CC BY
43
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2012 БИОЛОГИЯ Вып. 3
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.852.11:579.869
ЕХЮЮВАСТЕШиМ ЭР. 1*834 -
ГАЛОАЛКАЛОТОЛЕРАНТНАЯ ФАКУЛЬТАТИВНО
АНАЭРОБНАЯ НЕСПОРООБРАЗУЮЩАЯ БАКТЕРИЯ
ПОРЯДКА ВАС1ЫА1Е8 ИЗ ШЛАМОХРАНИЛИЩА
КАЛИЙНОГО РУДНИКА
Е. М. Реутских, А. И. Саралов
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; reutskix@mail.ru;
(342)2808332
Из техногенных вод шламохранилища СКРУ-3 ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск, Пермский край) изолирована оранжево-пигментированная галоалкалотолерантная аспорогенная бактерия (штамм 11834). Согласно филогенетическому анализу данных секвенирования гена 168 рРНК, этот штамм наиболее близок к видам рода Exiguobacterium семейства тсепае .\edis порядка ВасИШев (93.8-99.7%). По совокупности фенотипических, хемотаксономических и генотипических признаков, исследуемый организм на данном этапе работ определен как Ех'щиоЬааег'шт ер. 11834 (10966108).
Ключевые слова: галоалкалотолерантные бактерии; Exiguobacterium; клеточные жирные кислоты; ген 168 рРНК; филогенетический анализ.
Введение
За последние годы таксономия и номенклатура грамположительных спорообразующих и аспороген-ных бактерий порядка Bacillales (класс “Bacilli”, фи-лум Firmicutes) претерпели существенные изменения [Garrity, Bell, Lilbum, 2005; Ludwig, Klenk. 2005; Pruesse et al., 2007]. В третьем издании Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology в порядок Bacillales включено 12 семейств [Ludwig, Schleifer, Whitman, 2008]. По сравнению со вторым изданием определителя бактерий Берги [Garrity, Bell, Lilbum, 2005], в семействе Bacillaceae количество родов увеличено с 8 до 12. Однако аспорогенные палочковидные бактерии рода Exiguobacterium из-за неясного таксономического описания из семейства Bacillaceae выделены в отдельное семейство incertae sedis. Настоящая работа посвящена изучению штамма RS34, выделенного из шламохранилища калийного рудника, и описанию его в качестве вида рода Exiguobacterium.
Объекты и методы исследования
В июле 2008 г. изучали микрофлору шламохранилища СКРУ-3 ОАО “Уралкалий” (г. Соликамск, Пермский край). В техногенных водах шламохранилища, имеющего площадь около 5 га и максимальную глубину 10 м, от поверхности до дна понижалась температура, содержание растворенного кислорода и pH (от 9.5 до 6.4), повышалось количество бактериоподобных клеток по прямому счету (от 15 до 45 млн кл/мл) и общая минерализация (от 120 до 305 г/л). Растворенное органическое вещество в рассолы шламохранилища поступало в основном с водосборной площади и в составе технологических смесей гидрохлоридов (С8-С24)-МО-ноаминов, в результате деструкции которых содержание аммонийного азота в поверхностном слое водной толщи достигало 50 мг/л. Наше внимание было обращено на тот факт, что среди галотоле-рантных сапрофитов, выявляемых на разбавленном в 10 раз мясо-пептонном бульоне с 60 г/л №С1, иногда доминировали грамположительные неспорообразующие короткие палочки с оранжевым пигментом. Методом последовательных пересевов сначала на жидких, затем на плотных средах
© Реутских Е. М., Саралов А. И., 2012
был получен и очищен изолят RS34. По первичным данным BLAST-анализа последовательностей нуклеотидов гена 16S рРНК, штамм RS34 имел высокий уровень сходства с рядом видов рода Exiguobacterium.
Для длительного хранения культур штамма RS34 (в пробирках на скошенном агаре под резиновыми пробками при 2-3°С) использовали сложную среду, обеспечивающую стабильный аэробный рост при pH 7.8-8.0 и 35-37°С (г/л): агар Difco - 20; NaCl - 30; MgS04 7Н20 - 1; СаС12 -2Н20 -0.1; NaHCCb - 0.5; К2НР04 - 0.3; NH4C1 - 0.3; гидролизат казеина и триптон - по 3; дрожжевой экстракт - 1; сахароза - 2; микроэлементы по Пфеннигу - 1 мл/л.
Хемотаксономические и молекулярно-генетические
исследования
Определения состава полярных липидов мембран и внутриклеточных жирных кислот, молекулярно-генетические анализы выполняли с применением недавно описанных нами методов при изучении галофильных изолятов из рассолов и пенных продуктов обогащения калийных минералов СКРУ-2 и СКРУ-3 [Саралов и др., 2012а, б]. Нуклеотидная последовательность гена 16 S рРНК Exiguobacterium sp. RS34 депонирована в международную базу данных GenBank под номером JQ966108.
Результаты и их обсуждение
Штамм RS34 представлен грамположительны-ми подвижными короткими палочками размером
1.0-1.1x1.2-1.5 мкм (в стационарной фазе). Размножается бинарным делением в одной плоскости, спор и покоящихся форм не образует. Галоалкало-толерантен: растет на питательных средах с содержанием NaCl от 0 до 14% (оптимум 1-6%) в пределах pH 5.5-10.0 (оптимум 7.5-8.5) при 15^t5°C (оптимум 35-37°С). Хемоорганотроф, аэроб и факультативный анаэроб, способен к гетерофермен-тативному сбраживанию глюкозы. Образует ката-лазу, оксидазная реакция отрицательная. Обладает анаэробным нитратным дыханием, восстанавливает нитраты до нитритов; особенно активна анаэробная нитратредукция на лактате (слабее на пи-рувате). В качестве источника азота использует аммоний, нитраты и глутамат. Молекулярный азот не фиксирует, ацетилен до этилена не восстанавливает. Чувствителен к новобиоцину (5 мкг на диск), хлорамфениколу (10 мкг), ципрофлоксацину (10 мкг), эритромицину (10 мкг). В качестве источников углерода и энергии использует аминокислоты и пептиды, ряд углеводов и карбоновых кислот (табл. 1). Наиболее быстро растет в аэробных условиях на комплексной среде, в которой одновременно присутствуют гидролизат казеина, триптон, дрожжевой экстракт, глюкоза или сахароза. При утилизации глюкозы продуцирует органические кислоты с подкислением среды до pH 5.5 (слабее на сахарозе). Гидролизует казеин, желатин и растворимый крахмал. Твин 80 не гидролизует. При аэробном росте на поверхности агаризован-ных комплексных сред при 35-37°С через 3 дня формирует оранжевые выпуклые, круглые колонии до 2-4 мм в диаметре. Пигменты не продуцирует в анаэробных условиях: концентрированная центрифугированием суспензия клеток имеет серый цвет.
Таблица 1
Дифференцирующие признаки Exiguobacterium sp. RS34 от трех типовых штаммов видов Е. aurantiacum DSM 6208 (Collins et al., 1983), E. aestuarii DSM 16306 (Kim et al., 2005) и E. acetylicum DSM 20416 (Friihling et al., 2002). Все виды грамположительны, спор не образуют, обладают подвижностью (перитрихи), на воздухе формируют выпуклые колонии оранжевого или оранжево-желтого цвета, продуцируют каталазу и кислоты из глюкозы, мальтозы и фруктозы
Характеристика RS34 Е. aurantiacum Е. aestuarii Е. acetylicum
Диапазон (опитимум): рн 5.5-10.0 (7.5-8.5) 6.5-11.5 (8.5; 9.5) 5.0-10.5 (6.5-8.5) нд
№С1, % 0-14 (1-6) нд 0-19 (2-4) нд
Температура, °С 15^5 (35-37) 7-43 (25-37) 10^17 (30-37) 7^13 (35)
Анаэробный рост + + + -
N02' из ЫОз' + (+) + -
Ферментация глюкозы (+) + (+) -
Оксид аза - - - +
Гидролиз крахмала + + - +
Утилизация (аэробно): Г алактоза (+) (+) +
Глицерин + + нд -
Ацетат (+) - - (+)
Лактат (+) - НД нд
Продукция кислот (аэробно) из: Г алактоза +
Манноза - - + +
Рибоза - - + -
Основные полярные PG, DPG, PG, DPG, PG, DPG, РЕ, PG, DPG,
липиды мембран РЕ, PI РЕ, PL PI, PS РЕ, PL
Окончание табл. 1
Характеристика RS34 Е. aurantiacum Е. aestuarii Е. acetylicum
Основные клеточные С17:о (35.5) С17:о(36.0) С17:0(35.4) С13:0(22.0)
жирные кислоты (%) С13:0(24.9) С13:о(31.0) С13:0 (27.1) С15:0 (21.8)
С15:о (20.0) С15:0 (12.7) С15:0(16.3) С16:1 (20.9)
С1б:0 (7.5) С1б:0 (8.4) С16:0(18.4) С16:0 (14.3)
С16:1 (6.4) С12:0(3.4) Сю» (3.9) С14:0 (11.4)
Г+Ц в ДНК, мол. % 46.8 53.2-55.8 48.6 46.6
Сходство по гену 16Б рРНК, % 100 99.2 98.8 94.3
Обозначения: “+” - тест положительный, “(+)” - слабое проявление признака, - тест отрицательный, “нд” -нет данных, РО - фосфатидилглицерин, БРО - дифосфатилглицерин, РЕ - фосфатидилэтаноламин, Р1 - фосфатиди-линозит, РБ - фосфатидилсерин, РЬ - неидентифицированный фосфолипид.
Полярные липиды мембран содержат фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин, фосфати-дил-этаноламин и фосфатидилинозит. Важной особенностью изолята RS34 является его способность адаптивно изменять состав клеточных жирных кислот (ЖК). При аэробном росте на поверхности агаризованной комплексной среды с 1% NaCl при 37°С клетки из оранжевых колоний содержат более 82% разветвленных ЖК с нечетным числом атомов углерода Сию, Сп о и С15 0 (табл. 2). Однако в жид-
Таблица 2
Жирнокислотный состав (%) двух типовых штаммов видов Е. acetylicum и Е. aurantiacum [Kim et al., 2005] и Exiguobacterium sp. RS34 в комплексной среде с различным содержанием NaCl при 37°С
кой среде с 12% NaCl в статической культуре без принудительной аэрации (микроаэробные условия) непигментированные серые клетки содержат более 50% насыщенных и ненасыщенных ЖК с четным числом атомов углерода, включая Сшо и Ci&i. В зависимости от состава среды и условий культивирования, комплекс клеточных ЖК штамма RS34 может быть подобен ЖК или Е. aurantiacum, или Е. acetylicum [Friihling et al., 2002; Kim et al., 2005].
Жирная кислота Е. acetylicum Е. aurantiacum RS34
l%NaCl 12% NaCl
Изо-Спо 0.6 3.4 1.6 0.5
Изо-Ci3:0 13.5 11.5 10.4 11.1
Антеизо-Cu.o 8.5 19.5 14.5 9.4
Cl4:0 11.4 0.7 1.5 0.8
ИЗО-Ci5:0 19.7 10.4 17.6 10.1
Антеизо-Cu.o 2.1 2.3 2.4 2.2
Ci6:l COl 1С 15.8 1.3 1.6 10.5
Cl6:l C05C 1.7 - - 0.9
Ci6:l C07C 3.4 - 1.1 2.7
Изо-Сия - 4.0 3.7 10.3
Cl6:0 14.3 4.4 3.8 14.2
Cl7:l COl0c 1.5 1.8 0.8 3.7
Изо-Cl7:0 1.9 28.7 27.4 9.4
Антеизо-Сп.о - 8.3 8.1 3.6
Cl8:l C09C 2.4 2.0 1.8 4.1
Cl8:0 0.8 1.3 2.1 4.3
См:0 - - 1.1 1.6
Сумма ЖК с нечетным числом атомов углерода 47.2 82.5 82.8 49.2
Примечание. Представлены ЖК, содержание которых более 0.5% от суммы ЖК.
Содержание Г+Ц в ДНК (по методу температурной денатурации) у RS34 составляет 46.8 мол. %, фактически равно таковому у Е. acetylicum (46.6 мол. %), но ниже значения у Е. aurantiacum (53-56 мол. %). Согласно результатам филогенетического анализа последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК, штамм RS34 наиболее близок к ас-
порогенным видам рода Exiguobacterium семейства incertae sedis порядка Bacillales, но уровень сходства варьирует в широком диапазоне от 99.7 до 93.8% (рисунок). Причем изолят RS34 имеет сравнительно низкий уровень сходства (93.8-94.9%) с пресноводными и умерено галотолерант-ными видами кластера Е. acetylicum - Е. soli, но
высокий уровень сходства (97.4-99.7%) с галоал-калотолерантными видами периферического кластера Е. aurantiacum - Е. aestuarii. Наиболее высокий показатель сходства (99.7%) он имеет с валидно неописанным Е. homiense H1-R8, с типовым штаммом Е. mexicanum - 99.5%, Е. aurantiacum -99.2%, Е. aestuarii - 98.8%, но с Е. acetylicum -лишь 94.3%, Е. soli - 93.8%.
На родовом уровне галоалкалотолерантный ас-порогенный штамм Exiguobacterium sp. RS34 наиболее близко примыкает к спорообразующим термофильным видам рода Geobacillus (89.6-90.1%) семейства Bacillaceae, но значительно удален (83.2-83.7%) от спорообразующих термоацидо-
фильных видов рода Alicyclobacillus семейства “Alicyclobacillaceae” с Г+Ц в ДНК более 60 мол. %. По рибосомальному гену уровень сходства RS34 с фотоорганотрофной анаэробной грамполо-жительной бактерией Heliobacterium chlorum (класс “Clostridia”, порядок Clostridiales, семейство “Heliobacteriaceae”) не превышает 82.0%. Именно Н. chlorum могла быть наиболее вероятным предком для сравнительно молодых спорообразующих и аспорогенных аэробных микроорганизмов порядка Bacillales, в частности, для двух кластеров гетерогенной группы неспорообразующих видов рода Exiguobacterium [Gupta, Mukhtar, Singh, 1999].
Филогенетическое положение исследуемого штамма Exiguobacterium sp. RS34 среди представителей различных родов порядка Bacillales. Дерево построено по 1335 нуклеотидам гена 16S рРНК. Алгоритм выравнивания - “neighbor-joining”.
Цифрами показана статистическая достоверность ветвления на основании “bootstrap’’-анализа 1000
- Exiguobacterium sp. RS34 (JQ966108)
99
100
0.02
100
80
97
57
51
100
Exiguobacterium homiense H1- R8 (DQ351341) г- Exiguobacterium aurantiacum DSM 6208T (DQ019166) 64L Exiguobacterium mexicanum 8N' (AM072764) p Exiguobacterium marinum TF-80T (AY594266) Exiguobacterium aestuarii TF-16T (AY594264)
- Exiguobacterium panipatensis SM1 (EF519705)
— Exiguobacterium taiwanense GI-1329 (DQ344522) Exiguobacterium profundum 10CT (AY818050)
- Exiguobacterium arabatum PTK BIOS 3 (JF758868) ggr Exiguobacterium acetylicum DSM 204161 (DQ019167)
Exiguobacterium indicum HHS 31T (AJ846291) Exiguobacterium artemiae 9 ANT (AM072763) Exiguobacterium sibiricum 255-15т (CP001022)
— Exiguobacterium oxidotoierans T-2-2T (AB105164) Exiguobacterium undae DSM 14481T (DQ019165) і Exiguobacterium antarcticum DSM 14480T (DQ019164)
99 L Exiguobacterium soli DVS3yT (AY864633)
|— Geobacillus subterraneus 34T (AF276306)
Geobacillus jurassicus DS1T (AY312404)
Geobacillus stearothermophilus IF0125501 (AB021196)
100
I Fvin
68
56
t;
100
100
56
r.
Brevibacillus parabrevis IFO 12334 (D78463)
100
100
100
Brevibacillus brevis JCM 2503 (D78457)
Brevibacillus laterosporus IAM 12465T (X57307)
----------Paenibacillus macerans IAM 12467T (AB073196)
--------------Paenibacillus polymyxa IAM 13419T (D16276)
— Bacillus saliphilus DSM 154021 (AJ493660)
— Bacillus vedderi DSM 9768T (Z48306)
— Bacillus clarkii DSM 87201 (X76444)
-------Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446т (X60742)
- Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025і (AB042057) -------Heliobacterium chlorum DSM 3682T (M11212)
100
альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%). Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. В качестве “outgroup” использована последовательность 16S рДНК типового
штамма Heliobacterium chlorum
Таким образом, согласно филогенетическому анализу исследуемый изолят из шламохранилища калийного рудника имеет не только высокий уровень сходства с галоалкалотолерантными видами кластера Е. aurantiacum - Е. aestuarii, но определенные физиологические и хемотаксономические отличия от родственных видов (табл. 1, 2). По совокупности фенотипических и генотипических признаков на данном этапе работ он определен как Exiguobacterium sp. RS34 (JQ966108).
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН № 22 «Молекулярная и клеточная биология», проект № 01200963684. Идентификация изолята RS34 на основе гена 16Sp,HHK выполнена Б.Б. Кузнецовым (при поддержке Минобрнауки РФ в ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва).
Библиографический список
Саралов А.И. и др. Arhodomonas recens sp. nov. -умеренно галофильная гаммапротеобактерия из рассолов флотационного обогащения калийных минералов//Микробиология. 2012а. Т. 81, № 5. С. 630-637.
Саралов А.И. и др. Halarchaeum solikamskense sp. nov. - термо-толерантный нейтрофильный га-лоархаеон из пенных продуктов флотационного обогащения калийных минералов // Микробиология. 20126. Т. 81, № 5. С. 638-644.
Collins M.D., Lund В.М., Farrow J.A.E., Schleifer K.H. Chemotaxonomic study of an alkalophilic bacterium, Exiguobacterium aurantiacum gen. nov., sp. nov. // J. General Microbiol. 1983. Vol. 129. P. 2037-2042.
FruhlingA. et al. Exiguobacterium undae sp. nov. and Exiguobacterium antarcticum sp. nov. // Int. J.
Syst. Evol. Microbiol. 2002. Vol. 52. P. 1171-1176.
Garrity G.M., Bell J.A., Lilburn T. The revised road map to the manual // Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. Vol. 2. The Proteobacteria, Part A. New York: Springer, 2005. P. 159-220.
Gupta R.S., Mukhtar Т., Singh B. Evolutionary relationships among photosynthetic prokaryotes (Heliobacterium chlorum, Chloroflexus aurantiacus, cyanobacteria, Chlorobium tepidum and proteobacteria): implications regarding the origin of photosynthesis // Molecular Microbiol. 1999. Vol. 32, № 5. P. 893-906.
Kim In-Gi et al. Exiguobacterium aestuarii sp. nov. and Exiguobacterium marinum sp. nov., isolated from a tidal flat of the Yellow Sea in Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. Vol. 55. P. 885-889.
Ludwig W., Klenk H.-P. Overview: a phylogenetic backbone and taxonomic framework for procariotyc systema-tics // Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. Vol. 2. The Proteobacteria, Part A. New York: Springer, 2005. P. 49-65.
Ludwig W., Schleifer K.-H., Whitman W.B. Revised road map to the phylum Firmicutes // Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. New York: Springer-Verlag, 2008. Vol. 3.
Pruesse E. et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35. P. 7188-7196.
Поступила в редакцию 05.09.2012
Exiguobacterium sp. RS34 - haloalkalitolerant facultatively anaerobic non-sporulating bacterium of Bacillales order isolated FROM sludge warehouse of potash mining E. M. Reutskikh, PhD-student; reutskix@mail.ru
A. I. Saralov, doctor of biology, professor; saralov@iegm.ru
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; (342)2808332
A non-sporulating orange pigmented haloalkalitolerant bacterium (strain RS34) was isolated from sludge warehouse waters on potash plant, mine 3 of Uralkali company (Solikamsk, Russia). According to 16S rRNA gene sequence analysis, this strain belonged to the genus Exiguobacterium family incertae sedis of Bacillales order (93.8-99.7%). Based on phenotypic, chemotaxanomic and genotypic traits, the strain RS34 should be classified at this time point as Exiguobacterium sp. RS34 (JQ966108).
Key words: haloalkalitolerant bacteria; Exiguobacterium', cellular fatty acids; 16S rRNA gene; phylogenetic analysis.
Реутских Екатерина Михайловна, аспирант
Саралов Александр Иванович, доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
