CC BY
12
УДК 615.322:615.035:616.613
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НАСТОЯ ПОДМАРЕННИКА НАСТОЯЩЕГО ТРАВЫ ДЛЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОКСАЛАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА
Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул
Мазко О.Н., Макарова О.Г., Бобров И.П., Жарикова Г.В., Кореновский Ю.В., Азарова О.В., Кальницкий А.С.
Цель исследования - изучение влияния настоя подмаренника настоящего травы (1:10) на течение экспериментального оксалатного нефролитиаза крыс.
Эксперименты проведены на 24 крысах-самцах стока Вистар массой 225-260 г. Для моделирования оксалатного нефролитиаза крысы в течение 6 недель получали в виде питья 1%-й раствор этиленгликоля. Настой подмаренника настоящего травы (1:10) вводили энтерально в количестве 1 мл/сутки, начиная с четвертой недели эксперимента.
Оценка антилитогенной активности фитопрепарата проведена с использованием морфологических исследований почек крыс.
Настой травы препятствует образованию новых депозитов (их количество уменьшается по сравнению с патологией на 43%; 2,6±0,5 в группе контроля и 1,5±0,3 в группе лечения фитопрепаратом) и замедляет формирование имеющихся: размер кальций-позитивных образований уменьшается на 64% (р<0,01) по отношению к показателю литогенизированных крыс.
Трехнедельное применение настоя подмаренника настоящего травы (1:10) в режиме лечения обеспечивает ослабление интенсивности литогенных процессов в почках, что способствует снижению явлений воспаления, а также восстановлению структуры и функции почечного эпителия. Ключевые слова: подмаренника настоящего трава, мочекаменная болезнь, экспериментальный окса-латный нефролитиаз, морфологические исследования.
The aim of the research is to study the effect of the infusion of the yellow bedstraw (Galium verum L.) herb (1:10) on the course of experimental oxalate nephrolithiasis in rats.
Experiments were carried out on 24 male Wistar rats weighing 225-260 g. To model oxalate nephrolithiasis, rats were given 1% ethylene glycol solution as a drinking for 6 weeks. The yellow bedstraw (Galium verum L.) herb infusion (1:10) was administered enterally in the amount of 1 ml/day, starting from the fourth week of the experiment.
The assessment of anti-lithogenic activity of the herbal product was carried out using morphological studies of rat kidneys.
The herbal infusion prevents the formation of new deposits (their number decreases by 43% compared to pathology; 2.6±0.5 in the control group and 1.5±0.3 in the herbal product treatment group) and slows down the formation of already presented ones: the size of calcium-positive formations decreases by 64% (p<0.01) relative to the rate of lithogenated rats.
Three-week use of the yellow bedstraw (Galium verum L.) herb infusion (1:10) in the treatment mode ensures a weakening of the intensity of lithogenic processes in the kidneys, which helps to reduce the phenomena of inflammation, and also ensures the restoration of the structure and function of the renal epithelium. Key words: yellow bedstraw (Galium verum L.) herb, urolithiasis, experimental oxalate nephrolithiasis, morphological studies.
Потребность в препаратах для консервативного лечения мочекаменной болезни (МКБ) в условиях социально-экономической значимости патологии остается высокой [1]. При сформированных традициях медикаментозного лечения и профилактики МКБ также доказана результативность фитотерапии нефролитиаза, при которой оказывается разностороннее комплексное воздействие на течение патологического процесса в почках [2]. Данное воздействие реализуется за счет непосредственного влияния на процесс камнеобразования, стабилизации ионной силы мочи и ингибиторов камнеобра-зования, ускорения отхождения камней, их
фрагментов и песка после дистанционной ли-тотрипсии, а также возможности длительного применения без выраженных побочных эффектов [3, 4]. Актуальность повышения эффективности фармакотерапии МКБ, в том числе за счет фитопрепаратов, определяет целесообразность фитофармакологических исследований новых нефропротекторов растительного происхождения из арсенала народной медицины. В данном контексте интерес представляет растение подмаренник настоящий (Galium verum L.), который в этномедицине используется при камнях в почках [5, 6]. Сведения о наличии в траве подмаренника настоящего комплекса полифеноль-
ных соединений, таких как кумарины, дериваты фенолкарбоновых кислот, флавоноиды и др. [7], а также доказанная в собственных исследованиях противовоспалительная активность водных извлечений надземной части растения [5] позволяют рассчитывать на вероятность сочетания противовоспалительной, диуретической, антиоксидантной, противомикробной и других видов биологической активности, имеющих патогенетическое значение в фармакокоррекции нефропатологии различного генеза.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния настоя подмаренника настоящего травы на течение экспериментального оксалатного нефролитиаза.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на 24 крысах-самцах стока Вистар массой 225-260 г, которые находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи, в условиях стандартной лабораторной диеты. Учитывая доминирование оксалатных уролитов при мочекаменной болезни, использовали общепринятую этиленгликолевую модель, согласно которой литогенез воспроизводился при получении подопытными животными в виде питья 1%-ого раствора этиленгликоля. Одним из метаболитов этиленгликоля являются окса-лат-ионы, поэтому хроническое применение токсиканта приводит к развитию вторичной гипероксалурии, пересыщению мочи солями кальция оксалата, повреждению почечного эпителия и, в конечном счете, к отложению кальциевых депозитов преимущественно в ин-терстициальной ткани почечного сосочка [8, 9]. Лабораторные животные были разделены на две группы: контрольную (п=12) и опытную (п=12). Первая (контрольная) группа на протяжении шести недель получала в виде питья 1%-й раствор этиленгликоля. Животным второй (опытной) группы, начиная с четвертой недели (с 22-го по 42-ой день), на фоне продолжающегося потребления этиленгликоля внутрь через зонд вводили настой подмаренника настоящего травы (1:10) по 1,0 мл в сутки.
По истечении шестой недели эксперимента с целью проведения морфологического исследования животных обеих групп подвергали эвтаназии под эфирным наркозом с соблюдением Правил надлежащей лабораторной практики (GLP), утвержденных Приказом Министерства здравоохранения РФ от 01.04.2016 г. №-199н, и требований Директивы 2010/63/Еи Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22.09.2010 г.
Для морфометрических исследований использовали почки крыс первой и второй групп. Проводку материала осуществляли по изопро-
пиловому спирту с помощью автомата проводки карусельного типа TISSUE-TEK VIPTM6 (Sakkura, Япония), заливали материал в парафин при помощи станции парафиновой заливки TISSUE-TEK TEC5 (Sakkura, Япония). С использованием полуавтоматического роторного микротома Accu-Cut SRM (Sakkura, Япония) получали гистологические срезы толщиной 5-7 мкм через почечный сосочек, которые окрашивали гематоксилином и эозином, метенамин-се-ребром в автомате для автоматической окраски микропрепаратов TISSUE-TEK Prisma (Sakkura, Япония), а затем заключали под пленку в автомате для автоматического заключения микропрепаратов под покровную пленку TISSUE-TEK Film (Sakkura, Япония).
Для выявления отложений соединений кальция использовали импрегнацию серебром по гистохимическому методу Косса, с контролем реакции 0,1%-м раствором хлористоводородной кислоты. Оценивали характер отложения и распределения кальциевых депозитов, их количество в поле зрения и средние размеры, особенности локализации в тканях почки.
Морфометрические исследования проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, состоящего из цифровой камеры VIDI CAM (Россия), адаптированной к световому микроскопу Nikon Eclipse E200 (Китай) при увеличении *400 и *1000, персонального компьютера и лицензионного программного обеспечения для морфометрического анализа ВидеоТест-Морфология 5.2.
Результаты морфометрических исследований представлены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения среднего (m). Оценку межгрупповых различий проводили по критерию Данна и Манна-Уитни с использованием пакета программ SigmaStat 3.5 для Windows, Systat Software, Inc., США, 2006. Различия признавали значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
В результате шестинедельного введения эти-ленгликоля в почках крыс контрольной группы развивался выраженный оксалатный неф-ролитиаз, что подтверждалось характерными морфологическими признаками. При окраске гематоксилином и эозином гистологических препаратов почек животных контрольной группы эпителий канальцев находился в состоянии гидропической, гиалиново-капельной дистрофии и некробиоза. Апикальный край клеток разрушен, щеточная кайма не видна. Большинство канальцев кистозно растянуты, клетки выстилающего канальцы нефротелия уплощены и атрофичны. Вокруг канальцев определялась выраженная воспалительная лимфоплазмоци-тарная инфильтрация. Сосуды находились в состояния полнокровия (рисунок 1).
Рисунок 1 - Отложения крупных депозитов в просветах канальцев (показаны стрелками). Экспериментальный нефролитиаз. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение *400.
При окрашивании метенамин-серебром ба-зальные мембраны канальцев выглядели утолщенными. При окраске по Коссу в цитоплазмах клеток эпителия канальцев в различном количестве, поодиночке или группами, обнаружены кальциевые депозиты коричневато-черного цвета различной формы и размера. Крупные образования зафиксированы в просветах канальцев. Непосредственно в цитоплазме клеток
отмечено формирование крупных микролитов из более мелких и выход конкрементов в просвет канальца (рисунок 2). В просветах канальцев число депозитов в поле зрения при увеличении х1000 варьировалось от 1 до 4 и в среднем составляло 2,6±0,5. По результатам компьютерной морфометрии площадь депозитов составляла от 0,95 мкм2 до 41,8 мкм2 и в среднем равнялась 11,5±1,7 мкм2 (таблица 1).
Рисунок 2 - Формирование крупных депозитов из более мелких непосредственно в цитоплазме и выход конкремента в просвет канальца (показано стрелками). Экспериментальный нефролитиаз. Окраска метенамин-
серебром. Увеличение *1000.
Количество и площадь депозитов в канальцах крыс на фоне введения настоя подмаренника настоящего травы (1:10)
Группа исследования Число крупных депозитов в просвете канальцев Площадь депозита, мкм2
Контрольная группа 2,6±0,5 11,5±1,7
Опытная группа 1,5±0,3 4,2±1,5*
рк=0,004
Примечания: * - различия статистически значимы по сравнению с показателями контрольной группы, рк - уровень статистической значимости различий в опытной и контрольной группах.
Анализ распределения депозитов в зависимости от их площади демонстрирует доминирование крупных микролитов площадью более 3,0 мкм2, доля которых составляет 66% от общего количества образований данной локализации. Депозиты меньшей площади распределены следующим образом: 14% кальциевых
депозитов площадью от 1,46 мкм2 до 3,0 мкм2 и 20% мелких депозитов площадью от 0,2 мкм2 до 1,45 мкм2. Гистограмма распределения депозитов камней сдвинута вправо с пиком распределения в области площади камней 3,1 мкм2 и более (до 66%), что может свидетельствовать об активном камнеобразовании (рисунок 3).
0,2-1,45 мкм2 1,46-3,0 мкм2 3,1 и более мкм2
□ контрольная группа □ подопытная группа
Рисунок 3 - Распределение депозитов в почках в зависимости от площади в контрольной группе и опытной группе исследования. По оси абсцисс - площадь депозита, мкм2; по оси ординат - процентное содержание, %.
На гистологических препаратах почек крыс, получавших настой подмаренника настоящего, наблюдали явления очаговой гиалиново-капельной дистрофии. При этом у большинства клеток сохранен апикальный край, а на большинстве участков отчетливо видна щеточная кайма. Кистозно растянуты только канальцы, содержащие депозиты камней; клетки нефроте-лия уплощены и атрофичны. Вокруг пораженных канальцев определялась слабо выраженная воспалительная инфильтрация, состоящая из лимфоцитов и плазматических клеток (рису-
нок 4). Сосуды находились в состоянии умеренного полнокровия.
При окрашивании метенамин-серебром ба-зальные мембраны канальцев имели очаговые утолщения. При окраске по Коссу в цитоплазмах клеток эпителия канальцев в различном количестве, поодиночке и небольшими группами, располагались коричневато-черного цвета мелкие кристаллы депозитов округлой или овальной формы. В просветах канальцев определяли единичные отложения небольших депозитов камней (рисунок 5).
Рисунок 4 - Единичные небольшие депозиты в просветах канальцев (показано стрелкой). Экспериментальный нефролитиаз после лечения отваром подмаренника настоящего травы (1:10). Окраска гематоксилином и
эозином. Увеличение *400.
Рисунок 5 - Единичный крупный депозит в просвете канальца (показан стрелкой). Экспериментальный нефролитиаз после лечения отваром подмаренника настоящего травы (1:10). Окраска метенамин-серебром.
Увеличение *1000.
Количество депозитов в группе лечения по сравнению с контрольной группой уменьшалось на 42% и в среднем составляло 1,5±0,3. Замедление литогенеза у крыс данной группы подтверждается достоверным уменьшением площади депозитов более чем в 2,7 раза (р<0,01) (таблица 1).
Отмечены изменения в распределении обнаруженных микролитов в зависимости от площади: доля крупных депозитов площадью более 3,0 мкм2 уменьшилась почти втрое по сравнению с аналогичным показателем не-леченных животных: от 66 до 23,1%. Происходило перераспределение численности мелких
и средних микролитов на фоне применения водных извлечений травы подмаренника настоящего. В 26,1% наблюдений обнаруживали депозиты площадью от 1,46 мкм2 до 3,0 мкм2. Дезагрегация крупных микролитов приводила к росту доли мелких (от 0,2 мкм2 до 1,45 мкм2) до 53,8% по сравнению с аналогичным показателем 20% в контрольной группе, что нашло отражение в сдвиге максимума распределения на упомянутой гистограмме в сторону мелких микролитов площадью от 0,2 мкм2 до 1,45 мкм2 (рисунок 3).
Согласно результатам проведенного исследования, на исходе шестой недели развития оксалатного нефролитиаза крыс, индуцированного длительным непрерывным применением 1%-ого раствора этиленгликоля в виде питья ad libitum, зарегистрированы морфологические признаки литогенных процессов, что подтверждено формированием кальций-позитивных образований различных размеров от 0,2 до 3,0 и более мкм2 с преимущественной локализацией в области почечного сосочка.
Настой подмаренника настоящего травы (1:10) в режиме трехнедельного лечения на фоне продолжающейся этиленгликольной интоксикации препятствует образованию новых депозитов и формированию имеющихся. Замедление процессов ренального литогенеза, инициированное биологически активными веществами подмаренника настоящего, морфологически подтверждается уменьшением количества депозитов и их размеров по сравнению с показателями литогенизированных крыс. Перераспределение состава депозитов с доминированием более мелких и дезагрегацией крупных депозитов под действием фитокомплекса подмаренника свидетельствует о влиянии БАВ растения на соотношение интенсивности процессов нуклеации и роста кристаллов оксалата кальция в патологическом очаге, что превращает подмаренник настоящий в привлекательный антилитогенный агент с точки зрения патогенетической терапии МКБ [8].
Одним из факторов, обеспечивающих вторичную гиперсатурацию мочи в процессе литогенеза, является определенное соотношение ионов кальция и цитрат-ионов [10]. Надземная часть растения содержит значительные количества лимонной кислоты, а группа полифеноль-ных соединений подмаренника эффективна при патологиях, связанных с нарушениями всасывания кальция [7, 11]. Логично предположение об ингибирующем влиянии подмаренника настоящего на уровень пересыщения мочи ио-нами-литогенами, в первую очередь, кальция и оксалатами, за счет конкурирующего хела-тирования ионов кальция цитратами, а также о воздействии на транспорт ионов кальция в почечных канальцах [10, 12].
Процессы литогенеза ассоциированы с воспалительным процессом, поэтому закономерно зарегистрированное после курса лечения фитопрепаратом уменьшение явлений воспаления, а также восстановление структуры и функции почечного эпителия [13].
Заключение
Таким образом, проведенное морфологическое исследование в области фармакокоррек-ции экспериментального оксалатного нефро-литиаза доказывает эффективность препаратов надземной части подмаренника настоящего в фитотерапии МКБ и определяет целесообразность дальнейших исследований по оценке отдельных видов биологической активности, имеющих патогенетическое значение в фарма-кокоррекции нефропатологии различного ге-неза.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список литературы:
1. Капсаргин Ф.П., Гульман М.И., Неймарк
A.И. К вопросу о выборе рационального метода лечения нефролитиаза. Урология. 2010; 3:26-30.
2. Брюханов В.М., Жарикова Г.В. Современные представления о методах лечения мочекаменной болезни. Бюллетень медицинской науки. 2018; 1:42-54.
3. Ермоленко Т.И. Перспективы применения фитопрепаратов в лечении мочекаменной болезни. Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. 2014; 27:205-211.
4. Ткачук В.Н., Аль-Шукри С.Х. Опыт применения фитотерапии у больных нефролитиазом после дистанционной ударно-волновой лито-трипсии. Урология. 2011; 5:8-10.
5. Мазко О.Н., Макарова О.Г., Кирьякова
B.О., Пашков А.П. Противовоспалительная активность настоя подмаренника настоящего травы. Бюллетень медицинской науки. 2017; 2:11-13.
6. Тиктинский О.Л., Александров В.П. Мочекаменная болезнь. СПб.: Питер, 2000. 384.
7. Старчак Ю.А. Фармакогностическое изучение растений рода подмаренник: автореф. дис. ... канд. фармацевт. наук: 15.00.02 / Ю.А. Старчак; ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Курск, 2009: 24.
8. Жариков А.Ю., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М., Лампатов В.В. Механизм формирования кристаллов при оксалатном нефролитиазе. Нефрология. 2009; 13 (4): 37-50.
9. Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. Современные методы моделирования оксалатного нефролитиаза. Нефрология. 2008; 2 (4):33-36.
10. Зверев Я.Ф., Брюханов В.М., Лампатов В.В., Жариков А.Ю. Современные представления о роли физико-химических факторов в патогенезе кальциевого нефролитиаза. Нефрология. 2009; 13 (1):39-50.
11. Малашихин А.А., Сбежнева В.Г. Использование подмаренника настоящего в комплексном лечении псориаза. Врач скорой помощи. 2009; 11:42-44.
12. Шпоть Е.В., Султанова Е.А. Цитратная терапия мочекаменной болезни. Фарматека. 2012; 4:68-71.
13. Кочкаров М.Х., Шевченко А.М. Препараты минерального и растительного происхождения, используемые для лечения и профилактики мочекаменной болезни. Фармация и фармакология. 2015; 6 (13):5-11.
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Азарова Ольга Васильевна, д.б.н., профессор кафедры общей и биологической химии, клинической лабораторной диагностики Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40. Тел.: (3852) 566938; +79132764320. E-mail: kunaza00@mail.ru
Информация об авторах
Мазко Олеся Николаевна, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биомедицины Центра медико-биологических исследований Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566891. E-mail: olesia.mazko@yandex.ru
Макарова Олеся Геннадьевна, к.ф.н., старший научный сотрудник лаборатории биомедици-
ны Центра медико-биологических исследований Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, пер. Некрасова, 65. Тел.: (3852) 566893. E-mail: olesia552@mail.ru
Бобров Игорь Петрович, старший научный сотрудник морфологической лаборатории Центра медико-биологических исследований Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656050, г. Барнаул, ул. Юрина, 168Н. Тел.: (3852) 566945. E-mail: science@agmu.ru
Жарикова Ганна Викторовна, преподаватель кафедры общей и биологической химии, клинической лабораторной диагностики Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566938. E-mail: ganna1704@mail.ru
Кореновский Юрий Владимирович, к.м.н., заведующий кафедрой общей и биологической химии, клинической лабораторной диагностики Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40. Тел.: (3852) 566938. E-mail: timidin@gmail.com
Кальницкий Артем Сергеевич, студент фармацевтического факультета Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.
656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40. Тел.: (3852) 566862. E-mail: science@agmu.ru
