CC BY
31MIR ournal
Microbiology Independent Research Journal
DOI: 10.18527/2500-2236-2022-9-1-56-70 ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯ
Фармакодинамическая активность нового соединения XC221GI в in vitro и in vivo моделях вирусного воспаления респираторного тракта
М. А. Стукова1 , А. В. Рыдловская2 , О. В. Проскурина2 , С. В. Мочалов2 , А.-П. С. Шурыгина1 , В. Е. Небольсин2*
1 Научно-исследовательский институт гриппа им. А. А. Смородинцева Минздрава России, ул. Проф. Попова, 15/17, Санкт-Петербург, 197376 Россия
2 ООО «Фарминтерпрайсез», вн. тер. г. муниципальный округ Можайский, тер. Сколково Инновационного центра, Большой б-р, 42, стр. 1, этаж 3, помещ. 1280, Москва, 121205 Россия
АННОТАЦИЯ
Вирусы, наиболее часто поражающие респираторный тракт человека, включают риновирусы, респираторно-синцитиаль-ный вирус (РСВ), вирусы гриппа и коронавирусы (CoV). Инфицирование вирусом эпителиальных клеток респираторного тракта запускает воспалительный процесс, сопровождающийся выбросом провоспалительных цитокинов и хемокинов, основными из которых являются интерлейкины IL6, IL8(CXCL8), ILip и фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor а, TNFa). Переход инфекции в фазу острой воспалительной реакции в легких сопровождается увеличением продукции цитокинов, притоком в легкие нейтрофилов и Т-клеток и индукцией хемокинов - лигандов рецептора CXCR3, - основных участников генерализованного воспаления.
В настоящей работе мы изучили фармакодинамическую активность нового соединения XC221GI в отношении IL6 и IL8 в условиях экспериментальной РСВ инфекции in vitro в клетках карциномы легкого человека А549 и in vivo в легких хлопковых крыс. Мы также изучили влияние XC221GI на приток нейтрофилов в легкие мышей и индукцию хемокинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 в бронхоальвеолярном лаваже после интраназального введения животным интерферона у (IFNy). В ходе исследования была продемонстрирована противовоспалительная активность препарата XC221GI, выражающаяся в снижении избыточной продукции ключевых маркеров воспаления в легких, включающих цитокины и хемокины IL6, IL8, CXCL10, CXCL9, CXCL11 и нейтрофилы, приводя к снижению легочной патологии. Полученные результаты подтверждают эффективность препарата XC221GI в качестве средства упреждающей противовоспалительной терапии при вирусной инфекции респираторного тракта.
Ключевые слова: РСВ, SARS-CoV-2, COVID-19, упреждающая противовоспалительная терапия, IL6, IL8, CXCL10, CXCL9, CXCL11, IFNy, нейтрофилы
# Автор, ответственный за переписку: Небольсин Владимир Евгеньевич, ООО «Фарминтерпрайсез», вн. тер. г. муниципальный округ Можайский, тер. Сколково Инновационного центра, Большой б-р, 42, стр. 1, помещ. 1280, Москва, 121205 Россия, e-mail: nv@pharmenterprises.ru
Цитирование: Стукова МА, Рыдловская АВ, Проскурина ОВ, Мочалов СВ, Шурыгина А-П С, Небольсин ВЕ. Фармакодинамическая активность нового соединения XC221GI в in vitro и in vivo моделях вирусного воспаления респираторного тракта. MIR J 2022; 9(1), 56-70. doi: 10.18527/2500-2236-2022-9-1-56-70. Получена: 1 марта 2022 Принята к печати: 7 апреля 2022 Опубликована: 1 мая 2022
Авторские права: © 2022 Стукова с соавт. Эта статья публикуется в свободном доступе в соответствии с лицензией Creative Commons AttributionNonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BY-NC-SA), которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любых носителях при условии, что указываются автор и источник публикации, а материал не используется в коммерческих целях.
Конфликт интересов: Авторы являются сотрудниками ООО «Фарминтерпрайсез» (В. Е. Небольсин, А. В. Рыдловская, С. В. Мочалов, О. В. Проскурина) и НИИ гриппа им. А. А. Смородинцева Минздрава России (М. А. Стукова, А.-П. С. Шурыгина) и заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: Исследование выполнено на средства ООО «Фарминтерпрайсез».
In vitro and in vivo pharmacodynamic activity of the new compound XC221GI in models of the viral inflammation of the respiratory tract
Marina A. Stukova1 , Anastasia V. Rydlovskaya2 , Oxana V. Proskurina2 , Stepan V. Mochalov2 , Anna-Polina S. Shurygina1 , Vladimir E. Nebolsin2*
1 Smorodintsev Research Institute of Influenza, 15/17, Prof. Popov str., St. Petersburg, 197376 Russia
2 Pharmenterprises LLC, Mozhaisky municipal district, territory of the Skolkovo Innovation Center, Bolshoy Boulevard, house 42, building 1, floor 3, room 1280, Moscow, 121205 Russia
ABSTRACT
The viruses most commonly affecting the human respiratory tract include rhinoviruses, respiratory syncytial virus (RSV), influenza viruses, and coronaviruses (CoVs). The virus infection of the epithelial cells of the respiratory tract triggers an inflammation accompanied by the release of pro-inflammatory cytokines and chemokines including IL6, IL8(CXCL8), IL1p, and tumor necrosis factor a (TNFa). A subsequent acute inflammatory response in the lungs is accompanied by an increase in the production of cytokines and chemokines - CXCR3 receptor ligands - that are key players of acute inflammatory response that induce an influx of neutrophils and T cells into the lungs.
We studied the pharmacodynamic activity of the new compound XC221GI to suppress the IL6 and IL8 of an experimental RSV infection in vitro in human lung carcinoma cells A549 and in vivo in the lungs of cotton rats. We also studied the effect of XC221GI on the production of the chemokines CXCL10, CXCL9, and CXCL11 in mouse bronchoalveolar lavage as well as on the influx of neutrophils into the mouse lungs after the intranasal administration of interferon y (IFNy).
The obtained results demonstrate the anti-inflammatory activity of XC221GI, which suppresses the production of excessive levels of the key inflammatory markers IL6, IL8, CXCL10, CXCL9, and CXCL11 as well as the influx of neutrophils into the lungs thereby reducing lung pathology. These data confirm the effectiveness of XC221GI as a means of preventive anti-inflammatory therapy during a viral infection of the respiratory tract.
Keywords: RSV, SARS-CoV-2, COVID-19, preventive anti-inflammatory therapy, IL6, IL8, CXCL10, CXCL9, CXCL11, IFNy, neutrophils For correspondence: Vladimir Nebolsin, Pharmenterprises LLC, Mozhaisky municipal district, territory of the Skolkovo Innovation Center, Bolshoy Boulevard, house 42, building 1, floor 3, room 1280, Moscow, 121205, Russia, e-mail: nv@pharmenterprises.ru Citation: Stukova MA, Rydlovskaya AV, Proskurina OV, Mochalov SV, Shurygina A-P S, Nebolsin VE. In vitro and in vivo pharmacodynamic activity of the new compound XC221GI in models of the viral inflammation of the respiratory tract. MIR J 2022; 9(1), 56-70. doi: 10.18527/2500-2236-2022-9-1-56-70. Received: March 1, 2022 Accepted: April 7, 2022 Published: May 1, 2022
Copyright: © 2022 Stukova et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative I
Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BYNC-SA), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, as long as the material is not used for commercial purposes, provided that the original author and source are cited.
Conflict of interest: M. A. Stukova and A-P. S. Shurygina are employees of Smorodintsev Research Institute of Influenza, V. E. Nebolsin, A. V. Rydlovskaya, O. V. Proskurina, S. V. Mochalov are employees of Pharmenterprises LLC. Authors have no commercial or financial conflicts of interests. Funding: The study was financed by Farmenterprises LLC.
ВВЕДЕНИЕ
К числу вирусов, наиболее часто поражающих респираторный тракт человека, относятся такие РНК-содержащие вирусы, как респираторно-синцити-альный вирус (РСВ), риновирусы, вирусы гриппа и коронавирусы (CoV). РСВ вызывает наиболее тяжелую патологию в легких (бронхиолит), особенно у детей первого года жизни, с высокими показателями летальности [1]. Бронхиолит, вызванный РСВ и риновирусом, также связан с повышенным
риском развития астмы [2]. Регулярные эпидемии, вызываемые вирусами гриппа, ежегодно приводят к 250 000-500 000 смертельных случаев во всем мире [3, 4]. Коронавирусы до 2020 г. вызывали сезонные заболевания, за исключением зоонозов, вызванных вирусами острого респираторного синдрома (severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV-1) и ближневосточного респираторного синдрома (Middle East respiratory syndrome, MERS), а в марте 2020 г. была объявлена
первая пандемия, вызванная вирусом SARS-CoV-2. Заболевание, названное COVID-19, по состоянию на март 2022 г. привело к гибели более 6 млн человек во всем мире [5, 6].
Вирусы распознаются эпителиальными клетками респираторного тракта, экспрессирующими рецепторы распознавания образов (pattern-recognition receptors, PRRs), основными из которых для РНК-содержащих вирусов являются толл-подобные рецепторы (toll-like receptors, TLRs) 3, 7, 8 и цитозоль-ные RIG-подобные и NOD-подобные рецепторы. Проникая в клетку, вирус запускает реакции врожденного иммунного ответа, сопровождающиеся массивным выбросом провоспалительных цитокинов, направленных на подавление вирусной репликации [7]. Выработка интерферонов (IFN) I (а, ß) и III (к) типов вызывает защиту соседних неинфицированных эпителиальных клеток от внедрения вирусов. Если быстро подавить репродукцию вируса не удается, иммунные клетки продуцируют провоспалитель-ные цитокины (IL6, TNFa), способствуя привлечению в респираторный тракт нейтрофилов и Т-клеток, что приводит к развитию воспаления [8, 9, 10].
На сегодняшний день самую большую угрозу представляет COVID-19, для которого выделено 5 фаз, включающих инкубационный период, фазу развития симптомов, фазу раннего воспаления, фазу вторичной инфекции и фазу мультисистемного воспаления (multisystem inflammation syndrome, MIS) [11]. Инкубационный период может длиться от 2 до 14 дней. Наличие у пациента активного врожденного иммунитета приводит к быстрой элиминации вируса и бессимптомной форме заболевания, которое встречается в 40-45% случаев [12, 13]. При менее эффективном иммунном ответе появляются симптомы, включающие лихорадку, кашель, боль в мышцах, потерю обоняния, желудочно-кишечные симптомы. На этой стадии раннего воспаления возможно лечение противовирусными препаратами прямого действия. Повышение тяжести COVID-19 чаще наблюдается у пожилых пациентов и лиц с сопутствующими заболеваниями, у которых несбалансированный иммунный ответ с низким уровнем продукции IFN I типа и избыточной продукцией IL6 и TNFa препятствует быстрой элиминации вируса [14-16]. У больного может развиться гипоксемия, легочная патология, сердечная дисфункция, почечная недостаточность, неврологические проявления или полиорганная недостаточность [17, 18]. Ранее эту стадию называли цитокино-вым штормом. На этой стадии возможно ослабление избыточного воспалительного ответа с помощью дексаметазона или препаратов, подавляющих IL6
(моноклональные антитела к рецептору IL6, например тоцилизумаб) [19].
При отсутствии лечения COVID-19 может перейти в фазу вторичной бактериальной или грибковой инфекции, требующую применения антибактериальных и противогрибковых препаратов. Частым исходом при COVID-19 является организующаяся вторичная пневмония с поражением бронхиол и альвеол, также характерная для для РСВ инфекции и гриппа [20].
При неблагоприятном развитии COVID-19 может наступить MIS [21]. На этой фазе чрезмерные дисфункциональные реакции препятствуют элиминации вируса и приводят к тяжелым последствиям, включая васкулит, тромбоэмболические процессы, иммуноопосредованную тромбоцитопению [22-24]. Уровень IL6 на этой стадии может быть в 10-200 раз выше, чем на стадии раннего воспаления [25].
При тяжелом течении COVID-19 ведущую роль играет IFNy, который, взаимодействуя с рецепторами IFNy, управляет клеточным иммунным ответом на инфекцию, активируя макрофаги и усиливая презентацию антигена и дифференциацию Т-клеток [26, 27]. Через JAK/STAT сигналинг IFNy может также напрямую передавать сигналы эпителиальным клеткам, вызывая экспрессию хемокинов [28]. Один из основных хемокинов при тяжелых инфекциях дыхательных путей - IFNy-индуцируемый белок 10 (CXCL10) [29], повышение уровня которого в плазме и брон-хоальвеолярном лаваже (БАЛ) больных коррелирует с тяжестью заболевания [29, 30]. В сыворотках больных также обнаруживаются CXCL2, IL8 и CXCL9 [31]. Высокий уровень воспалительных цитокинов приводит к гибели клеток, острому повреждению тканей и органов, аномальному изменению сосудистого гемостаза и в итоге - к полиорганной недостаточности [32]. Ингибирование отдельных ветвей иммунного ответа может ограничить разрушающий эффект воспаления [33]. Независимо от сроков начала терапии противовирусными средствами прямого действия, на всех этапах инфекционного процесса необходимо воздействовать на вирус-индуцированное воспаление при развивающейся патологии легких и поражении сосудистой сети респираторного тракта.
Препарат XC221GI изначально разрабатывался как средство для лечения РСВ инфекции у пациентов с иммуносупрессией и детей. При скрининге серии новых химических соединений в модели РСВ инфекции на хлопковых крысах (рекомендуемой модели для изучения РСВ инфекции) XC221GI проявил наиболее высокую эффективность. В данной работе мы представили результаты исследования фармакоди-намической активности XC221GI при респираторной
вирусной инфекции с целью изучения возможности его использования в качестве средства упреждающей противовоспалительной терапии при PCB инфекции и COVID-19. Мы показали эффективность ХC221GI в экспериментах PCB инфекции in vitro в перевиваемой эпителиальной клеточной культуре A549 и in vivo у хлопковых крыс. Кроме того, продемонстрировали эффект XC221GI на индукцию в легких мышей хемо-кинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 и приток нейтрофи-лов в модели воспаления, вызванного интраназаль-ным (i.n.) введением животным IFNy.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препарат
По номенклатуре IUPAC, XC221GI представляет собой (1-[2-(1-метилимидазол-4-ил)-этил] пергидроазин-2,6-дион) с молекулярной массой 221.3 г/моль. Cyбстан-ция XC221GI была произведена и выпущена компанией Alven Laboratories s.r.o (Чехия) в соответствии с действующими европейскими нормами надлежащей производственной практики (Good Manufacturing Practice).
Эффект ХС22Ш! на синтез IL6 и IL8 при РСВ инфекции
Перевиваемую культуру клеток карциномы легкого человека (линия А549, ATCC) культивировали в среде DMEM/F-12 (Gibco, ША), содержащей 2% глута-мина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки, при 37°С, в атмосфере 5% Ш2 при относительной влажности 95%. PCB человека (штамм А2, Influenza Reagent Resource, IRR, CША) культивировали в перевиваемой эпителиальной клеточной культуре МА-104. Эксперимент проводили в клеточной культуре A549 в бессывороточной среде DMEM/F-12. Для анализа использовали вируссодержащую жидкость.
B лунки с отмытым от культуральной среды монослоем клеток А549 добавляли XC221GI в концентрациях 0.001 мкг/мл, 0.01 мкг/мл, 0.1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 3 мкг/мл. Одновременно вносили PCB с множественностью заражения (multiplicity of infection, MOI) 0.01. Общий объем доводили культуральной средой до 500 мкл/лунку. Повторно препарат добавляли через 24 ч. Для разведения субстанции и вируса использовали бессывороточную среду DMEM-F12 с добавлением 2% культуральной добавки Gluta-Max (Gibco, CША). Контролем репродукции вируса служили лунки с клетками, инфицированными PCB, без добавления XC221GI. Отрицательным контролем служили лунки с неинфицированными клетками с добавлением субстанции в те же сроки. Планшеты инкубировали в Ш2-инкубаторе при 37°. Через 48 ч после
инфицирования культуральную среду из лунок отбирали и проводили количественную оценку синтеза IL6 и IL8 с использованием коммерческих ELISA тест-систем Human IL6 и Human IL8/NAP-1 Platinum ELISA (eBioscience, США).
Цитотоксический эффект XC221GI оценивали при помощи колориметрического микротетразолиевого теста с использованием 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (МТТ). Для определения токсического влияния XC221GI вносили в планшеты с клетками А549 в концентрации 0.0055000 мкг/мл и инкубировали в течение 48 ч при 37°, 5% СО2 и относительной влажности 95% с повторным добавлением через 24 ч.
Эффект XC221GI на легочную патологию при РСВ инфекции у хлопковых крыс
Животные
Эксперименты были выполнены в компании Sigmovir Biosystems, Inc. (Rockville, США). Самки хлопковых крыс (Sigmodon hispidus) (возраст от 6 до 8 недель, масса тела 70-100 г) были получены из колонии Sigmovir Biosystems, Inc. Животных содержали в больших поликарбонатных клетках и обеспечивали стандартным кормом для грызунов и водой по потребности. Хлопковые крысы, используемые в эксперименте, были серонегативными в отношении посторонних респираторных вирусов и других распространенных патогенов грызунов. Все эксперименты проводили с использованием протоколов, одобренных Комитетом по уходу и использованию животных Университета Мэриленда (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC). Всем животным на ухо прикрепляли бирки c идентификационным номером. После инфицирования РСВ животных содержали индивидуально.
Инфицирование животных
Каждое животное перед заражением получало легкий наркоз (ингаляция изофлюрана). РСВ хлопковым крысам вводили i.n пипеткой в дозе 5x105 бляшкоо-бразующих единиц (БОЕ).
Оценка патологии
В первом исследовании животные были разделены на группы по 5 особей. Хлопковые крысы, инфицированные РСВ, через 24 ч после заражения в течение 5 суток получали ХС22Ю! (20 мг/кг/сут) перораль-но (p.o.) с питьевой водой. Животные контрольной группы были инфицированы РСВ и получали питьевую воду без добавления ХС22Ю^ животные интакт-ной группы вместо РСВ получали фосфатный буфер (phosphate buffered saline, PBS) и питьевую воду без
препарата. На 6-е сутки после инфицирования животных умерщвляли, изымали легкие и готовили гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином (H&E). Оценивали 2 параметра легочной патологии, включающие интерстициаль-ную пневмонию (воспалительная клеточная инфильтрация и утолщение альвеолярных стенок) и альвео-лит (клетки в альвеолярных пространствах). Слайды оценивали вслепую по шкале тяжести в баллах от 0 до 4, принятую в Sigmovir Biosystems, Inc. [34]. Полуколичественная гистологическая система оценки воспаления включала количество интерстициальных и альвеолярных инфильтратов: 0% - 0 баллов, 0-25% - 1 балл, 25-50% - 2 балла, 50-75% - 3 балла, >75% -4 балла. Баллы, полученные при оценке двух показателей, суммировали [35]. Эффект XC221GI оценивали при сравнении группы леченых животных с группой контроля, получавшей воду вместо препарата.
Во втором эксперименте использовали хлопковых крыс c экспериментальной иммуносупрес-сией, вызванной введением циклофосфамида (cyclophosphamide, CY). CY вводили в дозе 50 мг/ кг в течение 3 недель, перед инфицированием доза была снижена до 37.5 мг/кг и до 25 мг/кг в день и после инфицирования. Спустя 24 ч после i.n. введения 5x105 БОЕ РСВ животные получали препарат XC221GI (20 мг/кг/сут) p.o. с питьевой водой в течение 9 дней. Животные, инфицированные РСВ, которым давали чистую питьевую воду, служили положительным контролем. Животные, получавшие PBS и питьевую воду, служили отрицательным контролем. В легких, извлеченных на 10-й день после инфицирования, оценивали титр вируса и выраженность гистопато-логических изменений. Для каждого образца легкого готовили четыре слайда, окрашенных H&E, Duffy, PAS или толуидиновым синим, которые были использованы для детальной оценки патологии (См. раздел «Критерии оценки патологии у хлопковых крыс при РСВ инфекции», приведенный в дополнительных материалах к статье). Дифференцировали также по-лиморфноядерные лейкоциты и классифицировали их как нейтрофильные и/или эозинофильные с помощью гистохимического окрашивания Duffy (окраска эозинофилов). Для оценки количества, распределения и морфологии тучных клеток использовали препараты, окрашенные толуидиновым синим. Оценку бокаловидных клеток проводили по препаратам, окрашенным PAS. Также оценивали гиперплазию/гипертрофию слизистых клеток и гиперплазию бронхиолярного эпителия. Для получения общего балла гистопатологии оценки складывали. Данные представляли в виде доли животных (%) с суммарной
оценкой гистопатологических изменений от 1 до 8 баллов при оценке перибронхиолита и от 1 до 6 баллов при оценке интерстициальной пневмонии и аль-веолита.
Титрование РСВ в легких животных на клетках HEp-2 Ткани легких, предназначенные для анализа, взвешивали и гомогенизировали в 3.0 мл HBSS буфера с добавлением 10% буфера SPG (сахароза/фосфат/ глютамат). Гомогенаты легких осветляли центрифугированием и разводили в среде EMEM. Монослой HEp-2 инфицировали 10-кратными разведениями в 24-луночных планшетах. После 1 ч инкубации при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 лунки покрывали средой с 0.75% метилцеллюлозой. Через 4 дня инкубации верхний слой удаляли и клетки фиксировали 0.1% кристаллическим фиолетовым в течение 1 ч, затем промывали и сушили на воздухе. Подсчитывали число бляшек и выражали титр вируса в БОЕ на грамм ткани легкого.
Эффект XC221GI на привлечение нейтрофилов и продукцию хемокинов CXCL9, CXCL10, CXCL11 в легких мышей
Животные
Эксперименты выполнены на 10-недельных самцах мышей линии C57BL6 массой 26.9±1.7 г, приобретенных в питомнике филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России (г. Андреевка Московской области). Животных содержали в клетках с контролируемой средой обитания со стандартным гранулированным кормом и водой. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных ООО «Фарминтерпрайсез» (Ветеринарные свидетельства № 12896925029 от 11.01.2022, № 12896967735 от 11.01.2022; Протокол БЭК № 14/2021 от 28.12.2021). Экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных [36]. Все процедуры с животными проводили с использованием наркоза.
Введение IFNy мышам и определение количества нейтрофилов и хемокинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 Животные были разделены на группы, и после анестезии им вводили (i.n.) в объеме 30 мкл (100 нг/ мкл, в правую ноздрю) рекомбинантный IFNy (R&D systems, США) и сразу вводили XC221GI в дозах 0.3, 3 или 15 мг/кг, однократно, внутрижелудочно, или препарат сравнения - дексаметазон (ПАО «Брынцалов-А», Россия) в дозе 1 мг/кг. Группа контрольных животных получала стерильный физиологический раствор.
Животные интактной группы получали только физиологический раствор без препарата и без IFNy. Далее у животных под терминальной анестезией через 8-12 ч собирали образцы бронхоальвеолярного ла-важа (БАЛ). Для этого трахею иссекали и вставляли пластиковую канюлю, воздушное пространство промывали 1 мл PBS, предварительно нагретого до 37°. C помощью камеры Горяева определяли абсолютное количество клеток в БАЛ. БАЛ центрифугировали при 200 g в течение 10 минут и из клеточного осадка готовили мазки, которые фиксировали в метаноле, окрашивали по Романовскому-Гимзе и считали количество нейтрофилов. В БАЛ также определяли уровень хемокинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 с использованием тест-систем IP-10 (CXCL10) Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific, США), MIG/CXCL9 Mouse ELISA Kit (R&D Systems, США) и CXCL11/I-TAC DuoSet (R&D Systems, США).
Статистический анализ
Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8 (США). Данные представляли как среднее арифметическое (M) ± стандартное отклонение (standard deviation, SD) или стандартная ошибка среднего (standard error of the mean, SEM). Оценку статистической достоверности различий между группами проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа One-way ANOVA с последующим тестом Tukey при уровне значимости межгрупповых различий p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оценка влияния ХС221И на экспрессию IL6 и IL8 при РСВ инфекции in vitro
Концентрация ранних цитокинов и хемокинов IL6, IL8 и TNFa при вирусной инфекции в крови может служить маркером тяжести заболевания [37]. При гипервоспалении их концентрации существенно возрастают. При тяжелой инфекции SARS-CoV-2 IL6 играет центральную роль [25, 38]. У людей, инфицированных РСВ, более тяжелое течение заболевания коррелировало с повышенными концентрациями IL1ß, IL1RA, IL6, IL7, IL8, G-CSF, CXCL9 [39-41].
На первом этапе исследования мы изучили влияние XC221GI на индукцию IL6 и IL8 при РСВ инфекции in vitro. Мы показали, что в культуре клеток A549, инфицированных РСВ, присутствие XC221GI в течение 48 ч приводило к подавлению синтеза IL6 (на 55-85%) и IL8 (на 40%), которое носило концентрационно-зависимый характер (Рис. 1 А, Б). Ингибирование 50%
^6 достигалось при 27.6 нмоль/л (6.1 нг/мл) ХС22Ю1. В неинфицированных клетках А549 препарат ХС22Ю1 не оказывал влияния на уровень ^8. Уровень ^6 в неинфицированных клетках был ниже предела определения и не изменялся в присутствии ХС22Ю1.
А
Б
Рис. 1. Ингибирование синтеза IL6 (А) и IL8 (Б) препаратом XC221GI в культуре клеток А549, инфицированных РСВ. Клетки А549, инфицированные РСВ (M0I=0.01), инкубировали в присутствии различных концентраций исследуемого препарата (по 6 повторов на каждую концентрацию). Внесение XC221GI осуществляли одновременно с заражением и повторно через 24 ч. Концентрации IL6 и IL8 в супернатанте через 48 ч после заражения определяли с помощью ELISA. Данные представлены как (M±SEM). Оценку статистической достоверности различий между клетками, инфицированными РСВ, без XC221GI и в присутствии различных концентраций XC221GI проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа One-way ANOVA с последующим тестом Tukey; (***) означает р<0.0001; (**) означает р<0.005.
В диапазоне концентраций до 500 мкг/мл не наблюдали цитотоксический эффект ХС22Ю1 в отношении клеток А549 в МТТ тесте (данные не представлены).
Влияние XC221GI на патологические изменения в легких хлопковых крыс при РСВ инфекции
Противовоспалительная активность ХС22Ю1 при вирусном поражении легких, вызванном РСВ, была изучена в серии экспериментов т vivо на хлопковых крысах. У хлопковых крыс, инфицированных РСВ, оценивали эффект ХС22Ю1 (20 мг/кг/сут) на патологию легких при ежедневном введении (р.о.) с питьевой водой в течение 5 суток, начиная через 24 ч после инфицирования.
Оценку проводили на 6-е сутки, когда патология была наиболее выражена. Введение животным ХС22Ю1 приводило к достоверному снижению в легких выраженности альвеолита и интерстициальной пневмонии по сравнению с животными контрольной группы, инфицированными РСВ и получавшими
воду без исследуемого соединения (РСВ Плацебо) (Рис. 2).
Эффект XC221GI (20 мг/кг/сут) на вирусную нагрузку и на патологию в легких хлопковых крыс, вызванную РСВ инфекцией, был изучен также на модели животных c иммуносупрессией. Максимальная патология у животных с иммуносупрессией отмечалась на 10-е сутки после инфицирования и на этот же срок наблюдали достоверное снижение титра РСВ в легких животных, леченных XC221GI, по сравнению с животными контрольной группы (Рис. 3).
Детальное изучение патологии в легких хлопковых крыс включало анализ срезов, окрашенных H&E, Duffy, PAS и толуидиновым синим на предмет наличия: воспалительных клеточных инфильтратов в перибронхиолярной соединительной ткани и, в меньшей степени, в бронхиолярном эпителии (пе-рибронхиолит); воспаления в альвеолярном септаль-ном интерстициуме вблизи и внутри терминальных бронхоальвеолярных каналов (интерстициальная пневмония); а также экссудатов воспалительных
Рис. 2. Оценка гистопатологических изменений в легких животных, инфицированных РСВ и леченных XC221GI. Хлопковые крысы (по 5 в группе) были инфицированы РСВ (штамм А2) в дозе 5х105 БОЕ. Через 24 ч после инфицирования животные получали XC221GI (20 мг/кг/сут) p.o. в течение 5 суток (РСВ XC221GI) или воду (РСВ Плацебо). Животные в группе отрицательного контроля вместо вируса получали PBS и воду вместо препарата (PBS Плацебо). На графике показана суммарная оценка патологии в баллах (альвеолит и интерстициальная пневмония) на 6-е сутки после инфицирования. Достоверность различий по сравнению с группой контроля (PCB Плацебо) определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа One-way ANOVA; (****) означает p<0.0001; (*) означает p<0.05.
Рис. 3. Влияние XC221GI на репродукцию РСВ в легких хлопковых крыс с иммуносупрессией. Животных инфицировали РСВ в дозе 105 БОЕ и через 24 ч лечили XC221GI (20 мг/кг/сут) p.o. в течение 9 суток. На 10-е сутки после заражения определяли титр вируса в легочной суспензии титрованием на клетках HEp-2. Предел титрования 2.3 log^OE/г. Достоверность различий по сравнению с группой контроля (CY PCB Плацебо) определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа One-way ANOVA; (****) означает p<0.0001; (***) означает p<0.001.
клеток в альвеолярном воздушном пространстве (альвеолит). Патологию оценивали в баллах, которые суммировали для каждого показателя. Критерии оценки приведены в разделе «Критерии оценки патологии у хлопковых крыс при РСВ инфекции», представленном в дополнительной информации к статье.
РСВ инфекция вызывала перибронхиолит, характеризующийся наличием подслизистых периброн-хиолярных интерстициальных инфильтратов преимущественно мононуклеарных воспалительных клеток с примесью эозинофилов и нейтрофилов. Окрашивание срезов легких H&E выявило периброн-хиолит во всех группах инфицированных РСВ животных. Патология была наиболее выражена у животных контрольной группы, получавших плацебо. В более пораженных образцах перибронхиолит распространялся глубоко, с вовлечением терминальных бронхиол. Эозинофилы были незначительным компонентом воспалительного процесса. В группе хлопковых крыс, леченных XC221GI, не выявили животных с патологией тяжелой степени тяжести (Рис. 4, 5 А). Оценка степени тяжести интерстициальных воспалительных клеточных инфильтратов также показала снижение выраженности интерстициальной пневмонии у хлопковых крыс, которым вводили XC221GI, по сравнению с животными группы плацебо (Рис. 5 Б).
Влияние XC221GI на привлечение нейтрофилов и продукцию хемокинов CXCL10, CXCL9, CXCL11 в легких мышей
При инфицировании людей вирусами SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 частым осложнением является усиление воспаления с последующим развитием MIS [42, 43]. Критическим фактором развития легочной патологии при COVID-19 служит передача сигналов
Рис. 4. Гистологическая картина перибронхиолита термин рованных РСВ и получавших плацебо (А) или XC221GI (Б).
хемокинов оси CXCL10-CXCR3 [44]. Повышенная экспрессия CXCL10 и родственных лигандов CXCL9 и CXCL11 рецептора CXCR3 выявлена в БАЛ и монону-клеарных клетках периферической крови (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) пациентов с тяжелой формой COVID-19. При воспалительном процессе в легких выявлена популяция нейтрофилов, экспрес-сирующих рецептор CXCR3 [45]. Поскольку IFNy может напрямую передавать сигналы эпителиальным клеткам, индуцируя хемокины, мы разработали модель притока нейтрофилов и индукции хемокинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 в легких мышей после i.n. введения мышам IFNy. Мы показали, что после однократного введения IFNy достоверное повышение уровня нейтрофилов в бронхоальвеолярном лаваже по сравнению с интактными животными обнаруживается уже через 4 ч и продолжает нарастать до 12 ч (Рис. 6 А). Кроме того, введение IFNy через 2 ч приводило к статистически достоверному повышению уровня CXCL10 в БАЛ, и его высокий уровень сохранялся на протяжении 12 ч (Рис. 6 Б).
Далее мы изучили, как влияет введение XC221GI мышам на уровень нейтрофилов и хемокинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 в легких после однократного введения IFNy. При введении животным IFNy и XC221GI в дозе 15 мг/кг через 8-12 ч в БАЛ отмечали статистически достоверное снижение числа нейтрофилов по сравнению с группой контрольных животных, которым вводили плацебо (Рис. 7 А). Эффект снижения нейтрофилов под действием XC221GI был сопоставим с действием дексаметазона (1 мг/кг). Изучение влияния XC221GI на хемокины - лиганды CXCR3 рецептора - показало, что однократное введение препарата XC221GI (в дозах 3 и 15 мг/кг) достоверно снижало CXCL10 и CXCL9 через 8-12 ч после
бронхиол. Окраска H&E (х40) легких хлопковых крыс, инфици-
Al_fi
Рис. 5. Детальный анализ гистопатологических изменений в легких животных с иммуносупрессией, инфицированных РСВ и леченных XC221GI. Результаты получены при анализе срезов легких, окрашенных H&E, Duffy, PAS или толуидиновым синим, при оценке степени тяжести перибронхиолита, интерстициальных воспалительных клеточных инфильтратов и альвеолита. Данные представлены в виде процента животных с суммарной оценкой гистопатологических изменений от 1 до 8 баллов при оценке перибронхиолита (А) и от 1 до 6 баллов при оценке интерстициальной пневмониии (Б) и альвеолита (В). Балл тяжести патологии отмечен соответствующим цветом, указанным в легенде.
А
Рис. 6. Приток нейтрофилов и индукция CXCL10 в легких мышей после однократного введения IFNy. Группы мышей C57Black/6 после анестезии получали i.n. 100 нг рекомбинантного IFNy в объеме 30 мкл. Интактные мыши служили контролем. Через 2, 4, 6, 8 и 12 ч в БАЛ считали количество нейтрофилов (А) и определяли уровень CXCL10 (Б) методом ELISA. Данные представлены как M±SEM. Достоверность статистических различий показателей в экспериментальных группах по сравнению с группой интактных животных оценивали с помощью анализа One-Way ANOVA; (*) означает p<0.05.
введения IFNy (Рис. 7 Б, В). Дексаметазон приводил к достоверному снижению CXCL9. Препарат XC221GI (в дозе 15 мг/кг), но не дексаметазон, приводил к достоверному снижению CXCL11 в бронхоальвеоляр-ном лаваже через 8 ч после введения IFNy (Рис. 7 Г).
ОБСУЖДЕНИЕ
Один из основных провоспалительных цитокинов при инфекционном процессе, вызванном респираторными вирусами, - IL6 [46, 47]. Блокирование IL6-R рецептора с помощью моноклонального антитела тоцилизумаб приводит к быстрому улучшению состояния пациентов с тяжелым течением COVID-19
[48]. Таким образом, IL6 может являться релевантной терапевтической мишенью при лечении вирус-ин-дуцированного воспаления. Также терапевтической мишенью может служить IL8, повышенный уровень которого наблюдается в плазме крови пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, с тяжелым течением заболевания COVID-19 [49]. IL8 вызывает массивный приток нейтрофилов в интерстиций, периваскуляр-ное и перибронхиальное пространство легких, приводя к их повреждению [50, 51]. Кроме того, IL8 играет ключевую роль в развитии фенотипа протромботи-ческих нейтрофилов у больных. Блокирование передачи сигналов IL8 с помощью анти-^8 моноклональ-ного антитела или блокатора рецепторов CXCR1/2
А
Б
В
Рис. 7. Влияние XC221GI на приток нейтрофилов и индукцию CXCL10, СХ^9 и CXCL11 в легких мышей. Мыши С57BL/6 были разделены на группы. Каждой мыши после анестезии однократно вводили i.n. 100 нг рекомбинантного IFNy в объеме 30 мкл и ХС22Ю1 р.о. в дозах 0.3, 3 или 15 мг/кг. Мышам контрольной группы вводили IFNy и стерильный физиологический раствор. Препаратом сравнения служил дексаметазон (1 мг/кг), который вводили аналогично. Животные интактной группы получали только физиологический раствор без препарата и без IFNy. Через 8-12 ч после введения IFNy собирали бронхоальвеолярный лаваж и анализировали нейтрофилы (А) и хемокины CXCL10 (Б), CXCL9 (В) и CXCL11 (Г). Статистически достоверные различия между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа One-way ANOVA; (&) означает статистически достоверную разницу по сравнению с группой контроля, (*) - по сравнению с группой интактных животных, p<0.05.
(репариксин) [52] снижало активацию нейтрофилов в эксперименте in vitro, а также приводило к снижению тяжести острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), вызванного SARS-CoV-2, у мышей [49].
Мы изучили влияние XC221GI на вирусное воспаление в экспериментах in vitro и in vivo при РСВ инфекции и показали, что препарат XC221GI эффективно подавлял РСВ-индуцированную продукцию IL6 (45-85%) и IL8 (40%) в эпителиальных клетках карциномы человека. Важно отметить, что XC221GI не влиял на спонтанную продукцию цитокинов IL-6 и IL-8 в отсутствие РСВ вируса.
Респираторные вирусы, попадая в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей через брон-хиолярный эпителий, проникают в нижние отделы респираторного тракта, вызывая бронхиолит. РСВ ответственен за 70% всех бронхиолитов у детей и является основной причиной гибели детей первых двух лет жизни [53]. Второе место по частоте брон-хиолитов у детей занимают риновирусы. Сезонные коронавирусы не являются частой причиной брон-хиолитов, однако ситуация изменилась с появлением SASR-CoV-2 варианта В.1.1.529 (Омикрон). Штамм Омикрон хуже размножается в легких животных по сравнению с предыдущими вариантами [54], реже приводит к пневмониям, но вызывает резкий подъем заболеваемости среди детей с большой частотой появления тяжелых заболеваний, включая круп, брон-хиолит и бронхообструкцию [55].
Бронхиолит, вызванный РСВ, характеризуется нейтрофилией, выбросом воспалительных цитоки-нов, гиперсекрецией слизи, которая может закупоривать просвет бронхиол, способствуя бронхиолярной обструкции [56]. Рекомендуемой моделью для изучения РСВ инфекции служат хлопковые крысы, у которых к 5-6-му дню после инфицирования развивается интерстициальная пневмония, альвеолит и пролифе-ративный бронхиолит [57]. На модели РСВ инфекции у хлопковых крыс мы изучили влияние XC221GI на вирус-индуцированную патологию в легких животных. Мы показали, что введение XC221GI в течение 5 дней приводило к достоверному снижению выраженности интерстициальной пневмонии и альвеоли-та у леченых животных.
Инфицирование РСВ хлопковых крыс с иммуносу-прессией вызывало типичную бронхиолярную и ин-терстициальную воспалительную реакцию в легких с присутствием перибронхиолярных и альвеолярных инфильтратов мононуклеарных воспалительных клеток, нейтрофилов и эозинофилов. Лечение животных XC221GI в течение 9 дней приводило к достоверному снижению вирусной нагрузки в легких и
снижению патологии при анализе перибронхиолярных, интерстициальных и альвеолярных изменений. У леченых животных не были выявлены случаи пери-бронхиолита и интерстициальной пневмонии с тяжелой степенью поражения легочной ткани в отличие от животных контрольной группы.
При тяжелом вирус-индуцированном воспалении респираторного тракта у людей наблюдаются также повышенные уровни хемокинов CXCL10, CXCL9, CXCL11 - лигандов рецептора CXCR3. CXCR3 считается воспалительным хемокиновым рецептором, так как экспрессируется лейкоцитами, которые мигрируют к местам воспаления. Повышенные уровни CXCL10 в легких вызывают инфильтрацию нейтро-филами, экспрессирующими рецептор CXCR3. Такие нейтрофилы обнаруживаются у пациентов с хроническим заболеванием легких, но не у здоровых людей [58]. CXCL10-CXCR3 сигналинг является критическим фактором усиления патологии в легких при мульти-системном воспалении за счет действия на хемотаксис нейтрофилов [44], а также связан с патофизиологией заболеваний Th1 типа, включая аутоиммунные, сердечно-сосудистые и инфекционные [59, 60].
IFNy, являясь регулятором иммунного ответа на инфекцию, индуцирует все три лиганда CXCR3 -CXCL10, CXCL9 и CXCL11, - активируя JAK/STAT/Akt сигналинг [61-63]. Хемокины CXCL10, CXCL9 и CXCL11 обладают сходным составом белковой последовательности с идентичностью до 40% [64]. Хемокины CXCL9 и CXCL10 вызывают поляризацию эффекторных клеток Th1/Th17 и поддерживают воспалительную реакцию [65]. CXCL10 вовлечен в хемотаксис, апоптоз, ангиостаз и служит основным маркером ОРДС [26, 66]. При тяжелой форме COVID-19 хемокины CXCL10, CXCL9 и CXCL11 обильно индуцируются в эпителиальных клетках легких человека. В сыворотке пациентов с генерализованным воспалением, вызванным SARS-CoV-2, отмечали значительное повышение уровня CXCL9 [31], который включен в перечень 10 хемоки-нов, связанных с повышенным риском смертности [6]. Измерение профиля хемокинов CXCL9, CXCL10 и CXCL11 позволяет выявить COVID-19 пациентов с повышенным риском развития осложнений. Таким образом, контролируя уровень хемокинов, возможно обеспечить контроль вирусной инфекции.
Ось CXCL10-CXCR3 является важной терапевтической мишенью при лечении острой фазы легочного воспаления. Мы изучили эффект XC221GI на приток нейтрофилов в бронхоальвеолярное пространство легких мышей и индукцию хемокинов CXCL10, CXCL9 и CXCL11 после i.n. введения животным IFNy. В разработанной нами модели мы показали, что
однократное введение ХС22Ю1 приводило к достоверному снижению притока в легкие нейтрофилов и снижению продукции всех трех лигандов - СХ^9, СХ^10 и СХ^11 - уже через 8-12 ч после введения №N7. Эффект ХС22Ю1 на приток в легкие нейтрофи-лов и СХ^9 был сопоставим с действием дексамета-зона. Статистически значимого эффекта дексамета-зона на СХ^10 и СХ^11 в этой модели не отмечали.
Полученные результаты доклинического изучения фармакодинамической активности соединения ХС22Ю1 характеризуют уникальный противовоспалительный профиль действия его молекулы, выражающийся в возможности управления уровнем продукции ключевых маркеров воспаления
и гипервоспаления при РСВ. Доказанный контроль продукции ^6 и ^8, а также СХ^10, СХ^9 и СХ^11 с помощью ХС22Ю1 является ключевым свойством молекулы для обоснования ее применения при РСВ инфекции и, возможно, при SARS-CoV-2.
Данные результаты позволяют предположить, что ХС22Ю1 может быть применен в качестве средства упреждающей противовоспалительной терапии как при РСВ с целью снижения вирусного поражения лёгочной ткани, так и при COVID-19 на всех этапах воспалительного процесса для предотвращения развития гиперцитокинемии и ее последствий, включая тромбоэмболические нарушения и дисфункцию ключевых органов жизнеобеспечения.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Paes B, Fauroux B, Figueras-Aloy J, Bont L, Chec-chia PA, Simoes EA, et al. Defining the Risk and Associated Morbidity and Mortality of Severe Respiratory Syncytial Virus Infection Among Infants with Chronic Lung Disease. Infect Dis Ther 2016; 5(4), 453-71. doi: 10.1007/s40121-016-0137-7.
2. Bergroth E, Aakula M, Elenius V, Remes S, Piippo-Savolainen E, Korppi M, et al. Rhinovirus Type in Severe Bronchiolitis and the Development of Asthma. J Allergy Clin Immunol Pract 2020; 8(2), 588-95.e4. doi: 10.1016/j.jaip.2019.08.043.
3. Macias AE, McElhaney JE, Chaves SS, Nealon J, Nunes MC, Samson SI, et al. The disease burden of influenza beyond respiratory illness. Vaccine 2021; 39 Suppl 1, A6-A14. doi: 10.1016/j.vaccine.2020.09.048.
4. Paget J, Spreeuwenberg P, Charu V, Taylor RJ, Iulia-no AD, Bresee J, et al. Global mortality associated with seasonal influenza epidemics: New burden estimates and predictors from the GLaMOR Project. J Glob Health 2019; 9(2), 020421. doi: 10.7189/ jogh.09.020421.
5. Cucinotta D, Vanelli M. WHO Declares COVID-19 a Pandemic. Acta Biomed 2020; 91(1), 157-60. doi: 10.23750/abm.v91i1.9397.
6. Abers MS, Delmonte OM, Ricotta EE, Fintzi J, Fink DL, de Jesus AAA, et al. An immune-based biomarker signature is associated with mortality in COVID-19 patients. JCI Insight 2021; 6(1). doi: 10.1172/ jci.insight.144455.
7. Schultze JL, Aschenbrenner AC. COVID-19 and the human innate immune system. Cell 2021; 184(7), 1671-92. doi: 10.1016/j.cell.2021.02.029.
8. Vardhana SA, Wolchok JD. The many faces of the an-ti-COVID immune response. J Exp Med 2020; 217(6), 1-10. doi: 10.1084/jem.20200678.
9. Shimabukuro-Vornhagen A, Godel P, Subklewe M, Stemmler HJ, Schlosser HA, Schlaak M, et al. Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer 2018; 6(1), 56. doi: 10.1186/s40425-018-0343-9.
10. Harker JA, Lewis GM, Mack L, Zuniga EI. Late inter-leukin-6 escalates T follicular helper cell responses and controls a chronic viral infection. Science 2011; 334(6057), 825-9. doi: 10.1126/science.1208421.
11. Griffin DO, Brennan-Rieder D, Ngo B, Kory P, Con-falonieri M, Shapiro L, et al. The Importance of Understanding the Stages of COVID-19 in Treatment and Trials. AIDS Rev 2021; 23(1), 40-7. doi: 10.24875/ AIDSRev.200001261.
12. Oran DP, Topol EJ. Prevalence of Asymptomatic SARS-CoV-2 Infection. Ann Intern Med 2021; 174(2), 286-7. doi: 10.7326/L20-1285.
13. Long OX, Tang XJ, Shi OL, Li 0, Deng HJ, Yuan J, et al. Clinical and immunological assessment of asymptomatic SARS-CoV-2 infections. Nat Med 2020; 26(8), 1200-4. doi: 10.1038/s41591-020-0965-6.
14. Ellul MA, Benjamin L, Singh B, Lant S, Michael BD, Easton A, et al. Neurological associations of CO-VID-19. Lancet Neurol 2020; 19(9), 767-83. doi: 10.1016/S1474-4422(20)30221-0.
15. Renu K, Prasanna PL, Valsala Gopalakrishnan A. Coronaviruses pathogenesis, comorbidities and multi-organ damage - A review. Life Sci 2020; 255, 117839. doi: 10.1016/j.lfs.2020.117839.
16. Jose RJ, Manuel A. COVID-19 cytokine storm: the interplay between inflammation and coagulation.
Lancet Respir Med 2020; 8(6), e46-e7. doi: 10.1016/ S2213-2600(20)30216-2.
17. Mehta P, McAuley DF, Brown M, Sanchez E, Tat-tersall RS, Manson JJ, et al. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. Lancet 2020; 395(10229), 1033-4. doi: 10.1016/ S0140-6736(20)30628-0.
18. Hadjadj J, Yatim N, Barnabei L, Corneau A, Boussier J, Smith N, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science 2020; 369(6504), 718-24. doi: 10.1126/ science.abc6027.
19. Group RC, Horby P, Lim WS, Emberson JR, Mafham M, Bell JL, et al. Dexamethasone in Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl J Med 2021; 384(8), 693704. doi: 10.1056/NEJMoa2021436.
20. Kory P, Kanne JP. SARS-CoV-2 organising pneumonia: 'Has there been a widespread failure to identify and treat this prevalent condition in COVID-19?'. BMJ Open Respir Res 2020; 7, e000724. doi: 10.1136/ bmjresp-2020-000724.
21. Morris SB, Schwartz NG, Patel P, Abbo L, Beau-champs L, Balan S, et al. Case Series of Multisystem Inflammatory Syndrome in Adults Associated with SARS-CoV-2 Infection - United Kingdom and United States, March-August 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2020; 69(40), 1450-6. doi: 10.15585/mmwr. mm6940e1.
22. Finsterer J, Scorza FA, Fiorini AC. SARS-CoV-2-asso-ciated Guillain-Barre syndrome in 62 patients. Eur J Neurol 2021; 28(1), e10-e2. doi: 10.1111/ene.14544.
23. Xu P, Zhou 0, Xu J. Mechanism of thrombocytopenia in COVID-19 patients. Ann Hematol 2020; 99(6), 1205-8. doi: 10.1007/s00277-020-04019-0.
24. Zheng HY, Zhang M, Yang CX, Zhang N, Wang XC, Yang XP, et al. Elevated exhaustion levels and reduced functional diversity of T cells in peripheral blood may predict severe progression in COVID-19 patients. Cell Mol Immunol 2020; 17(5), 541-3. doi: 10.1038/s41423-020-0401-3.
25. Sinha P, Matthay MA, Calfee CS. Is a "Cytokine Storm" Relevant to COVID-19? JAMA Intern Med 2020; 180(9), 1152-4. doi: 10.1001/jamainternmed.2020.3313.
26. Huang C, Wang Y, Li X, Ren L, Zhao J, Hu Y, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coro-navirus in Wuhan, China. Lancet 2020; 395(10223), 497-506. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30183-5.
27. Hu X, Ivashkiv LB. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity 2009; 31(4), 539-50. doi: 10.1016/ j.immuni.2009.09.002.
28. Walrath T, Malizia RA, Zhu X, Sharp SP, D'Souza SS, Lopez-Soler R, et al. IFN-gamma and IL-17A regulate intestinal crypt production of CXCL10 in the healthy and inflamed colon. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2020; 318(3), G479-89. doi: 10.1152/ ajpgi.00208.2019.
29. Hayney MS, Henriquez KM, Barnet JH, Ewers T, Champion HM, Flannery S, et al. Serum IFN-gamma-induced protein 10 (IP-10) as a biomarker for severity of acute respiratory infection in healthy adults. J Clin Virol 2017; 90, 32-7. doi: 10.1016/j.jcv.2017.03.003.
30. Almansa R, Sanchez-Garcia M, Herrero A, Calzada S, Roig V, Barbado J, et al. Host response cytokine signatures in viral and nonviral acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. J Interferon Cytokine Res 2011; 31(5), 409-13. doi: 10.1089/ jir.2010.0131.
31. Blanco-Melo D, Nilsson-Payant BE, Liu WC, Uhl S, Hoagland D, Moller R, et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of CO-VID-19. Cell 2020; 181(5), 1036-45.e9. doi: 10.1016/j. cell.2020.04.026.
32. Mangalmurti N, Hunter CA. Cytokine Storms: Understanding COVID-19. Immunity 2020; 53(1), 19-25. doi: 10.1016/j.immuni.2020.06.017.
33. Tang L, Yin Z, Hu Y, Mei H. Controlling Cytokine Storm Is Vital in COVID-19. Front Immunol 2020; 11, 570993. doi: 10.3389/fimmu.2020.570993.
34. Boukhvalova MS, Yim KC, Blanco J. Cotton rat model for testing vaccines and antivirals against respiratory syncytial virus. Antivir Chem Chemother 2018; 26, 2040206618770518. doi: 10.1177/2040206618770518.
35. Martinez ME, Harder OE, Rosas LE, Joseph L, Davis IC, Niewiesk S Pulmonary function analysis in cotton rats after respiratory syncytial virus infection. PLoS ONE 2020; 15(8), e0237404. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0237404.
36. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washington (DC): National Academies Press (US), 2011. PMID: 21595115.
37. Buszko M, Park JH, Verthelyi D, Sen R, Young HA, Rosenberg AS. The dynamic changes in cytokine responses in COVID-19: a snapshot of the current state of knowledge. Nat Immunol 2020; 21(10), 1146-51. doi: 10.1038/s41590-020-0779-1.
38. Zhang C, Wu Z, Li JW, Zhao H, Wang GO. Cytokine release syndrome in severe COVID-19: interleukin-6 receptor antagonist tocilizumab may be the key to reduce mortality. Int J Antimicrob Agents 2020; 55(5), 105954. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105954.
39. Tabarani CM, Bonville CA, Suryadevara M, Brani-gan P, Wang D, Huang D, et al. Novel inflammatory markers, clinical risk factors and virus type associated with severe respiratory syncytial virus infection. Pediatr Infect Dis J 2013; 32(12), e437-42. doi: 10.1097/INF.0b013e3182a14407.
40. Brand HK, Ferwerda G, Preijers F, de Groot R, Neele-man C, Staal FJ, et al. CD4+ T-cell counts and interleu-kin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pedi-atr Res 2013; 73(2), 187-93. doi: 10.1038/pr.2012.163.
41. Jafri HS, Chavez-Bueno S, Mejias A, Gomez AM, Rios AM, Nassi SS, et al. Respiratory syncytial virus induces pneumonia, cytokine response, airway obstruction, and chronic inflammatory infiltrates associated with long-term airway hyperresponsive-ness in mice. J Infect Dis 2004; 189(10), 1856-65. doi: 10.1086/386372.
42. Alosaimi B, Hamed ME, Naeem A, Alsharef AA, AlOa-htani SY, AlDosari KM, et al. MERS-CoV infection is associated with downregulation of genes encoding Th1 and Th2 cytokines/chemokines and elevated inflammatory innate immune response in the lower respiratory tract. Cytokine 2020; 126, 154895. doi: 10.1016/j.cyto.2019.154895.
43. Hue S, Beldi-Ferchiou A, Bendib I, Surenaud M, Fou-rati S, Frapard T, et al. Uncontrolled Innate and Impaired Adaptive Immune Responses in Patients with COVID-19 Acute Respiratory Distress Syndrome. Am J Respir Crit Care Med 2020; 202(11), 1509-19. doi: 10.1164/rccm.202005-18850C.
44. Ichikawa A, Kuba K, Morita M, Chida S, Tezuka H, Hara H, et al. CXCL10-CXCR3 enhances the development of neutrophil-mediated fulminant lung injury of viral and nonviral origin. Am J Respir Crit Care Med 2013; 187(1), 65-77. doi: 10.1164/rccm.201203-0508OC.
45. Rossi D, Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol 2000; 18, 217-42. doi: 10.1146/annurev.immunol.18.1.217.
46. Ware LB, Matthay MA. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med 2000; 342(18), 1334-49. doi: 10.1056/NEJM200005043421806.
47. Ulhaq ZS, Soraya GV. Interleukin-6 as a potential biomarker of COVID-19 progression. Med Mal Infect 2020; 50(4), 382-3. doi: 10.1016/ j.medmal.2020.04.002.
48. Xu X, Han M, Li T, Sun W, Wang D, Fu B, et al. Effective treatment of severe COVID-19 patients with tocilizumab. Proc Natl Acad Sci U S A 2020; 117(20), 10970-5. doi: 10.1073/pnas.2005615117.
49. Kaiser R, Leunig A, Pekayvaz K, Popp O, Joppich M, Polewka V, et al. Self-sustaining IL-8 loops drive a prothrombotic neutrophil phenotype in severe COV-ID-19. JCI Insight 2021; 6(18), e150862. doi: 10.1172/ jci.insight.150862.
50. Meizlish ML, Pine AB, Bishai JD, Goshua G, Nadelmann ER, Simonov M, et al. A neutrophil activation signature predicts critical illness and mortality in COVID-19. Blood Adv 2021; 5(5), 1164-77. doi: 10.1182/bloodadvances.2020003568.
51. Del Valle DM, Kim-Schulze S, Huang HH, Beckmann ND, Nirenberg S, Wang B, et al. An inflammatory cytokine signature predicts COVID-19 severity and survival. Nat Med 2020; 26(10), 1636-43. doi: 10.1038/s41591-020-1051-9.
52. Opfermann P, Derhaschnig U, Felli A, Wenisch J, Santer D, Zuckermann A, et al. A pilot study on reparixin, a CXCR1/2 antagonist, to assess safety and efficacy in attenuating ischaemia-reperfusion injury and inflammation after on-pump coronary artery bypass graft surgery. Clin Exp Immunol 2015; 180(1), 131-42. doi: 10.1111/cei.12488.
53. Nair H, Nokes DJ, Gessner BD, Dherani M, Madhi SA, Singleton RJ, et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and me-ta-analysis. Lancet 2010; 375(9725), 1545-55. doi: 10.1016/S0140-6736(10)60206-1.
54. Diamond M, Halfmann P, Maemura T, Iwatsuki-Horimoto K, Iida S, Kiso M, et al. The SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron virus causes attenuated infection and disease in mice and hamsters. Res Sq 2021. doi: 10.21203/rs.3.rs-1211792/v1.
55. Cloete J, Kruger A, Masha M, du Plessis NM, Mawe-la D, Tshukudu M, et al. Paediatric hospitalisations due to COVID-19 during the first SARS-CoV-2 omicron (B.1.1.529) variant wave in South Africa: a multicentre observational study. Lancet Child Ado-lesc Health 2022; 6(5), 294-302. doi: 10.1016/S2352-4642(22)00027-X.
56. Florin TA, Plint AC, Zorc JJ. Viral bronchiolitis. Lancet 2017; 389(10065), 211-24. doi: 10.1016/S0140-6736(16)30951-5.
57. Boukhvalova MS, Yim KC, Blanco J. Cotton rat model for testing vaccines and antivirals against respiratory syncytial virus. Antivir Chem Chemother 2018; 26, 2040206618770518. doi: 10.1177/2040206618770518.
58. Hartl D, Krauss-Etschmann S, Koller B, Hordijk PL, Kuijpers TW, Hoffmann F, et al. Infiltrated neu-trophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic
inflammatory lung diseases. J Immunol 2008; 181(11), 8053-67. doi: 10.4049/jimmunol.181.11.8053.
59. Altara R, Manca M, Brandao RD, Zeidan A, Booz GW, Zouein FA. Emerging importance of chemokine receptor CXCR3 and its ligands in cardiovascular diseases. Clin Sci (Lond) 2016; 130(7), 463-78. doi: 10.1042/CS20150666.
60. Van Raemdonck K, Van den Steen PE, Liekens S, Van Damme J, Struyf S. CXCR3 ligands in disease and therapy. Cytokine Growth Factor Rev 2015; 26(3), 311-27. doi: 10.1016/j.cytogfr.2014.11.009.
61. McLoughlin RM, Jenkins BJ, Grail D, Williams AS, Fielding CA, Parker CR, et al. IL-6 trans-signaling via STAT3 directs T cell infiltration in acute inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(27), 9589-94. doi: 10.1073/pnas.0501794102.
62. Tokunaga R, Zhang W, Naseem M, Puccini A, Berger MD, Soni S, et al. CXCL9, CXCL10, CXCL11/CXCR3 axis for immune activation - A target for novel cancer therapy. Cancer Treat Rev 2018; 63, 40-7. doi: 10.1016/j.ctrv.2017.11.007.
63. Callahan V, Hawks S, Crawford MA, Lehman CW, Morrison HA, Ivester HM, et al. The Pro-Inflammatory Chemokines CXCL9, CXCL10 and CXCL11 Are Upregulated Following SARS-CoV-2 Infection in an AKT-Dependent Manner. Viruses 2021; 13(6), 1062. doi: 10.3390/v13061062.
64. Metzemaekers M, Vanheule V, Janssens R, Struyf S, Proost P. Overview of the Mechanisms that May Contribute to the Non-Redundant Activities of In-terferon-Inducible CXC Chemokine Receptor 3 Li-gands. Front Immunol 2017; 8, 1970. doi: 10.3389/ fimmu.2017.01970.
65. Zohar Y, Wildbaum G, Novak R, Salzman AL, Thel-en M, Alon R, et al. CXCL11-dependent induction of FOXP3-negative regulatory T cells suppresses autoimmune encephalomyelitis. J Clin Invest 2014; 124(5), 2009-22. doi: 10.1172/JCI71951.
66. Chua RL, Lukassen S, Trump S, Hennig BP, Wendisch D, Pott F, et al. COVID-19 severity correlates with airway epithelium-immune cell interactions identified by single-cell analysis. Nat Biotechnol 2020; 38(8), 970-9. doi: 10.1038/s41587-020-0602-4.
