мкг/мл

0,41 1,23 3,7 11,1 33,3

Количество живых клеток, %

ПР+ЧР, n=20 50±3,1 40,6±2,7 34,1±3,0 30,5±3,0 27,9±3,0

СБ+ПБ, n=13 63,2±3,9 51,5±3,6 43,5±3,0 34±3,8 26,1±3,7

Достоверность P<0,05 P<0,05 P<0,05

28 КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ...

В табл. 1 представлена цифровая зависимость количества живых клеток от концентрации флюдара-бина в культуре. При концентрации флюдарабина в культуре 0,41; 1,23; 3,7 мкг/мл у больных, ответивших на лечение, количество живых клеток достоверно меньше, чем у пациентов, не ответивших на терапию.

Увеличение концентрации флюдарабина в культуре более 3,7 мкг/мл не приводит к дополнительной гибели клеток.

Таким образом, концентрации флюдарабина в культуре 0,41-3,7мкг/мл являются оптимальными для оценки жизнеспособности клеток. Кроме того, выявлена обратная корреляционная зависимость между клинической эффективностью флюдарабина и количеством оставшихся живых опухолевых клеток.

Анализ соотношения жизнеспособности опухолевых клеток и концентраций флюдарабина в МТТ-тесте позволил выделить 2 подгруппы, в зависимости от LD50 и ТПК флюдарабина (которая составила ~0,97мкг/мл): чувствительные (Ь050<І'МК. n=17) и нечувствительные (LD^'H ІК, n=16). Средняя кривая

- это средние значения живых клеток всех исследованных больных при каждой концентрации флюдара-бина. Нижняя кривая отражает средние значения процентов живых клеток при 5 концентрациях флюдара-бина у чувствительных пациентов. Верхняя кривая показывает средние значения процентов живых клеток при 5 возрастающих концентрациях во второй подгруппе больных (рис. 5).

Сравнение результатов показало, что у чувствительных пациентов среднее значение живых клеток по 5 концентрациям флюдарабина in vitro достоверно меньше, чем у нечувствительных (табл. 2).

LD50 в подгруппах чувствительных и не чувствительных больных так же достоверно (p<0,05) различаются 0,47±0,4 и 5,01±5,7 мкг/мл, (рис. 6).

При анализе клинической эффективности флюдарабина в двух подгруппах также были получены отличающиеся результаты.

У чувствительных (n=17) зафиксировано 9 полных ремиссий, 5 частичных ремиссии (всего 82,4 % ответивших) и 3 стабилизации болезни. В подгруппе не чувствительных (n=16) клиническая эффективность была ниже: 2 полных ремиссии, 4 частичных ремиссий (всего 37,5 % ответивших), 7 стабилизации болезни и у 3 возникло прогрессирование болезни.

Полученные данные свидетельствуют о достоверно (p<0,05) худших клинических результатах у не чувствительных пациентов согласно МТТ-тесту.

Заключение

При скрининге чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину у резистентных больных ХЛЛ было установлено, что более половины (62,2 %) чувствительны к действию препарата in vitro. Клинический ответ свидетельствует о дозозависимом эффекте флюдарабина, что подтверждается данными фармакодинамики в МТТ-тесте, лучшему клиническому эффекту соответствуют более низкие значения LD50 При анализе клинических ответов после терапии флюдарабином у больных с разной чувствительностью in vitro наблюдается четкая взаимосвязь: в группе больных, чувствительных к флюдарабину по МТТ-тесту, LD50 достигалась при концентрации препарата 0,47 0,4 мкг/мл и наблюдалась большая клиническая эффективность (82,4 % ответивших) по сравнению с не чувствительными in vitro, LD50 у которых составила 5,01 5,7 мкг/мл, р<0,05 (37,5 % ответивших). Таким образом, полученные результаты указывают на то, что МТТ-тест может использоваться как достоверный метод в определении чувствительности опухолевых клеток к флюдарабину in vitro, и позволяет прогнозировать клиническую значимость препарата.

Таблица 2

Зависимость жизнеспособности опухолевых клеток от концентрации флюдарабина в MTT-тесте

Группы Концентрация флюдарабина in vitro, мкг/мл

0,41 1,23 3,7 11,1 33,3

Количество живых клеток, %

Чувствительные, n=17 47,5±3,8 31,6±2,5 24,8±1,6 21,1±1,5 16,7±1,6

Нечувствительные, n=16 63,4±2,4 52,8±1,7 47,5±1,6 41,4±2,3 35,2±2,8

Достоверность P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05

Литература

1. Bosanquet A.G., Jonson S.A., Richards S.M. Do not treat all CLL patients with fludarabine? // Brit. J. of Hematol. - 1998. - Vol. 102(1). - P. 190.

2. BosanquetA.G., Stephen A.G., Richards S.M. High mortaliti of DiSC assay resistant CLL patients treated with fludarabine // Brit. J. of Hematol. - 1998. - Vol. 101. - P. 24.

3. Bowen A.L., Dearden C.E., Matutes E., Catovsky D. Fludarabine—combination chemotherapy in chronic lymphocytic leukaemia // Brit. J. of Hematol. - 1999. - Vol. 105(1). - P. 85.

4. Juliusson G. Complications in the treatment of CLL with purine analogues // Hematology and Cell Ther-

apy. - 1997. - Vol. 39. - P. S41-S44.

5. Morabito F., Steliaano C., Callea I. et al. In vitro drug-induced cytotoxicity predicts clinical response to fludarabine in B-cell chronic lymphocytic leukamia // Brit. j. Of Hematol. - 1998. - Vol. 102. - P. 528-9.

6. Silber R., Degar B., Costin D. et al. Chemosensitivity of lymphocytes from patients with B-cell chronic

lymphocytic leukaemia to chlorambucil, fludarabine, and camptothecin analogs // Blood. - 1998. - Vol. 84. - P. 3440-6.