CC BY
44
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Статья поступила в редакцию 26.03.2014 г.
Мотин Ю.Г., Бгатова Н.П., Лепилов А.В., Лампатов В.В., Жариков А.Ю., Мотина Н.В.
Алтайский государственный медицинский университет,
г. Барнаул,
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии»,
г. Новосибирск
РАННИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НОЧКИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОКСАЛАТНОМ НЕФРОЛИТИАЗЕ
С целью оценки изменения биосинтетической активности тканевых элементов почки, морфологических и ультраструктурных изменений эпителия почечных канальцев и собирательных трубок при развитии литогенных процессов проведено морфологическое и ультраструктурное исследование почек крыс с моделью оксалатного нефролитиаза. Электронно-микроскопическое исследование эпителия почечных канальцев и собирательных трубок показало расширение элементов гранулярной эндоплазматической сети, повреждение митохондрий, формирование аутолизосом, проапоп-тозные изменения клеток. Выявлены разнонаправленные изменения биосинтетической активности тканевых элементов почки крыс с экспериментальным оксалатным нефролитиазом. В зонах интенсивного литогенеза наблюдалось снижение биосинтетической активности эпителиоцитов канальцев и повышение активности клеточных элементов интерстиция, что рассматривается как компенсаторная реакция, направленная на сдерживание литогенных процессов.
Ключевые слова: экспериментальный нефролитиаз; морфология почки; эндоплазматический ретикулум; митохондрии.
Motin Yu.G., Bgatova N.P., Lepilov A.V., Lampatov V.V., Zharikov A.Yu., Motina N.V.
Altai State Medical University, Barnaul,
Scientific Institution of Clinical and Experimental Lymphology, Novosibirsk
EARLY MORPHOLOGICAL AND ULTRASRUCTURAL KIDNEY CHANGES
IN EXPERIMENTAL OXALATE NEPHROLITHIASIS
To assess the changes in biosynthetic activity of kidney tissue elements, morphological and ultrastructural changes in the tubular epithelial cells in the development of lithogenic processes carried out morphological and ultrastructural studies of the kidneys of rats with experimental oxalate nephrolithiasis. Ultrasructural examination of tubular epithelial cells revealed dilatation of rough endoplasmic reticulum, mitochondria injury, formation of autolysosomes and presence of apoptotic cells. We identify the opposite changes of biosynthetic activity tissue elements in the kidney of rats with experimental oxalate nephrolithiasis. In sites of intensive lithogenesis kidney tubule epithelium synthetic activity decreased and interstitial cellular elements synthetic activity increased that is considered as a compensatory response directed to lithogenesis inhibition.
Key words: experimental oxalate nephrolithiasis; morphology of kidney; endoplasmic reticulum; mitochondria.
Одним из самых распространенных заболеваний в урологической практике является нефролитиаз. До сих пор нет единого мнения о причинах и механизмах формирования почечных камней. Еще в прошлом столетии сформировались две основные теории образования камней в почках. Согласно одной из них, в основе камнеобразования лежит нарушение коллоидного состояния мочи с атипической кристаллизацией солей. Сторонники другой считают, что основой камня является белоксодержащее скелетное вещество (матрица), в которой располагаются кристаллы [1]. Почечные камни могут различаться по химическому составу, но наиболее часто они представлены кальциевой солью щавелевой кислоты [2]. Установлено, что кристаллы оксалата кальция способны индуцировать тканевые реакции в эпителии дистальных отделов почечных канальцев и собирательных трубок [3]. В то же вре-
Корреспонденцию адресовать:
МОТИН Юрий Григорьевич,
656038, г. Барнаул, пр. Ленина, д. 40, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России. Тел.: 8 (3852) 24-19-62.
E-mail: [email protected]
мя, остаются недостаточно изученными вопросы морфологической перестройки эпителиоцитов почечных канальцев и собирательных трубок, трансформации интерстициальных элементов почки на начальных стадиях нефролитиаза.
Цель исследования — оценить изменение биосинтетической активности тканевых элементов почки, морфологические и ультраструктурные изменения эпителия почечных канальцев и собирательных трубок при развитии литогенных процессов в эксперименте.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальная модель оксалатного нефролитиаза была выполнена на 60 сертифицированных самцах крыс линии Wistar массой тела от 180 до 250 г.
Все животные были разделены на три группы по 20 крыс. Крысы первой группы находились на обще-виварном рационе, получали в качестве питья водопроводную воду, мочекаменная болезнь не инициировалась. Данная группа использовалась в качестве контрольной. Животные второй группы на фоне стандартной диеты в течение 21 дня получали в качестве питья 1 % водный раствор этиленгликоля в свободном доступе, что индуцировало развитие оксалатно-
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 2 2015
43
РАННИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОЧКИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОКСАЛАТНОМ НЕФРОЛИТИАЗЕ
го экспериментального нефролитиаза [4]. Животные третьей группы находились в условиях стандартной диеты в течение 42 дней и получали для питья 1 % раствор этиленгликоля.
Для гистологического исследования животных де-капитировали путем дислокации шейного позвонка под эфирным наркозом с соблюдением требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других научных целей» (Страсбург, 1986 г.), и Федерального закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. На данное исследование получено разрешение этического комитета Алтайского государственного медицинского университета. Материалом исследования послужила почка крысы. Орган фиксировали в 10 % растворе формалина, обрабатывали по стандартной методике, заливали в парафин. Поперечные срезы через почечный сосочек толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Для выявления отложений соединений кальция использовали импрегнацию серебром по методу Коса. Определение функциональной активности клеток эпителия собирательных трубок и фибробластов производилось при помощи окраски на AgNORs.
Для электронно-микроскопического исследования образцы почки фиксировали в 4 % растворе параформа, приготовленном на среде Хенкса, затем в 1 % растворе ОsO4 на фосфатном буфере (pH = 7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм на ультратоме Leica EM UC7, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата, цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1400 («Jeol») при ускоряющем напряжении 80 кВ с последующим фотографированием при увеличениях от 6000 до 80000 раз.
Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.4LE.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета R версии 2.12
(лицензия GNU General Public License) для Microsoft Windows®. Оценку межгрупповых различий проводили по критерию Дана. Результаты работы представлены в виде значений (средняя арифметическая) ± SD (стандартное отклонение).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
У животных контрольной группы наблюдали нормальную гистологическую картину строения коркового и мозгового вещества почки. Размер просвета собирательных трубок составил в среднем 15,5 ± 0,53 мкм. Кальциевые депозиты у крыс интактной группы гистохимически не верифицированы. Ультраструктурных изменений не выявлялось. Количество ядрышковых организаторов на ядро в клетках эпителия составляло 1,5 ± 0,13, в фибробластах ин-терстиция — 1,2 ± 0,17. Большинство ядер эпители-оцитов собирательных трубок содержали один ядрышковый организатор (54,5 ± 3,51 %), количество ядер с двумя ядрышковыми организаторами составляло 32,7 ± 1,58 %, с тремя и более — 12,8 ± 1,49 %.
После 3-х недель моделирования оксалатного неф-ролитиаза в почках наблюдались дистрофические изменения эпителия канальцев и собирательных трубок в виде гидропической дистрофии, расширение просвета собирательных трубок (19,3 ± 0,41 мкм), слущенный эпителий и белковые депозиты в просвете собирательных трубок (рис. 1).
В эпителии канальцев и собирательных трубок, в интерстиции мозгового вещества, в просветах собирательных трубок в составе белковых цилиндров обнаруживались умеренные отложения соединений кальция (в среднем 17,1 ± 2,00 в поле зрения). Характерной являлась локализация соединений кальция — преимущественно в области основания и средней трети почечного сосочка. Средний размер депозитов составил 9,2 ± 0,43 мкм. В 10 % наблюдений обнаруживались довольно крупные микролиты (размером до 38,5 мкм) с обтурацией просвета тонких канальцев и собирательных трубок, инкрустацией их эпителия соединениями кальция. В зонах отложения кальция выявлялись разрастания соединительной ткани с формированием перитубулярного и периваскуляр-ного фиброза.
У животных с экспериментальным нефролитиазом показатели среднего количества AgNORs статисти-
Сведения об авторах:
МОТИН Юрий Григорьевич, канд. мед. наук, доцент, кафедра гистологии, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул, Россия. E-mail: [email protected]
БГАТОВА Наталия Петровна, доктор биол. наук, профессор, руководитель лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии», г. Новосибирск, Россия. E-mail: [email protected] ЛЕПИЛОВ Александр Васильевич, доктор мед. наук, профессор, кафедра патологической анатомии с секционным курсом, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул, Россия. E-mail: [email protected]
ЛАМПАТОВ Вячеслав Витальевич, доктор биол. наук, профессор, кафедра фармакологии, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул, Россия.
ЖАРИКОВ Александр Юрьевич, доктор биол. наук, профессор, кафедра фармакологии, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул, Россия. E-mail: [email protected]
МОТИНА Наталья Владимировна, канд. мед. наук, доцент, кафедра гистологии, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул, Россия. E-mail: [email protected]
44
T. 14 № 2 2015 MediciinnLass
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рисунок 1
Экспериментальный нефролитиаз 3 недели. Слущивание эпителиоцитов собирательных трубок с расположением спущенных элементов в просвете, дистрофические изменения эпителия, пикноз ядер. Инкрустация эпителия тонкого канальца. Полутонкий срез, окраска толуидиновым синим. х 400 Figura 1
Experimental nephrolithiasis 3 weeks.
Desquamation of collecting duct epithelial cells, degenerative changes in the epithelium, nuclei pyknosis. Calcium inlay epithelium of the thing tubules.
Semithin sections, toluidine blue stain. х 400
чески значимо отличались от показателей интактной группы и на третьей неделе эксперимента составляли 1,29 ± 0,14 в клетках эпителия и 1,72 ± 0,19 в фибробластах. При этом нарастало количество эпителиоцитов с одним ядрышковым организатором (68,2 ± 2,42 %); количество клеток с двумя AgNORs составляло 28,1 ± 1,47 %; с тремя и более AgNORs — 3,7 ± 0,69 %.
Электронно-микроскопическое исследование показало ультраструктурные изменения эпителиоцитов канальцевой системы почки и собирательных трубок, затрагивающие клеточные органеллы, ядра и клеточные мембраны. Видимые светооптические изменения эпителиоцитов по типу гидропической дистрофии электронно-микроскопически проявлялись расширением цистерн гранулярной эндоплазматической сети (грЭПС) и формированием различного размера вакуолей (рис. 2). Содержимое большинства из них было электронносветлым, на поверхности мембран определялись одиночные, неравномерно расположен-
ные рибосомы. Отмечались умеренные изменения митохондрий в виде набухания, нарушения целостности внутренней мембраны, нарушения структуры крист. Ультраструктурные изменения в большей степени затрагивали апикальные части клеток; базальные полюса эпителиоцитов страдали в меньшей степени. Микроворсинки апикальной части клеток несколько сглаживались, но обычно сохранялись. Цитоплазма клеток и отдельные увеличенные митохондрии содержали мелкие электронноплотные депозиты кальция. Эндоплазматическая сеть таких клеток была значительно расширена. Ядра отдельных клеток были сморщенными, отмечался кариорексис и кариолизис; в цитоплазме определялись лизосомы с ламеллярным содержимым, иногда аутофагосомы. Отмечалось разрыхление и гомогенизация базальной мембраны.
При продолжающемся воздействии этиленгликолем до 6 недель выявлялась выраженная патогистологическая перестройка тканей почки с дистрофическими и некробиотическими изменениями клеток и тканевых структур. Отложения кальция располагались на всей площади почечного сосочка, включая верхушку, и, реже, в канальцах коркового вещества, в больших количествах, в среднем 27,4 ± 3,22 (с максимальными значениями 57) в поле зрения. Характерным являлось наличие отложений соединений кальция в просвете элементов петли (тонком и восходящем толстом — прямом дистальном канальце) и в собирательных трубках часто с выраженной инкрустацией их эпителия. Обнаруживаемые кальциевые депозиты были сравнительно крупными, в среднем составляя 11,8 ± 0,62 мкм. В 40 % наблюдались крупные соединения кальция (размером до 57,4 мкм), обтурирующие канальцы петли нефрона или собирательные трубки.
На этом фоне показатели среднего количества AgNORs составляли 1,27 ± 0,19 в клетках эпителия и 1,8 ± 0,09 в фибробластах. При этом нарастало количество эпителиоцитов с одним ядрышковым организатором (72,8 ± 2,28 %); количество клеток с двумя AgNORs составляло 25,9 ± 1,21 %; с тремя и более AgNORs - 1,3 ± 0,91 %.
Отмечались выраженные ультраструктурные изменения эпителиоцитов канальцев и собирательных трубок. Наблюдалось расширение цистерн грЭПС с формированием электронносветлых вакуолей. На поверхности мембран определялись одиночные, нерав-
Information about authors:
MOTIN Yury Grigoryevich, candidate of medical sciences, docent, department of histology, Altai State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: [email protected]
BGATOVA Natalia Petrovna, doctor of biological sciences, professor, head laboratory of ultrastructural researches, Research Institute of Clinical and Experimental Limfology, Novosibirsk, Russia. E-mail: [email protected]
LEPILOV Alexander Vasilyevich, doctor of medical sciences, professor, department of pathological anatomy with a section course, Altai State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: [email protected]
LAMPATOV Vyacheslav Vitalyevich, doctor of biological sciences, professor, department of pharmacology, Altai State Medical University, Barnaul, Russia.
ZHARIKOV Alexander Yuryevich, doctor of biological sciences, professor, department of pharmacology, Altai State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: [email protected]
MOTINA Natalya Vladimirovna, candidate of medical sciences, docent, department of histology, Altai State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: [email protected]
О'Йййя#та
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 2 2015
45
РАННИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОЧКИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОКСАЛАТНОМ НЕФРОЛИТИАЗЕ
Рисунок 2
Ультраструктура эпителиоцитов собирательной трубки при экспериментальном нефролитиазе (3 недели). Расширение цистерн грЭПС, набухание митохондрий с просветлением матрикса, нарушением правильного расположения крист. х 10000 Figura 2
Ultrastructure of tubular epithelial cells in experimental nephrolithiasis (3 weeks). Dilatation of endoplasmic reticulum, mitochondrial swelling. х 10000
номерно расположенные рибосомы. Наблюдалась сглаженность базальной плазмолеммы, уменьшение числа митохондрий. В цитоплазме располагались гигантские митохондрии, с набуханием, просветлением матрикса, выраженными деструктивными изменениями крист и мембран (рис. 3). Определялись мелкие электронноплотные депозиты кальция, фиксированные в структурах цитоплазмы и внутри митохондрий на поврежденных кристах. Часто в митохондриях формировались ампулярные расширения крист, где также фиксировались соли кальция (рис. 4). Ядра эпителиоцитов подвергались кариорексису и карио-лизису; в цитоплазме определялись лизосомы с ламеллярным содержимым, аутофагосомы, часто содержавшие остатки митохондрий. Отмечалось разрыхление и гомогенизация базальной мембраны, увеличение количества коллагеновых волокон между базальной мембраной эпителия и гемокапиллярами.
ОБСУЖДЕНИЕ
Выраженность морфологической перестройки, ультраструктурных изменений эпителия почечных канальцев, зависит от сроков моделирования экспериментального нефролитиаза (сроков воздействия этиленгликоля) и от выраженности отложения солей кальция. На начальных сроках модели нефролити-аза характерным являлось распределение микролитов преимущественно в области основания и средней трети почечного сосочка. Наблюдалось снижение функциональной биосинтетической активности эпи-телиоцитов: снижалось среднее количество гранул
AgNORs в ядрах клеток, нарастало количество клеток с одним AgNORs (до 68 %). Отложение соединений кальция сопровождалось тканевой реакцией интерстиция с активацией фибробластов (среднее количество AgNORs в 1,4 раза превышало показатели интактной группы), образованием соединительнотканных элементов. При этом наблюдались ультраструктурные изменения эпителиоцитов канальцевой системы почки и собирательных трубок, затрагивающие клеточные органеллы, ядра и клеточные мембраны. Отмечались умеренные изменения митохондрий в виде набухания, нарушения целостности внутренней мембраны, нарушения структуры крист. В отдельных эпителиоцитах обнаруживались признаки проапоптозного изменения клеток: кариопикноз и кариорексис, формирование аутолизосом. В зонах интенсивного литогенеза обнаруживались крупные вакуоли с немногочисленными, неравномерно расположенными на поверхности мембран рибосомами, что позволило идентифицировать эти элементы как расширенные цистерны гранулярной эндоплазматической сети.
Следует обратить внимание, что ранее на этих сроках моделирования нефролитиаза было установлено изменение экспрессии белков-модуляторов литогенных процессов канальцевым эпителием [5] и выявленные нарушения ультраструктуры грЭПС могут объяснять указанные изменения. По всей видимости, наблюдавшиеся ультраструктурные изменения эпителиоцитов канальцевой системы почки и собирательных трубок следует рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на сдерживание литогенных процессов. Более выраженные изменения отмечались в апикальных полюсах эпителиоци-тов, что вероятно объясняется процессом миграции нерастворимых соединений кальция из просвета почечных канальцев в цитоплазму клеток и далее в ин-терстиций [6].
На 6-й неделе эксперимента микролиты располагались по всей площади почечного сосочка, повреждение клеток эпителия были более выраженными, отмечались некробиотические изменения. В этой связи значительно снижалась биосинтетическая активность эпителиоцитов в зонах интенсивного литогенеза, что подтверждается снижением среднего количества гранул серебра в ядрах клеток на 15 % по сравнению с показателями интактных животных, продолжалось увеличение содержания клеток с одним AgNORs (до 72,8 %). Биосинтетическая активность элементов ин-терстиция продолжала нарастать, что можно объяснить тенденцией к ограничению очага литогенеза. Наблюдавшиеся ультраструктурные изменения клеток были выражены в значительно большей степени. Определялись дистрофические и деструктивные изменения эпителиоцитов: сглаженность базальной плазмолеммы, уменьшение числа митохондрий, их выраженный отек с просветлением матрикса, деструкция крист, кариорексис и кареолизис. На фоне продолжавшейся перестройки элементов эндоплазматической сети, проапоптозных и деструктивных изменений клеток, отмечалось формирование гигантских мито-
46
T. 14 № 2 2015
Medicine
in Kuzbass
ОЛ&Эицина
в Кузбассе
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рисунок 3
Ультраструктура эпителиоцитов собирательной трубки при экспериментальном оксалатном нефролитиазе (6 недель). Пикнотические изменения ядра, расширение элементов грЭПС, гигантские митохондрии, с просветлением матрикса, набуханием и деструкцией крист. х 20000 Figura 3
Ultrastructure of tubular epithelial cells in experimental nephrolithiasis (6 weeks). Nuklei pycnosis, dilatation of endoplasmic reticulum, giant mitochondria, with enlightenment matrix swelling and cristae destruction. х 20000
хондрий с характерными ампулярно расширенными кристами, на которых часто фиксировались соединения кальция. Вероятно, такая структурная перестройка обусловлена продолжающимся воздействием повреждающих агентов и усилением процессов литогенеза.
ВЫВОДЫ:
Таким образом, в проведенном исследовании на ранних сроках литогенеза отмечены ультраструктур-
Рисунок 4
Гигантская митохондрия в эпителии собирательной трубки при экспериментальном нефролитиазе (6 недель). Набухание, просветление матрикса, формирование ампулярно расширенных крист с фиксированными соединениями кальция.
х 80000 Figura 4
Giant mitochondria in the collecting duct epithelium (experimental nephrolithiasis 6 weeks). Swelling, enlightenment matrix, formation ampullary cristae with fixing calcium compounds.
х 80000
ные изменения, затрагивающие клеточные органел-лы, ядра и клеточные мембраны. Выявлены разнонаправленные изменения биосинтетической активности тканевых элементов почки: снижение биосинтетической активности эпителиоцитов канальцев в зонах интенсивного литогенеза и повышение активности клеточных элементов интерстиция, что, по всей видимости, следует рассматривать как проявление компенсаторной реакции клеток, направленную на сдерживание литогенных процессов.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:______________________________________________________________________________________
1. Nazarov T.N. Physicochemical basis of lithogenic properties of urine. Urology. 2007; (5): 73-77 Russian (Назаров Т.Н. Физико-химические основы камнеобразующих свойств мочи //Урология. 2007; 5: 73-77.)
2. Voshhula VI. Urolithiasis: etiotropic and pathogenetic treatment, prevention. VE'VE'R, Mn., 2006. 286 p. Russian (Вощула В.И. Мочекаменная болезнь: этиотропное и патогенетическое лечение, профилактика. ВЭВЭР, Мн., 2006. 286 с.)
3. Khan SR. Experimental calcium oxalate nephrolithiasis and the formation of human urinary stones. Scanning Microsc. 1995; 9(1): 89-100.
4. Green ML, Hatch M, Freel RW. Ethylene glycol induces hyperoxaluria without metabolic acidosis in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 2005; 289: 536-543.
5. Zharikov AYu., Motin YuG, Zverev YaF, Lampatov VV, Bryuxanov VM, Talalaeva OS. Expression of renal crystallization inhibitors in experimental nephrolithiasis. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2012; 153(2): 249-253. Russian (Жариков А.Ю., Мотин Ю.Г., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Брюханов В.М., Талалаева О.С. Особенности экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. № 2. С. 249-253.)
6. Khan SR. Experimental calcium oxalate nephrolithiasis and the formation of human urinary stones. Scanning Microsc. 1995; 9(1): 89-100.
fZrrMeduiiwa
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 2 2015
47
